Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

이 작품에 대한 지원은 피부과, 콜로라도 대학과 콜로라도 대학의 재생 의학을위한 게이츠 센터에서 왔다 (UC) 피부 질환 센터 형태학 및 표현형 코어 (NIAMS P30 AR057212). 저자는 UC 암 센터 유동 세포 측정 공유 자원 및 지원 보조금 (NCI P30 CA046934)을 인정질량 세포계의 작동에 대한 및 흐름과 질량 세포 측정에 대한 전문가의 조언에 대한 핵심 카렌 헬름과 크리스틴 어린이에 대한 감사 기술을.

콜로라도 안슈츠 대학 의과 대학' 기관 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 설명 된 동물 실험을 승인.
1. 준비
<ol><li>금속 태그가 지정된 항체 패널을 디자인합니다. 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어(12)를 사용하고 127개의IododeoxyUridine(IdU), 164Dy(Dysprosium) 라벨이 부착된 안티 CCNB1(CYCLIN B1), 175Lu(루테리움) 인포(p)-HISTONEH3 Ser28(pHH3...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

이 백서에 설명된 프로토콜은 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 최종 결과는 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현을 위해 분석될 수 있는 KC에서 농축된 세포의 현탁액이다. 몇몇 이전 연구 결과는 인간과 마우스 피부에서 PC를 격리하는 방법을 설명했습니다16,25. 이러한 연구는 또한 유세포분석26에 대한 CS의격리를 위한 프로토콜?...

세포 주기 단계와 유전자 발현의 상관관계는 암과 같은 과형성 질환의 동물 모델 분석에 여전히 도전과제로 남아 있다. 이 도전의 일부는 증식의 마커를 가진 관심있는 단백질 (POI)의 공동 검출입니다. 증식 세포는 G1, S, G2 및 M. Ki67을 포함한 다양한 세포 주기 단계에서 발견될 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 증식 마커 중 하나이며 세포 주기의 모든 단계에서 발현된다. 그것은 광범위하게 인간과 마우스 조직 모두의 분석에사용되어왔다 1,2,3. 그러나, 다른 일반적인 증식 마커 처럼, Ki67 개별 세포 주기 단계를 분별 하지 않습니다. 보다 정밀한 접근법은 브로모데독시우리딘(BrdU)과 같은 티미딘 뉴클레오티드 유사체를 게놈(즉, S상)을적극적으로 복제하는 세포에 4,5를사용합니다. 뉴클레오티드 유사체의 사용에 대한 한 가지 단점은 분석 하기 전에 살아있는 동물에 그들을 관리 하는 필요. Ki67 및 BrdU는 항체의 사용에 의해 고정된 조직 단면도에서 일반적으로 검출됩니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 POI의 위치가 조직 아키텍처(예를 들어, 피부 표피의 기저층) 내에서 확인될 수 있다는 것입니다. 이 접근은 또한 유전자 발현에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있는 조직 해리를 요구하지 않습니다. 한 가지 단점은 OCT 동결 또는 파라핀 절편을 위한 조직의 조직 고정 또는 처리가 항체 표적(즉, 항원)을 폐색시킬 수 있다는 것이다. 항원의 검색은 전형적으로 열 또는 조직 소화를 요구합니다. 염색 강도의 정량화도 어려울 수 있습니다. 이는 염색, 단면 두께, 신호 감지 및 실험자 바이어스의 변화에 기인합니다. 또한 대부분의 일반적인 실험실 설정에서 제한된 수의 마커를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나, 새로운 멀티플렉스 염색 접근 방식은 이러한 한계를 극복할 것을 약속합니다. 예는 이미징 질량 세포 측정 및 티라 미드신호 증폭 6,7.
유세포측정은 증식 세포를 검출하는 또 다른 강력한 기술입니다. 그것은 동일 세포에 있는 마커의 다중 검출을 허용합니다 그러나 대부분의 비 조혈 세포 모형을 위한 조직 해리를 요구합니다. 증식 세포의 분석은 DNA를 결합하는 염료(예를 들어, 프로피듐 요오드화물(PI))의사용에 의해 일상적으로 수행된다 8. 유세포측정은 또한 BrdU 법인9의검출과 결합될 때 세포 주기 단계의 보다 정확한 측정을 허용한다. 강력한 접근 방식이지만 BrdU/PI 유동 세포측정은 단점이 있습니다. 위상 특이적 항체를 포함하지 않고는 G2/M 및 G0/G1 단계를 해결할 수 없습니다. 그러나, 사용될 수 있는 항체의 수는 세포 자가형광, 불소 방출의 스펙트럼 유출, 및 보상 제어의 사용에 의해 제한된다. 이 한계는 POI를 가진 세포 주기 마커의 표현을 공동 검출하기 위하여 더 도전적이고 힘든 표시합니다. 더 허구적인 접근법은 질량 세포 분석10,11을사용하는 것입니다. 이 기술은 더 좁은 검출 스펙트럼을 가진 금속 공액 항체를 사용합니다. 일단 세포가 금속 태그가 달린 항체로 염색되면 기화되고 세포 분석 시간(CyTOF) 질량 분석법에 의해 검출된 금속이 기화됩니다. 이러한 특성으로 인해 질량 세포 분석은 기존 플랫폼10,11을사용하여 >40 다른 마커의 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. 또한, 귀중한 항체를 절감하는 한편 시료 간 염색 가변성을 줄이는 금속으로 시료를 바코드화할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 질량 세포측정은 몇몇 단점이 있습니다. 비혈액 유래 세포에 대한 시판되는 금속 태그항체의 수가 제한되어 있다. 형광 DNA 염료 및 질량 세포측정의 사용에 비해 DNA 함량의 정량화는 형광 유동 세포측정에 비해 신호 검출의 감소된 동적 범위를 가지고 있다.
여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 피부로부터 새로 단리된 각질세포(KC)로부터 세포 주기 역학을 분석하고 대량 세포분석기를 사용하여 이들 세포에서 세포 주기 특정 단백질 발현을 특성화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 또한 배양된 세포와 함께 사용되거나 다른 세포 유형에 적응될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

이 프로토콜의 목표는 마우스 피부의 표피로부터 단리된 단일 세포를 사용하여 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현 변화를 검출하고 정량화하는 것이다. 7개의 중요한 단계가 있습니다: 진피에서 표피의 분리, 표피의 소화, 시스플라틴을 가진 표피 세포 집단의 염색, 견본 바코드, 세포 주기 마커 및 단백질을 위한 금속 태그가 붙은 항체를 가진 염색 관심, 질량 세포 분석에 의한 금속 태그 항체의 검출, 및 다양한 세포 주기 상에서발현의 분석. 조직학적 방법에 대한 이러한 접근법의 장점은 세포 주기의 상이한 단계에서 단일 세포에서 >40의 발현 패턴을 분석할 수 있는 가능성이다. 이 접근은 또한 조직학/화상 진찰 방법 보다는 더 정량화할 수 있는 단백질 발현의 다변량 상관 성 분석을 허용합니다. 이 프로토콜의 단점은 단일 세포의 현탁액이 필요하며, 이는 조직 섹션의 염색에 의해 제공되는 위치 정보의 손실을 초래한다는 것입니다. 이 접근법은 또한 조세포 현탁액에서 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 추가 마커의 포함을 요구할 수 있다. 이 프로토콜의 적용은 과형성 피부 질환 모델의 분석에서 분명합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 계보 특이적 항체의 첨가에 의해 특정 하위 유형의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 분석을 위해 적응될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 실험 종에서 피부 세포의 분석을 위해 적응될 수 있다.

표 1은 비병리학적 조건 하에서 성인마우스 귀 및 신생아 피부로부터의 예상 세포 수율 및 생존율을 나타낸다. 이 표에는 혼합 C57/126 배경에서 동물의 대표 데이터도 표시됩니다. 그것은 다른 균주의 피부가 유사한 세포 수율과 부채를 초래할 것으로 예상된다. 대략적인 수율은 피부의 표면적에 의존하며 신생아 피부가 더 많은 수의 세?...

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Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

이 프로토콜은 두 가지 주요 이유로 중요합니다. 제1, 사용자가 동물 모델으로부터 분리된 피부 세포의 세포 주기 상태를 확인할 수 있게 한다. 그것은 또한 우리가 세포 주기의 이산 단계에서 단백질 발현을 분석할 수 있게 합니다.세포 증식을 결정하는 이전 방법에 비해, 우리의 방법은 세포 주기에서 상이한 위상의 보다 정확한 측정을 허용하고, 우리는 또한 세포 분열의 다양한 단계에서 40 개 이상의 다른 마커를 분석 할 수 있습니다. 이렇게 하면 방법의 적용과 다재다능함이 크게 향상됩니다. 이 프로토콜은 암 연구와 세포 주기 특정 단백질 발현 패턴을 결정할 필요가 있는 질병의 그밖 모형에서 이용될 수 있습니다.또한, 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 다른 모델 유기체로 변형될 수 있다. 처음으로 사용자는 가능한 최고의 품질의 셀 준비를 얻는 데 집중해야합니다. 이를 위해서는 신선한 시약을 사용하여 실험적 피부를 적시에 처리하고, 최소한의 조직 소화 시간을 하며, 세포의 무결성과 양을 보존하기 위해 원심 분리 후 상체를 신중하게 폐기해야 합니다.먼저 원고에 설명된 대로 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어를 사용하여 금속 태그가 지정된 항체 패널을 설계합니다. 그런 다음 IdU 분말을 밀리리터 당 10 밀리그램에서 0.1 섭씨 60도에서 수산화 나트륨을 용해하여 IdU 스톡 솔루션을 준비하십시오. IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 알리코팅한 후 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에서 동결하십시오.사용 직전에 IdU 용액의 pH를 12개의 일반 염산으로 7.5로 조정하고, 폐기 된 알리쿼트에 pH 스트립으로 테스트하여 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하십시오. 2개의 파라포멀데히드 고정 솔루션을 준비하려면 10x PBS5밀리리터와 16%PFA1밀리리터를 순수한 분자등급 증류수 44밀리리터와 결합합니다. 100 밀리몰라 시스플라틴 스톡 솔루션을 준비하려면 300.5 밀리그램의 Cisplatin 파우더를 DMSO 10 밀리리터에 녹입니다.실험이 하루 이상 사용되려면 10 밀리머 시스플라틴 작업 용액을 준비하십시오. 쥐를 무게 하 고 체중의 그램 당 IdU의 0.1 밀리 그램에서 복용량을 결정. 관면 주사에 의해 IDU의 계산된 복용량을 관리하고, 세포를 수확하기 전에 2 시간 동안 기다립니다.이전에 귀 기저에 IdU로 주입된 안락사 마우스의 귀를 외과적으로 제거하기 위해 한 쌍의 외과 적 등급 가위를 사용합니다. 100mm 페트리 접시에 귀를 놓습니다. 미세한 집게를 사용하여 앞쪽을 뒤쪽 피부와 조심스럽게 분리하여 절단 영역의 중간 또는 가장자리에 포켓을 만든 다음 두 개의 피부 플랩을 분리한 다음 전방 및 후방 스킨을 모두 진행합니다.한 귀의 전방 및 후방 스킨을 12웰 컬쳐 플레이트의 한 웰에 조심스럽게 놓고, 갓 준비된 디스파스/콜라게나제 용액 1밀리리터로 채워져 피부의 피부면이 용액을 만지고 있습니다. 피부를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 소화된 귀나 신생아 껍질을 깨끗한 페트리 접시에 놓고 표피 쪽이 접시 표면에 닿습니다.집게를 사용하여 피부를 평평하게 하고 중앙에서 가장자리까지 원형 패턴으로 작업하여 진피를 표피에서 부드럽게 밀어냅니다. 집게로 가장자리에 표피를 잡고 페트리 접시 표면에서 벗겨서 부드럽게 들어 올립니다. 미리 데운 세포 분리 용액에 표피를 접시의 한 웰에 조심스럽게 놓습니다.섭씨 37도에서 5분 또는 실온에서 20분 간 배양하세요. 멸균 집게를 사용하여 표피를 사용하여 표피를 접시 바닥에 드래그하여 세포를 분리합니다. 1%FBS를 함유한 DMEM 1밀리리터를 추가하고 40마이크로미터 셀 체를 수집 튜브에 전달합니다.DMEM의 추가 2 밀리리터와 잘 헹구고 세포 현탁액에 추가합니다. 원심 분리 후 5 분 동안 120 배 g에서 조심스럽게 슈퍼 나탄을 흡인합니다. 1%FBS를 포함하는 DMEM의 1~ 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전과 같이 세포를 다시 펠릿.살아있는 세포와 죽은 세포를 결정하기 위하여 세포를 레이블을 붙이려면, 25 마이크로 몰라 시스플라틴을 포함하는 DMEM의 1 밀리리터에 있는 1-3 백만 세포를 재중단하고 1 분 동안 배양합니다. 동일한 볼륨의 FBS로 파이펫팅하여 담금질합니다. 5 분 동안 120 배 g에서 원심 분리 한 후, 희석 된 표백제를 포함하는 비커에 상체를 데칭하고, 나머지 용액을 종이 타월에 배출하기 위해 튜브를 반전시십시오.바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전에 설명한 대로 다시 원심분리기. 세포를 고치려면, 바륨 양이온이 없는 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 연속 저전력 하에서 세포를 소용돌이치고 두 x PFA 고정 버퍼 드롭 와이즈의 1 밀리리터를 추가합니다.흔들 기 플랫폼에 놓고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 동일한 조건에서 다시 원심분리기의 2 밀리리터로 세포를 세척하고 세척 단계를 반복합니다.마지막으로, 바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 신중하게 상체를 데칭합니다. 1x 고정 버퍼의 1밀리리터로 셀을 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 배양하고 원심분리를 반복합니다.셀을 세척하려면 바코드 permeabilization 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 셀 원심 분리 시 5분간 500배g의 세포 원심분리를 통해 바코드 투과화 버퍼 100마이크로리터를 추가하여 바코드를 준비하고 즉시 섞는다. 바코드 투과화 버퍼의 800 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.바코드 솔루션을 셀에 추가하고 실온에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. 5분간 500배 g의 원심분리기. 세포 염색 완충제와 원심분리기의 2밀리리터로 세포를 다시 세척합니다.다음으로, 핵 항원 염색 완충액의 1밀리리터에서 1~300만 개의 세포를 재중단하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 핵 항원 염색 충류 완충및 원심분리기의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.반복 반복 반복 된 현탁액 및 원심 분리 후, 부드러운 소용돌이와 잔류 볼륨의 세포 펠릿을 다시 중단. 셀룰러 내 항체 칵테일 50마이크로리터를 실내 온도에서 45분간 혼합하고 배양합니다. 셀 염색 버퍼 2밀리리터를 추가합니다.원심분리기는 이전 단계와 동일한 조건에서 다시 원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 셀 염색 완충제의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리기는 5분 동안 500배 g로, 재연 및 원심분리를 반복한다. 인터컬레이션 용액의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 섭씨 4도에서 1~3일 동안 보관하십시오.세포를 원심분리한 후, 동일한 조건하에서 두 밀리리터의 세포 염색 완충제, 원심분리기로 펠릿을 세척하고, 동일한 원심분리와 함께 2밀리리터의 물로 2개의 추가 세척을 수행한다. 희석 된 EQ 비드 용액으로 밀리리터 당 백만 세포의 농도로 세포 펠릿을 다시 중단 한 다음 질량 세포계에서 샘플을 실행합니다. 성인 마우스 귀와 신생아 피부에서 예상되는 세포 수율 및 생존능력이 결정됩니다.대략적인 수율은 피부의 표면적에 따라 달라집니다. 신생아 피부는 세포의 더 큰 수를 필요로 하는 실험에 대 한 더 나은 선택. 바코드 질량 세포측정 데이터의 정규화 및 절충볼루션 후, 그대로, 단일 및 실행 가능한 셀을 선택하는 기본 게이팅 전략이 표시됩니다.실행 가능한 세포의 백분율은 염색하기 전에 세포의 품질 또는 상태를 나타낼 수 있습니다. 배양된 암종 세포와 분리된 마우스 이어 셀 간의 생존가능성에 대한 차이도 나타난다. 실행 가능한 세포는 조혈 세포를 제외하기 위하여 CD45 대 이벤트 길이에 문지였습니다.리니지 마커의 포함은 다른 세포 주기 단계에 관심있는 세포 집단의 선택을 허용합니다. 기본 세포 주기 프로파일은 형광계 유동 세포측정에서 BRdU 대 PI의 검출에 의해 얻어진다. 그러나, 질량 세포종을 가진 그밖 증식 마커의 포함은, 세포 주기 단계의 더 정확한 확인을 허용합니다.이러한 접근법에 따라, 세포 주기 프로파일은 동일한 실험에서 CD45 음성 대 CD45 양성 세포에 대한 프로파일과 같은 상이한 세포 유형 또는 실험 조건에 대해 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, G-1 단계에서 EGFR 및 mTOR PI3K 신호 경로를 정의하는 마커의 분석은, 파란색으로 표시된 주황색 및 CD45 양성 세포에 도시된 CD45 음성 세포에서 유사한 발현 프로파일을 드러냈다. 질량 세포측정은 고품질 의 세포를 많이 필요로한다.사용자가 희귀 세포 집단에 관심이 있는 경우 더 많은 셀 수가 필요할 수 있습니다. 고립 된 살아있는 세포는 DNA 또는 RNA 분석, 생화학 연구에 사용될 수 있거나 대량 세포 측정을 위한 고정 및 염색 전에 조직 배양에 사용될 수 있다. 사용자는 파라포름알데히드, 염산 또는 수산화나트륨과 함께 작업할 때 필요한 경우 개인 보호 장비와 안전 캐비닛을 사용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

연구

발생학

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...