Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Støtte for dette arbeidet kom fra Department of Dermatology, den Gates Center for regenererende medisin ved University of Colorado og University of Colorado (UC) Skin sykdom Center morfologi og bestemmelse av fenotype Cores (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne erkjenner UC Cancer Center Flow flowcytometri delt ressurs og støtte stipend (NCI P30 CA046934) for driften av massen flowcytometer og er takknemlige for Karen Helm og Christine Childs i kjernen for deres ekspertråd om flyt og masse analytiske Teknikker.

Universitetet i Colorado Anschutz Medical campus ' institusjonelle Animal Care og use Committee godkjent dyret eksperimenter beskrevet i denne protokollen.
1. forberedelser
<ol><li>Utform et metall merket antistoff panel. Bruk den gratis online panel design programvare 12 og inkluderer 127IododeoxyUridine (IdU), 164dy (dysprosium) merket anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) fosfat (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), og 150</...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

Protokollen som er skissert i denne utredningen kan gjennomføres i ca 8 h. Sluttresultatet er en suspensjon av celler beriket i KCs som kan analyseres for protein uttrykk i en celle syklus-avhengig måte. Flere tidligere studier har skissert metoder for å isolere KCs fra menneske og mus Skin16,25. Disse studiene inkluderer også protokoller for isolering av KCs for Flow flowcytometri26. Imidlertid har en detaljert protokoll ikke blitt ti...

Korrelasjon av genuttrykk med celle syklus stadier er fortsatt en utfordring i analysen av dyremodeller av hyperplastisk sykdommer som kreft. En del av denne utfordringen er co-deteksjon av proteiner av interesse (POI) med markører for spredning. Proliferativ celler kan finnes i ulike celle syklus faser inkludert G1, S, G2, og M. Ki67 er en av de mest brukte markører for spredning og uttrykkes i alle faser av cellesyklusen. Det har vært mye brukt i analysen av både menneskelig og mus vev1,2,3. Men som andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skjelne enkelte celle syklus faser. En mer presis tilnærming bruker inkorporering av tymidin nukleotid analogs som Bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som er aktivt replikere sine Genova (dvs. S-fase)4,5. En ulempe for bruk av nukleotid analogs er behovet for å administrere dem til å leve dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU blir ofte oppdaget på faste vevs deler ved bruk av antistoffer. En fordel med denne tilnærmingen er at plasseringen av POI kan fastslås innenfor vev arkitekturen (f. eks basal laget av huden epidermis). Denne tilnærmingen krever heller ikke vevs dissosiasjon som kan føre til endringer i genuttrykk. En ulempe er at vevet fiksering eller behandling av vev for OCT frosset eller para fin snitting kan tette antistoff mål (dvs. antigener). Henting av antigener krever vanligvis varme eller vevs fordøyelsen. Kvantifisering av farge intensitet kan også være utfordrende. Dette skyldes variasjoner i farging, snitt tykkelse, signal deteksjon og eksperimentator bias. Videre kan et begrenset antall markører oppdages samtidig i de fleste typiske laboratorie oppsett. Likevel, nyere multiplex flekker tilnærminger lover å overvinne disse begrensningene; Eksempler er Imaging Mass flowcytometri og Tyramide signal forsterkning6,7.
Flow flowcytometri er en annen kraftig teknologi for å oppdage voksende celler. Det gjør det mulig for multiplex deteksjon av markører i de samme cellene, men krever vev dissosiasjon for de fleste ikke-blodkreft celletyper. Analyse av voksende celler blir rutinemessig gjort ved bruk av fargestoffer som binder DNA (f. eks, Propidium iodide (PI))8. Flow flowcytometri tillater også en mer presis bestemmelse av celle syklus faser når kombinert med påvisning av BrdU innlemmelse9. Selv om en kraftig tilnærming, BrdU/PI Flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til å løse de G2/M og G0/G1 fasene uten inkludering av fase-spesifikke antistoffer. Imidlertid er antall antistoffer som kan brukes begrenset av mobilnettet autofluorescence, Spectral smitteeffekter av fluoroforen utslipp, og bruk av kompensasjon kontroller. Denne begrensningen markes det mer utfordrende og arbeidskrevende å co-oppdage uttrykk for celle syklus markører med POI. En mer facile tilnærming er å bruke masse flowcytometri10,11. Denne teknologien bruker metall bøyd antistoffer som har et smalere gjenkjennings spektrum. Når cellene er farget med metall-merket antistoffer, de er fordampet, og metaller oppdages av flowcytometri tid-av-fly (CyTOF) masse massespektrometri. På grunn av disse egenskapene muliggjør masse flowcytometri den multiplex deteksjon av > 40 forskjellige markører ved hjelp av eksisterende plattformer10,11. I tillegg er det mulig å få strekkode prøver med metaller som resulterer i besparelser av dyrebare antistoffer, samtidig som fargevariasjonen i prøve-til-prøver reduseres. På den annen side, masse flowcytometri har flere ulemper. Det er et begrenset antall kommersielt tilgjengelige metall-kodede antistoffer for ikke-blod avledet celler. Kvantifisering av DNA-innhold er mindre følsom i forhold til bruk av fluorescerende DNA fargestoffer og masse flowcytometri har et redusert dynamisk område av signal deteksjon i forhold til fluorescens flyt flowcytometri.
Protokollen beskrevet her var utformet for å analysere celle syklus dynamikk fra nylig isolerte keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle syklus bestemt protein uttrykk i disse cellene ved hjelp av masse flowcytometri. Denne protokollen kan også brukes med kulturperler celler eller tilpasset andre celletyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

Målet med denne protokollen er å oppdage og kvantifisere protein uttrykk endringer i en celle syklus avhengig måte ved hjelp av enkeltceller isolert fra epidermis av musen huden. Det er sju viktige trinn: separasjon av epidermis fra dermis, fordøyelse av epidermis, farging av epidermal celle populasjoner med Cisplatin, sample barcoding, farging med metall merket antistoffer for celle syklus markører og proteiner av interesse, påvisning av metall-kodede antistoffer av masse flowcytometri, og analysen av uttrykket i de ulike celle syklus faser. Fordelen med denne tilnærmingen over histologiske metoder er potensialet til analysen uttrykket mønster av > 40 forskjellige markører i en enkelt celle i ulike faser av celle syklus. Denne tilnærmingen gir også mulighet for multivariabel korrelasjon analyse av protein uttrykk som er mer målbare enn histologiske/Imaging metoder. Ulempen med denne protokollen er at en suspensjon av enkeltceller er nødvendig, noe som resulterer i tap av stedsinformasjon gitt av farging av vev seksjoner. Denne tilnærmingen kan også kreve inkludering av ekstra markører for å identifisere ulike celletyper i råolje celle suspensjoner. Anvendelsen av denne protokollen er tydelig i analysen av hyperplastisk hudsykdom modeller. Videre kan denne protokollen tilpasses for analyse av spesifikke under type celler (for eksempel stamceller) ved tilsetning av avstamning-spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan også tilpasses for analyse av hudceller i andre eksperimentelle arter.

Tabell 1 viser forventet celle kapasitet og levedyktighet fra voksen mus øret (figur 1) og nyfødt hud under ikke-patologiske tilstander. Tabellen viser også representative data for dyr fra en blandet C57/126 bakgrunn. Det er forventet at huden av andre stammer vil resultere i tilsvarende celle gir og viabilities. Den omtrentlige avkastningen er avhengig av hudens overflateareal og indikerer at nyfødt hud vil være et bedre valg for eksper...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri

Denne protokollen beskriver hvordan å isolere huden keratinocytter fra musemodeller, å beis med metall-kodede antistoffer, og å analysere fargede celler ved masse flowcytometri for å profilen uttrykket mønster av proteiner av interesse i de ulike celle syklus faser.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Denne protokollen er viktig av to hovedgrunner. Nummer én, det tillater en bruker å være i stand til å bestemme celle syklus tilstander av hudceller som har blitt isolert fra en dyremodell. Det tillater oss også å kunne analysere proteinuttrykk i de diskrete fasene av cellesyklusen.Sammenlignet med tidligere metoder for å bestemme cellespredning, tillater vår metode en mer presis bestemmelse av de forskjellige fasene i cellesyklusen, og vi kan også analysere større enn 40 forskjellige markører i de ulike stadiene av celledeling. Dette forbedrer i stor grad anvendelsen og allsidigheten til metoden. Denne protokollen kan brukes i kreftforskning og i alle andre typer sykdommer der det er behov for å bestemme cellesyklusspesifikke proteinuttrykksmønstre.I tillegg kan denne protokollen endres til andre celletyper, og i andre modellorganismer. Første gang brukeren bør fokusere på å få best mulig kvalitet celle forberedelse mulig. Dette krever be gangsriktig behandling av eksperimentell hud ved hjelp av friske reagenser, minimal vevsfordøyelsestid og forsiktig avhending av det overnaturante etter sentrifugering for å bevare integriteten og mengden celler.Til å begynne med, designe et metallmerket antistoffpanel ved hjelp av en gratis online paneldesignprogramvare, som beskrevet i manuskriptet. Deretter forberede en IdU lagerløsning ved å oppløse IdU pulver på 10 milligram per milliliter i 0,1 normal natriumhydroksid ved 60 grader Celsius. Etter å ha aliquoting IdU lagerløsning i mikrocentrifuge rør, fryse dem på minus 20 grader Celsius for langsiktig lagring.Umiddelbart før bruk, juster pH av IdU-oppløsningen til 7,5 med 12 normal saltsyre, og test med en pH-stripe på en kaste aliquot for å sikre at oppløsningen er på pH 7.5. For å forberede en to x paraformaldehyd festeløsning, kombinere fem milliliter på 10 x PBS og en milliliter på 16% PFA med 44 milliliter rent molekylært destillert vann. For å forberede 100 millimolar cisplatin lagerløsning, oppløse 300,5 milligram cisplatin pulver i 10 milliliter DMSO.For eksperimenter som skal brukes over en dag, forberede en 10 millimolar cisplatin arbeidsløsning. Vei mus og deretter bestemme en dose på 0,1 milligram IdU per gram kroppsvekt. Administrer den beregnede dosen av IDU ved en intraperitoneal injeksjon, og vent i to timer før høsting av celler.Bruk et par kirurgiske saks til kirurgisk fjerning av øret til den eutaniserte musen som tidligere ble injisert med IdU ved foten av øret. Plasser øret på en tørr 100 millimeter petriskål. Separer fremre fra den bakre huden forsiktig ved hjelp av fine tang for å lage en lomme i midten eller kanten av det kuttede området, trekk deretter de to hudklaffene fra hverandre, og fortsett med både fremre og bakre skinn.Legg forsiktig de fremre og bakre skinnene til ett øre i en brønn av en 12-brønns kulturplate, fylt med en milliliter nylaget dispase / collagenaseløsning, med dermasiden av huden som berører løsningen. Inkuber ved 37 grader Celsius i en time for å fordøye huden. Legg det fordøyde øret eller neonatal hud i en ren petriskål med epidermis-siden som berører overflaten av parabolen.Bruk tang, flat ut huden og skyv forsiktig dermis av epidermis ved å arbeide fra midten til kantene i et sirkulært mønster. Med tang, ta epidermis på kantene og forsiktig løfte den av ved å peeling den av overflaten av Petri parabolen. Plasser epidermis forsiktig på forvarmet celleavløsning i en brønn av en tallerken.Inkuber i fem minutter ved 37 grader Celsius eller 20 minutter ved romtemperatur. Bruk sterile tang for å gripe epidermis og skrubbe ved å dra epidermis mot bunnen av parabolen for å dissosiere celler. Tilsett en milliliter DMEM som inneholder 1% FBS, og passere gjennom en 40 mikrometer celle sil inn i en samling tube.Skyll godt med ytterligere to milliliter DMEM og legg til cellefjæringen. Etter sentrifugering på 120 ganger g i fem minutter, forsiktig aspirere supernatant. Resuspend cellen pellet i en til to milliliter av DMEM inneholder 1% FBS, og pellet cellene igjen som tidligere.For å merke celler for å bestemme levende og døde celler, gjenbruke en til tre millioner celler i en milliliter DMEM som inneholder 25 mikromolar cisplatin og inkubere i ett minutt. Slukke ved å pipettere med like mange FBS. Etter sentrifugering på 120 ganger g i fem minutter, dekanter supernatanten i et beger som inneholder fortynnet blekemiddel, og inverter rørene for å drenere den gjenværende løsningen på et papirhåndkle.Resuspend cellepellet i to milliliter barium kation-fri PBS, og sentrifuge dem igjen som tidligere beskrevet. For å fikse cellene, resuspend cellen pellet i en milliliter barium kation-fri PBS. Vortex cellene under kontinuerlig lav effekt og legg til en milliliter av de to x PFA fiksering buffer drop-wise.Plasser på en gyngeplattform og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Etter sentrifugering på 500 ganger g i fem minutter, forsiktig dekantere supernatant. Vask cellene med to milliliter barium kationfri PBS, sentrifuge igjen under samme forhold, og gjenta vasketrinnet.Til slutt, resuspend pellet i to milliliter barium kation-fri PBS. Sentrifuger cellene ved 500 ganger g i fem minutter og dekanter forsiktig overnatanten. Resuspend cellene i en milliliter av en x fiksering buffer, og inkubere ved romtemperatur i 10 minutter og gjenta sentrifugering.For å vaske cellene, legg til en milliliter strekkodepermeabiliseringsbuffer. Under cellesentrigering på 500 ganger g i fem minutter, forberede strekkoder ved å legge til 100 mikroliter strekkode permeabilisering buffer til dem, og bland umiddelbart. Resuspend cellepellet i 800 mikroliter strekkode permeabilisering buffer.Legg strekkodeløsning til cellene, bland og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Sentrifuge ved 500 ganger g i fem minutter. Vask celler i to milliliter cellefarging buffer og sentrifuge igjen.Deretter bruker du en til tre millioner celler i en milliliter kjernefysisk antigenfargingsbuffer arbeidsløsning, og inkuberer ved romtemperatur i 30 minutter. Etter sentrifugering på 500 ganger g i fem minutter, forsiktig dekantere supernatant. Resuspend cellene i en milliliter kjernefysisk antigen farging permeabilisering buffer og sentrifuge igjen.Etter gjentatt gjenfusjon og sentrifugering, gjenbruke cellepellet i gjenværende volum med mild vortexing. Tilsett 50 mikroliter intracellulær antistoffcocktail, bland og inkuber ved romtemperatur i 45 minutter. Legg til to milliliter cellefargingsbuffer.Sentrifuge igjen under samme forhold som i forrige trinn, og fjern supernatant. Resuspend pellet i to milliliter cellefarging buffer, sentrifuge på 500 ganger g i fem minutter, og gjenta resuspending og sentrifugering. Resuspend cellene i en milliliter intercalation løsning, og lagre i en til tre dager på fire grader Celsius.Etter å ha sentrifugert cellene igjen, vask pelleten med to milliliter cellefargingsbuffer, sentrifuge under samme forhold, og utfør to ekstra vasker med to milliliter vann, med samme sentrifugering. Resuspend cellepellet i en konsentrasjon av en million celler per milliliter med fortynnet EQ perle løsning, og deretter kjøre prøvene på masse cytometer. Forventede celleutbytter og levedyktighet fra voksenmuseøre og neonatal hud bestemmes.Det omtrentlige utbyttet avhenger av overflaten av huden. Neonatal hud er et bedre valg for eksperimenter som krever større antall celler. Den grunnleggende gating strategien for å velge for intakte, enkle og levedyktige celler, etter normalisering og overføring av strekkodede massecytometridata, vises.Prosentandelen av levedyktige celler kan være et tegn på kvaliteten eller tilstanden til cellene før farging. Forskjeller i levedyktighet mellom kultiverte karsinomceller versus isolerte museøreceller vises også. Levedyktige celler ble inngjerdet på hendelseslengde versus CD45 for å utelukke hematopoetiske celler.Inkludering av avstamning markører gjør det mulig for valg av cellepopulasjoner av interesse i ulike celle syklus faser. Den grunnleggende cellesyklusprofilen oppnås ved påvisning av BrdU versus PI i fluorescerende basert strømningscytometri. Men inkludering av andre spredningsmarkører med massecytometri, tillater en mer presis identifisering av cellesyklusfaser.Etter denne tilnærmingen kan cellesyklusprofiler konstrueres for ulike celletyper eller eksperimentelle forhold, for eksempel profilene for CD45 negative versus CD45-positive celler fra samme eksperiment. I et annet eksempel viste analyse av markører som definerer EGFR- og mTOR PI3K-signalbanene i G-one-fasen lignende uttrykksprofiler i CD45-negative celler, vist i oransje og CD45-positive celler, vist i blått. Massecytometri krever mange celler av høy kvalitet.Hvis en bruker er interessert i en sjelden cellepopulasjon, kan det være behov for høyere antall celler. Isolerte levende celler kan brukes til DNA- eller RNA-analyse, biokjemiske studier, eller kan brukes i vevskultur før fiksering og farging for massecytometri. Brukeren bør bruke personlig verneutstyr og et sikkerhetsskap når det er nødvendig, når du arbeider med paraformaldehyd, saltsyre eller natriumhydroksid.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypiske Co-kultur Modell Støtte Medullary Thymus- epitelcelleproliferasjon, Differensiering og Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering av genmodifiserte organotypiske Skin kulturer Bruke devitalized Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Step-spesifikk Sortering av Musespermatider ved flowcytometrisystemer

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolere hårsekken stamceller og epidermal Keratinocytter fra Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...