Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

O apoio para este trabalho veio do departamento de Dermatologia, o centro de Gates para medicina regenerativa da Universidade do Colorado e da Universidade do Colorado (UC) pele Disease Center morfologia e núcleos de fenotipagem (NIAMS p30 AR057212). Os autores reconhecem o recurso compartilhado da citometria de fluxo do centro do cancro UC e a concessão da sustentação (NCI p30 CA046934) para a operação do citômetro maciço e são gratos para Karen Helm e Christine Childs no núcleo para seu conselho perito no fluxo e na massa cytometric do Técnicas.

A Universidade de Colorado Anschutz Medical campus ' institucional animal Care e use Committee aprovou as experiências animais descritas neste protocolo.
1. os preparativos
<ol><li>Projete um painel metal-etiquetado do anticorpo. Use o software de design de painel online gratuito12 e inclua 127iododeoxyuridine (IdU), 164DY (DYSPROSIUM) ROTULADO como CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) e <su...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

O protocolo esboçado neste papel pode ser terminado em aproximadamente 8 h. O resultado final é uma suspensão de células enriquecidas em KCs que podem ser analisadas para a expressão protéica de forma dependente do ciclo celular. Vários estudos anteriores têm delineado métodos para isolar KCS da pele humana e do rato16,25. Esses estudos também incluem protocolos para o isolamento de KCs para citometria de fluxo26. Entretanto, um ...

A correlação da expressão gênica com os estágios do ciclo celular continua sendo um desafio na análise de modelos animais de doenças hiperplásicas como o câncer. Parte deste desafio é a codetecção de proteínas de interesse (POI) com marcadores de proliferação. Células proliferativas podem ser encontradas em várias fases do ciclo celular, incluindo G1, S, G2 e M. o 67 é um dos marcadores mais comumente usados de proliferação e é expressa em todas as fases do ciclo celular. Tem sido amplamente utilizado na análise dos tecidos humanos e do camundongo1,2,3. No entanto, como outros marcadores de proliferação geral, o 67 não discernir as fases individuais do ciclo celular. Uma aproximação mais precisa usa a incorporação de análogos do nucleotide do timidina como bromodeoxyuridine (BrdU) em pilhas que estão replicando ativamente seu genoma (isto é, S-fase)4,5. Uma desvantagem para o uso de análogos de nucleotídeo é a necessidade de administrá-los a animais vivos horas antes da análise. O 67 e o BrdU são comumente detectados em seções de tecidos fixos pelo uso de anticorpos. Uma vantagem desta aproximação é que a posição dos POIs pode ser verificada dentro da arquitetura do tecido (por exemplo, a camada básica de epiderme da pele). Esta aproximação igualmente não exige a dissociação do tecido que pode conduzir às mudanças na expressão de Gene. Uma desvantagem é que a fixação do tecido ou o processamento do tecido para OCT congelado ou corte de parafina podem oclusos alvos de anticorpos (ou seja, antígenos). A recuperação de antígenos normalmente requer digestão de calor ou tecido. A quantificação das intensidades de coloração também pode ser desafiadora. Isto é devido às variações na mancha, na espessura de seção, na deteção do sinal, e no viés do experimentador. Além disso, um número limitado de marcadores pode ser detectado simultaneamente na maioria das configurações de laboratório típicas. No entanto, novas abordagens de coloração multiplex prometem superar essas limitações; exemplos são citometria de massa por imagem e amplificação de sinaldetiramida6,7.
A citometria de fluxo é outra tecnologia poderosa para detectar células proliferantes. Permite a deteção multiplex dos marcadores nas mesmas pilhas mas exige a dissociação do tecido para a maioria de tipos não-hematopoietic da pilha. A análise de células proliferantes é feita rotineiramente pelo uso de corantes que ligam o DNA (por exemplo, iodeto de Propiídio (PI))8. A citometria de fluxo também permite uma determinação mais precisa das fases do ciclo celular quando associada à detecção da incorporação de BrdU9. Embora uma abordagem poderosa, a citometria de fluxo de BrdU/PI tem suas desvantagens. Não é possível resolver as fases G2/M e G0/G1 sem a inclusão de anticorpos específicos da fase. No entanto, o número de anticorpos que podem ser utilizados é limitado por autofluorescência celular, derrame espectral de emissões de fluoróforo, e o uso de controles de compensação. Essa limitação a marca mais desafiadora e trabalhosa para codetectar a expressão de marcadores de ciclo celular com pis. Uma aproximação mais facile é usar a citometria maciça10,11. Esta tecnologia usa anticorpos conjugados metálicos que têm um espectro de detecção mais estreito. Uma vez que as pilhas são manchadas com os anticorpos metal-etiquetados, são vaporizado, e os metais detectados pela espectrometria maciça do tempo--vôo da citometria (CyTOF). Devido a essas propriedades, a citometria de massa possibilita a detecção multiplex de > 40 marcadores diferentes utilizando as plataformas existentes10,11. Além disso, é possível amostras de código de barras com metais que resultam na poupança de anticorpos preciosos, reduzindo a variabilidade da amostra para a amostra de coloração. Por outro lado, a citometria de massas tem várias desvantagens. Há um número limitado de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis para as pilhas não derivadas do sangue. A quantificação do conteúdo de DNA é menos sensível em comparação com o uso de corantes fluorescentes de DNA e a citometria de massa tem uma faixa dinâmica reduzida de detecção de sinal em comparação com a citometria de fluxo de fluorescência.
O protocolo descrito aqui foi projetado analisar a dinâmica do ciclo de pilha dos queratinócitos recentemente isolados (KCS) da pele do rato e caracterizar a expressão específica da proteína do ciclo de pilha nestas pilhas usando a citometria maciça. Este protocolo também pode ser usado com células cultivadas ou adaptado para outros tipos de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

O objetivo deste protocolo é detectar e quantificar mudanças da expressão da proteína em uma maneira ciclo-dependente da pilha usando únicas pilhas isoladas da epiderme da pele do rato. Há sete etapas importantes: separação da epiderme da derme, digestão da epiderme, coloração das populações de células epidérmicas com cisplatina, amostra de Barcoding, coloração com anticorpos marcados com metal para marcadores de ciclo celular e proteínas de interesse, deteção de anticorpos metal-etiquetados pela citometria maciça, e a análise da expressão nas várias fases do ciclo de pilha. A vantagem desta aproximação sobre métodos histológicos é o potencial para ensaiar o teste padrão da expressão de > 40 marcadores diferentes em uma única pilha em fases diferentes do ciclo da pilha. Essa abordagem também permite a análise de correlação multivariada da expressão protéica que é mais quantificável do que os métodos histológicos/de imagem. A desvantagem deste protocolo é que uma suspensão de células individuais é necessária, o que resulta na perda de informações de localização fornecidas pela coloração de seções de tecido. Essa abordagem também pode requerer a inclusão de marcadores adicionais para identificar diferentes tipos de células em suspensões de células brutas. A aplicação deste protocolo é evidente na análise de modelos hyperplastic da doença de pele. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise do subtipo específico de pilhas (por exemplo, pilhas de haste) pela adição de anticorpos linhagem-específicos. Este protocolo também pode ser adaptado para a análise de células cutâneas em outras espécies experimentais.

A tabela 1 mostra os rendimentos e a viabilidade celulares esperados da orelha de camundongo adulto (Figura 1) e da pele neonatal em condições não patológicas. A tabela também mostra dados representativos de animais de um fundo misto C57/126. Espera-se que a pele de outras cepas resultaria em rendimentos de células semelhantes e viabilidades. O rendimento aproximado é dependente da área superficial da pele e indica que a pele neonatal...

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Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Este protocolo é significativo por duas razões principais. Número um, permite que o usuário seja capaz de determinar os estados do ciclo celular das células da pele que foram isoladas de um modelo animal. Também nos permite ser capazes de analisar a expressão proteica nas fases discretas do ciclo celular.Em comparação com os métodos anteriores de determinação da proliferação celular, nosso método permite uma determinação mais precisa das diferentes fases do ciclo celular, e também podemos analisar mais de 40 marcadores diferentes nos vários estágios da divisão celular. Isso melhora muito a aplicação e versatilidade do método. Este protocolo pode ser usado em pesquisas sobre câncer e em qualquer outro tipo de doença onde há a necessidade de determinar padrões específicos de expressão de proteínas do ciclo celular.Além disso, este protocolo pode ser modificado para outros tipos de células, e em outros organismos modelo. A primeira vez que o usuário deve se concentrar em obter a melhor preparação celular de qualidade possível. Isso requer o processamento oportuno da pele experimental usando reagentes frescos, tempo mínimo de digestão tecidual e eliminação cuidadosa do supernacante após centrifugação para preservar a integridade e quantidade de células.Para começar, projete um painel de anticorpos com etiqueta metálica usando um software gratuito de design de painel on-line, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, prepare uma solução de estoque de IdU dissolvendo o pó de IdU a 10 miligramas por mililitro em 0,1 hidróxido de sódio normal a 60 graus Celsius. Depois de aliquor a solução de estoque de IdU em tubos de microcentrifuuge, congele-os a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.Imediatamente antes do uso, ajuste o pH da solução de IdU para 7,5 com 12 ácidos clorídricos normais e teste com uma tira de pH em uma alíquota de descarte para garantir que a solução esteja em pH 7.5. Para preparar uma solução de fixação de dois x paraformaldeído, combine cinco mililitros de 10 x PBS e um mililitro de 16% PFA com 44 mililitros de água destilada de grau molecular puro. Para preparar a solução de estoque de cisplatina de 100 mililitros, dissolva 300,5 miligramas de pó de cisplatina em 10 mililitros de DMSO.Para que os experimentos sejam usados ao longo de um dia, prepare uma solução de trabalho cisplatina de 10 mililitros. Pese camundongos e, em seguida, determine uma dose a 0,1 miligramas de IdU por grama de peso corporal. Administre a dose calculada de IDU por uma injeção intraperitoneal, e espere duas horas antes de colher células.Use um par de tesouras de grau cirúrgico para remover cirurgicamente a orelha do rato eutanizado previamente injetado com IdU na base da orelha. Coloque a orelha em uma placa de Petri seca de 100 milímetros. Separe cuidadosamente o anterior da pele posterior usando fórceps finos para criar um bolso no meio ou na borda da área de corte, em seguida, puxe os dois retalhos de pele separados, e prossiga com as peles anterior e posterior.Coloque cuidadosamente as peles anteriores e posteriores de uma orelha em um poço de uma placa de cultura de 12 poços, preenchida com um mililitro de solução de dispase/colagenase recém-preparada, com o lado derma da pele tocando a solução. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora para digerir a pele. Coloque a orelha digerida ou a pele neonatal em uma placa de Petri limpa com o lado da epiderme tocando a superfície do prato.Usando fórceps, achate a pele e deslize suavemente a derme da epiderme trabalhando do centro para as bordas em um padrão circular. Com fórceps, pegue a epiderme nas bordas e retire-a suavemente, retirando-a da superfície da placa de Petri. Coloque cuidadosamente a epiderme na solução de desprendimento celular pré-aquecida em um poço de uma placa.Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius ou 20 minutos em temperatura ambiente. Use fórceps estéreis para agarrar a epiderme e esfregar arrastando a epiderme contra o fundo do prato para dissociar as células. Adicione um mililitro de DMEM contendo 1%FBS e passe por uma peneira de célula de 40 micrômetros em um tubo de coleta.Enxágüe bem com mais dois mililitros de DMEM e adicione à suspensão da célula. Depois de centrifugar a 120 vezes g por cinco minutos, aspire cuidadosamente o supernante. Resuspenha a pelota celular em um a dois mililitros de DMEM contendo 1%FBS, e pelotar as células novamente como anteriormente.Para rotular células para determinar células vivas e mortas, resuspenque de uma a três milhões de células em um mililitro de DMEM contendo 25 cisplatina micromolares e incubar por um minuto. Sacie por pipetação com um volume igual de FBS. Depois de centrifugar a 120 vezes g por cinco minutos, decante o sobrenante em um béquer contendo alvejante diluído, e inverta os tubos para drenar a solução restante em uma toalha de papel.Resuspend a pelota celular em dois mililitros de PBS sem cártio de bário, e centrifuá-los novamente como descrito anteriormente. Para consertar as células, resuspenja a pelota celular em um mililitro de PBS livre de cátio de bário. Vórtice as células sob baixa potência contínua e adicionam um mililitro do buffer de fixação de dois x PFA em termos de queda.Coloque em uma plataforma de balanço e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois de centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos, decante cuidadosamente o supernante. Lave as células com dois mililitros de PBS sem cárpio, centrífuga novamente sob as mesmas condições e repita a etapa de lavagem.Finalmente, resuspense a pelota em dois mililitros de PBS sem cátio de bário. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos e decantar cuidadosamente o supernante. Resuspenda as células em um mililitro de um tampão de fixação x, e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e repetir a centrifugação.Para lavar as células, adicione um mililitro de tampão de permeabilização de código de barras. Durante a centrifugação celular a 500 vezes g por cinco minutos, prepare os códigos de barras adicionando 100 microliters de tampão de permeabilização de código de barras a eles e misture imediatamente. Resuspende a pelota celular em 800 microliters de tampão de permeabilização de código de barras.Adicione a solução de código de barras às células, misture e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos. Lave células em dois mililitros de tampão de coloração celular e centrífuga novamente.Em seguida, resuspende de um a três milhões de células em um mililitro de solução de trabalho de tampão de manchas de antígeno nuclear, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos, decante cuidadosamente o supernante. Resuspend as células em um mililitro de tampão de permeabilização de antígeno nuclear e centrífuga novamente.Após repetir a ressuspensão e centrifugação, resuspense a pelota celular no volume residual com vórtice suave. Adicione 50 microliters de coquetel de anticorpos intracelulares, misture e incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Adicione dois mililitros de tampão de coloração celular.Centrifugar novamente sob as mesmas condições da etapa anterior, e remover o supernante. Resuspenda a pelota em dois mililitros de tampão de coloração celular, centrífuga a 500 vezes g por cinco minutos, e repita a resuspending e centrifugação. Resuspenque as células em um mililitro de solução de intercalação, e armazene por um a três dias a quatro graus Celsius.Depois de centrifugar as células novamente, lave a pelota com dois mililitros de tampão de coloração celular, centrífuga sob as mesmas condições, e realize duas lavagens adicionais com dois mililitros de água, com a mesma centrifugação. Resuspend a pelota celular a uma concentração de um milhão de células por mililitro com solução de contas EQ diluída, e, em seguida, executar as amostras no cítmetro de massa. São determinados rendimentos de células esperadas e viabilidade da orelha do camundongo adulto e da pele neonatal.O rendimento aproximado depende da superfície da pele. A pele neonatal é uma escolha melhor para experimentos que requerem um número maior de células. A estratégia básica de gating para selecionar para células intactas, únicas e viáveis, após a normalização e a desconvolução de dados de citometria de massa em código de barras, é mostrada.A porcentagem de células viáveis pode ser indicativa da qualidade ou condição das células antes da coloração. Diferenças na viabilidade entre células de carcinoma cultivadas versus célulasuriculares isoladas do rato também são mostradas. Células viáveis foram fechadas no comprimento do evento versus CD45 para excluir células hematopoiéticas.A inclusão de marcadores de linhagem permite a seleção de populações celulares de interesse em diferentes fases do ciclo celular. O perfil básico do ciclo celular é obtido pela detecção de BrdU versus PI em citometria de fluxo baseada em fluorescente. No entanto, a inclusão de outros marcadores de proliferação com citometria em massa, permite uma identificação mais precisa das fases do ciclo celular.Seguindo essa abordagem, os perfis de ciclo celular podem ser construídos para diferentes tipos de células ou condições experimentais, como os perfis de células negativas cd45 versus CD45 do mesmo experimento. Em outro exemplo, a análise de marcadores que definem as vias de sinalização EGFR e mTOR PI3K na fase G-one, revelou perfis de expressão semelhantes em células negativas CD45, mostrados em laranja, e células positivas CD45, mostrados em azul. A citometria em massa requer muitas células de alta qualidade.Se um usuário está interessado em uma população de células raras, um número maior de células pode ser necessário. Células vivas isoladas podem ser usadas para análise de DNA ou RNA, estudos bioquímicos, ou podem ser usadas na cultura tecidual antes da fixação e coloração para citometria em massa. O usuário deve usar equipamentos de proteção individual e um gabinete de segurança quando necessário, quando necessário, ao trabalhar com paraformaldeído, ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...