Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Stöd för detta arbete kom från Institutionen för dermatologi, Gates Center for regenerativ medicin vid University of Colorado och University of Colorado (UC) hudsjukdom Center morfologi och fenotypning kärnor (NIAMS P30 AR057212). Författarna erkänner UC Cancer Center Flow cytometry delad resurs och stöd bidrag (NCI P30 CA046934) för driften av massan flödescytometerns och är tacksamma för Karen Helm och Christine Childs i centrum för deras expertråd om flöde och massa kors Tekniker.

University of Colorado Anschutz Medical Campus ' institutionella djuromsorg och användning kommittén godkände djur experiment som beskrivs i detta protokoll.
1. förberedelser
<ol><li>Designa en metall-märkt antikropp panel. Använd gratis online Panel Design Software12 och inkluderar 127iododeoxyuridine (IDU), 164dy (dysprosium) märkt anti-CCNB1 (Cyclin B1), 175Lu (Lutetium) ämnesomsättningphosphoen (p)-HISTONEH3Ser28</sup...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs i detta dokument kan fyllas i ca 8 h. Slutresultatet är en suspension av celler berikade i KCs som kan analyseras för proteinuttryck i ett cell cykel beroende sätt. Flera tidigare studier har skisserat metoder för att isolera KCS från människa och mus hud16,25. Dessa studier omfattar även protokoll för isolering av KCs för flödescytometri26. Ett detaljerat protokoll har dock inte beskrivits tidigare som...

Korrelation av genuttryck med cell cykel stadier är fortfarande en utmaning i analysen av djurmodeller av hyperplastiska sjukdomar som cancer. En del av denna utmaning är CO-detektion av proteiner av intresse (POI) med markörer för spridning. Proliferativa celler kan hittas i olika cell cykel faser inklusive G1, S, G2, och M. Ki67 är en av de mest använda markörer för spridning och uttrycks i alla faser av cellcykeln. Det har använts i stor utsträckning i analysen av både mänskliga och mus vävnader1,2,3. Men liksom andra allmänna spridnings markörer, Ki67 inte urskilja enskilda cellcykeln faser. En mer exakt metod använder införlivandet av tymidin nukleotid analoger som bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som aktivt replikerar deras arvsmassa (dvs. S-fas)4,5. En nackdel med användningen av nukleotidanaloger är behovet av att administrera dem till levande djur timmar före analys. Ki67 och BrdU upptäcks vanligen på fasta vävnad sektioner genom användning av antikroppar. En fördel med detta tillvägagångssätt är att placeringen av intressepunkter kan fastställas inom vävnads uppbyggnad (t. ex. det basala lagret av hud epidermis). Denna metod kräver inte heller vävnads dissociation som kan leda till förändringar i genuttryck. En nackdel är att vävnaden fixering eller bearbetning av vävnaden för OCT fryst eller paraffin snittning kan ockludera antikropps mål (dvs, antigener). Hämtning av antigener kräver normalt värme eller vävnadsnedbrytning. Kvantifiering av Färgnings intensiteter kan också vara utmanande. Detta beror på variationer i färgning, snittjocklek, signaldetektering och försöksledaren bias. Dessutom kan ett begränsat antal markörer upptäckas samtidigt i de flesta typiska laboratorie uppställningar. Ännu nyare multiplex färgning metoder lovar att övervinna dessa begränsningar; exempel är bildmascytometry och tyramid signalamplifiering6,7.
Flow flödescytometrianalys är en annan kraftfull teknik för att upptäcka prolifererande celler. Det möjliggör multiplex detektion av markörer i samma celler men kräver vävnads dissociation för de flesta icke-hematopoietiska celltyper. Analys av prolifererande celler görs rutinmässigt genom användning av färgämnen som binder DNA (t. ex. Propidium Iodide (PI))8. Flödescytometri medger också en mer exakt bestämning av cellcykelns faser i kombination med detektion av BrdU-inkorporering9. Även om en kraftfull metod, har BrdU/PI Flow flödescytometrianalys sina nackdelar. Det är oförmögen att lösa de G2/M och G0/G1 faser utan införandet av fas-specifika antikroppar. Antalet antikroppar som kan användas begränsas dock av cellulär autofluorescens, spektralspill av fluorophore-utsläpp och användning av kompensationskontroller. Denna begränsning är mer utmanande och mödosam att identifiera uttrycket av cell cykel markörer med POI. En mer facile metod är att använda masscytometry10,11. Denna teknik använder metallkonjugerade antikroppar som har ett smalare detektions spektrum. När celler färgas med metall-märkta antikroppar, de är förgasas, och de metaller som upptäcks av flödescytometrianalys tid-of-Flight (CyTOF) masspektrometri. På grund av dessa egenskaper möjliggör mascytometri multiplex-detektion av > 40 olika markörer som använder befintliga plattformar10,11. Dessutom är det möjligt att streckkods prov med metaller som resulterar i besparingar av värdefulla antikroppar samtidigt minska prov-to-Sample färgning variation. Å andra sidan, masscytometry har flera nackdelar. Det finns ett begränsat antal kommersiellt tillgängliga metallmärkta antikroppar för icke-blodhärledda celler. Kvantifiering av DNA-halten är mindre känslig jämfört med användning av fluorescerande DNA-färgämnen och masscytometri har ett minskat dynamiskt omfång av signaldetektering jämfört med fluorescensflödescytometri.
Det protokoll som beskrivs här var utformat för att analysera cellcykelns dynamik från nyligen isolerade keratinocyter (KCs) från mus huden och karakterisera cellcykelns specifika proteinuttryck i dessa celler med hjälp av masscytometri. Detta protokoll kan också användas med odlade celler eller anpassas till andra celltyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

Målet med detta protokoll är att upptäcka och kvantifiera protein uttrycks förändringar i en cell cykel beroende sätt med hjälp av enstaka celler isolerade från epidermis av mus huden. Det finns sju viktiga steg: separation av epidermis från dermis, nedbrytning av epidermis, färgning av epidermal cellpopulationer med cisplatin, prov barkodning, färgning med metall märkta antikroppar för cell cykel markörer och proteiner av intresse, detektering av metallmärkta antikroppar av masscytometri, och analys av uttrycket i de olika cellcykeln faser. Fördelen med denna metod över histologiska metoder är potentialen att assay uttrycksmönstret av > 40 olika markörer i en enda cell i olika faser av cellcykeln. Denna metod möjliggör också för multivariat korrelation analys av proteinuttryck som är mer kvantifierbar än histologiska/Imaging metoder. Nackdelen med detta protokoll är att en suspension av enstaka celler behövs, vilket resulterar i förlust av lokaliseringsinformation från färgning av vävnad sektioner. Denna metod kan också kräva införande av ytterligare markörer för att identifiera olika celltyper i rå cellsuspensioner. Tillämpningen av detta protokoll är uppenbar i analysen av hyperplastiska hud sjukdomsmodeller. Dessutom kan detta protokoll anpassas för analys av specifika subtyper av celler (t. ex. stamceller) genom tillsats av härstamning-specifika antikroppar. Detta protokoll kan också anpassas för analys av hudceller i andra försöks arter.

Tabell 1 visar förväntad cell avkastning och livskraft från vuxet mus öra (figur 1) och neonatal hud under icke-patologiska tillstånd. Tabellen visar också representativa uppgifter om djur från en blandad C57/126 bakgrund. Det förväntas att huden på andra stammar skulle resultera i liknande cell utbyten och viabilities. Den ungefärliga avkastningen är beroende av hudens yta och indikerar att neonatal hud skulle vara ett bättre va...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering och färgning av mus hud keratinocyter för cell Cycle specifik analys av cellulära protein uttryck av Masscytometry

Detta protokoll beskriver hur man isolerar hudkeratinocyter från musmodeller, för att färga med metallmärkta antikroppar, och för att analysera färgade celler av masscytometri för att profilera uttrycksmönstret av proteiner av intresse i de olika cell cykel faserna.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Detta protokoll är betydelsefullt av två huvudsakliga skäl. Nummer ett, det tillåter en användare att kunna bestämma cellcykel tillstånd av hudceller som har isolerats från ett djur modell. Det gör också att vi kan analysera proteinuttryck i de diskreta faserna i cellcykeln.Jämfört med tidigare metoder för bestämning av cellproliferation tillåter vår metod en mer exakt bestämning av de olika faserna i cellcykeln, och vi kan också analysera större än 40 olika markörer i celldelningens olika stadier. Detta förstärker kraftigt tillämpningen och mångsidigheten i metoden. Detta protokoll kan användas i cancerforskning och i någon annan typ av sjukdom där det finns ett behov av att bestämma cellcykeln specifika proteinuttryck mönster.Dessutom kan detta protokoll ändras till andra celltyper, och i andra modellorganismer. Första gången användaren bör fokusera på att få bästa kvalitet cell förberedelse möjligt. Detta kräver att experimentell hud i tid bearbetas med hjälp av färska reagenser, minimal vävnadsuppslutningstid och noggrant bortskaffande av supernatanten efter centrifugeringen för att bevara cellernas integritet och mängd.Till att börja med designa en metall-taggade antikroppar panel med hjälp av en gratis online panel design programvara, som beskrivs i manuskriptet. Förbered sedan en IdU-stamlösning genom att lösa upp IdU-pulver vid 10 milligram per milliliter i 0,1 normal natriumhydroxid vid 60 grader Celsius. Efter aliquoting IdU stamlösning i mikrocentrifugrör, frysa dem på minus 20 grader Celsius för långsiktig lagring.Omedelbart före användning, justera pH-värdet för IdU-lösningen till 7,5 med 12 normal saltsyra, och testa med en pH-remsa på en kasserad alikvot för att säkerställa att lösningen är vid pH 7.5. För att förbereda en två x paraformaldehyd fixeringslösning, kombinera fem milliliter 10 x PBS och en milliliter av 16%PFA med 44 milliliter av rent molekylärt kvalitet destillerat vatten. För att förbereda 100 millimolar cisplatin stamlösning, lös 300,5 milligram cisplatin pulver i 10 milliliter DMSO.För experiment som ska användas under en dag, förbereda en 10 millimol cisplatin arbetslösning. Väga möss och sedan bestämma en dos vid 0,1 milligram IdU per gram kroppsvikt. Administrera den beräknade dosen av IDU genom en intraperitoneal injektion, och vänta i två timmar innan du skördar celler.Använd ett par av kirurgisk grad sax för att kirurgiskt ta bort örat på den avlivade musen som tidigare injicerats med IdU vid basen av örat. Placera örat på en torr 100 millimeter Petriskål. Separera försiktigt den främre från den bakre huden genom att använda fina tutensor för att skapa en ficka i mitten eller kanten av snittområdet, dra sedan isär de två hudflikarna och fortsätt med både främre och bakre skinn.Placera försiktigt de främre och bakre skinnen på ett öra i en brunn av en 12-brunnskulturplatta, fylld med en milliliter nyberedda dispase/collagenase lösning, med derma sidan av huden vidrör lösningen. Inkubera vid 37 grader Celsius i en timme för att smälta huden. Placera det smälta örat eller neonatalhuden i en ren Petriskål med epidermissidan som rör ytan på skålen.Med hjälp av tärningar, platta ut huden och försiktigt skjut dermis av epidermis genom att arbeta från centrum till kanterna i ett cirkulärt mönster. Med tärnor, ta tag i epidermis i kanterna och försiktigt lyfta bort det genom att skala bort den från ytan av petriskålen. Placera försiktigt epidermis på förvösa cellavlossningslösning i en brunn av en tallrik.Inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius eller 20 minuter vid rumstemperatur. Använd sterila tlyktor för att greppa överhuden och skrubba genom att dra epidermis mot botten av skålen för att separera celler. Tillsätt en milliliter DMEM som innehåller 1%FBS, och passera genom en 40 mikrometer cell sikt i en samlingsrör.Skölj väl med ytterligare två milliliter DMEM och lägg till cellen suspension. Efter centrifugering vid 120 gånger g i fem minuter, aspirera noggrant supernatanten. Resuspend cell pelleten i en till två milliliter dmem innehållande 1%FBS, och pellet cellerna igen som tidigare.För att märka celler för att bestämma levande och döda celler, resuspend en till tre miljoner celler i en milliliter av DMEM som innehåller 25 mikromolar cisplatin och inkubera i en minut. Släck genom pipettering med en lika stor volym FBS. Efter centrifugering vid 120 gånger g i fem minuter, dekantera supernatanten i en bägare som innehåller utspädd blekmedel, och invertera rören för att dränera den återstående lösningen på en pappershandduk.Resuspend cell pelleten i två milliliter av barium katjon-fria PBS, och centrifug dem igen som tidigare beskrivits. För att fixera cellerna, återanvänd cellpelletsen i en milliliter av bariumkjonfri PBS. Vortexa cellerna under kontinuerlig låg effekt och tillsätt en milliliter av de två x PFA fixering buffert drop-wise.Placera på en gungplattform och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter. Efter centrifugering vid 500 gånger g i fem minuter, försiktigt dekantera supernatanten. Tvätta cellerna med två milliliter av barium katjonfri PBS, centrifug igen under samma förhållanden, och upprepa tvättsteget.Slutligen, återanvända pelleten i två milliliter av barium katjon-fri PBS. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter och försiktigt dekantera supernatanten. Resuspend cellerna i en milliliter av en x fixering buffert, och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter och upprepa centrifugeringen.För att tvätta cellerna, tillsätt en milliliter av streckkod permeabilisering buffert. Under cellcentrifugeringen vid 500 gånger g i fem minuter, förbereda streckkoder genom att lägga till 100 mikroliter av streckkod permeabilization buffert till dem, och blanda omedelbart. Resuspend cell pelleten i 800 mikroliter av streckkod permeabilization buffert.Lägg till streckkodslösning till cellerna, blanda och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Centrifugera vid 500 gånger g i fem minuter. Tvätta celler i två milliliter cellfärgningsbuffert och centrifug igen.Därefter återanvänder en till tre miljoner celler i en milliliter kärnantigen färgning buffert arbetslösning, och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter centrifugering vid 500 gånger g i fem minuter, försiktigt dekantera supernatanten. Resuspend cellerna i en milliliter av kärn- antigenfärgningspermeabilizationbuffert och centrifug igen.Efter upprepad återfjädring och centrifugering, resuspend cell pelleten i restvolymen med mild virvelning. Tillsätt 50 mikroliter av intracellulär antikroppscocktail, blanda och inkubera i rumstemperatur i 45 minuter. Lägg till två milliliter cellfärgningsbuffert.Centrifugera igen under samma förhållanden som i föregående steg, och ta bort supernatanten. Resuspend pelleten i två milliliter av cell infärgning buffert, centrifugera vid 500 gånger g i fem minuter, och upprepa resuspending och centrifugering. Resuspend cellerna i en milliliter av interkalation lösning, och lagra för en till tre dagar vid fyra grader Celsius.Efter centrifugering av cellerna igen, tvätta pelleten med två milliliter cellfärgningsbuffert, centrifug under samma förhållanden, och utför två extra tvättar med två milliliter vatten, med samma centrifugering. Resuspend cell pelleten vid en koncentration av en miljon celler per milliliter med utspädd EQ pärllösning, och sedan köra proverna på massan cytometer. Förväntade cell avkastning och livskraft från vuxna mus öra och neonatal hud bestäms.Den ungefärliga avkastningen beror på hudens yta. Neonatal hud är ett bättre val för experiment som kräver större antal celler. Den grundläggande gating strategi för att välja för intakt, enstaka och livskraftiga celler, efter normalisering och deconvolution av streckkodade masscytometri data, visas.Andelen livskraftiga celler kan vara vägledande för cellernas kvalitet eller tillstånd före färgning. Skillnader i livskraft mellan odlade carcinom celler kontra isolerade mus öra celler visas också. Livskraftiga celler var gated på händelse längd kontra CD45 att utesluta hematopoietic celler.Införandet av härstamningsmarkörer möjliggör val av cellpopulationer av intresse i olika cellcykelfaser. Den grundläggande cellcykelprofilen erhålls genom detektion av BrdU kontra PI i fluorescerande-baserad flödescytometri. Införandet av andra spridning markörer med massa cytometri, möjliggör dock en mer exakt identifiering av cellcykel faser.Efter detta tillvägagångssätt kan cellcykelprofiler konstrueras för olika celltyper eller experimentella tillstånd, till exempel profilerna för CD45 negativ kontra CD45 positiva celler från samma experiment. I ett annat exempel, analys av markörer som definierar EGFR och mTOR PI3K signalvägar i G-en-fasen, avslöjade liknande uttrycksprofiler i CD45 negativa celler, visas i orange, och CD45 positiva celler, visas i blått. Masscytometri kräver en hel del högkvalitativa celler.Om en användare är intresserad av en sällsynt cellpopulation kan det behövas ett högre antal celler. Isolerade levande celler kan användas för DNA- eller RNA-analys, biokemiska studier, eller kan användas i vävnadsodling före fixeringen och färgningen för masscytometri. Användaren bör använda personlig skyddsutrustning och ett säkerhetsskåp när det behövs, när man arbetar med paraformaldehyd, saltsyra, eller natriumhydroxid.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotypic Co-kultur Modell Stöd Medullary Thymic epitelcellproliferation, differentiering och promiskuös Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Steg-specifik Sortering av mus spermatider med flödescytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolera stamceller i hudens hårsäckar och epidermal keratinocyter från Dorsal mushud

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...