Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Bu iş için destek, Dermatoloji bölümü, Colorado Üniversitesi ve Colorado Üniversitesi (UC) Cilt Hastalıkları Merkezi Morfoloji ve phenotyping çekirdekleri (NıAMS P30 AR057212) rejeneratif tıp için Gates merkezi geldi. Yazarlar UC Kanser Merkezi akış Cytometri paylaşılan kaynak ve destek Grant (NCı P30 CA046934) kitle sitometrenin çalışması için kabul ve Karen Helm ve Christine Childs için çekirdek akış ve kitle sitometrik üzerinde uzman tavsiyeler için minnettar Teknik.

Colorado Üniversitesi Anschutz tıp Kampüsü ' Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi bu protokolde açıklanan hayvan deneylerini onayladı.
1. preparatlar
<ol><li>Metal etiketli bir antikor paneli tasarlayın. Ücretsiz online panel tasarım yazılımı kullanın12 ve 127iododeoxyuridine dahil (IDU), 164DY (disprosium) etiketli Anti-CCNB1 (cyclin B1), 175lu (Lutetium) Fosfo (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), ve 150<...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

Bu yazıda özetlenen protokol yaklaşık 8 saat içinde tamamlanabilir. Sonuç, hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifadesi için analiz edilebilir KCs zenginleştirilmiş hücrelerin bir süspansiyon olduğunu. Birkaç önceki çalışmalar insan ve fare cilt16,25KCS yalıtmak için yöntemler özetlenmiştir. Bu çalışmalar aynı zamanda akış cytometri26Için KCS izolasyonu için protokoller içerir. Ancak, ayrıntı...

Gen ifadesinin hücre döngüsü aşamaları ile korelasyon, kanser gibi hiperplastik hastalıkların hayvan modellerinin analizinde bir zorluk olarak kalır. Bu zorluk bir parçası proliferasyon işaretçileri ile ilgi proteinlerinin (POı) ortak algılanması olduğunu. Proliferatif hücreler G1, S, G2 ve M. Ki67 dahil olmak üzere çeşitli hücre döngüsü aşamalarında bulunabilir ve proliferasyon en sık kullanılan belirteçleri biridir ve hücre döngüsünün tüm aşamalarında ifade edilir. Hem insan hem de fare dokularında1,2,3analizinde yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, diğer genel proliferasyon işaretçileri gibi, Ki67 bireysel hücre döngüsü aşamalarını ayırt etmez. Daha hassas bir yaklaşım, bromodeoxyuridine (BrdU) gibi, genomu (örn., S-faz)4,5' i aktif olarak çoğalan hücrelere, thymidin nükritit analoglarının birleştirilmesini kullanır. Nükl analoglarının kullanımına yönelik bir dezavantajı, analizden önce hayvanları saatlerce yaşamaları için onları yönetmeniz gerekir. Ki67 ve BrdU genellikle antikor kullanımı ile sabit doku bölümlerinde algılanır. Bu yaklaşımın bir avantajı, POI 'nin konumunun doku mimarisi içinde (örn. Cilt epidermis bazal tabakası) tespit edilebilir olmasıdır. Bu yaklaşım da gen ifadesinde değişikliklere yol açabilir doku ayrışma gerektirmez. Bir dezavantajı, doku fiktosit veya EKIM dondurulmuş veya parafin sekleme için doku işlenmesi antikor hedefleri (yani, antijenler) okclude olabilir. Antijenlerin alınması genellikle ısı veya doku sindirimi gerektirir. Boyama yoğunluklarını ölçmek de zor olabilir. Bu, boyama, kesit kalınlığı, sinyal algılama ve deney giriş önyargı varyasyonları kaynaklanmaktadır. Dahası, çoğu tipik laboratuar kurulumunda aynı anda sınırlı sayıda Marker tespit edilebilir. Henüz, daha yeni Multiplex boyama yaklaşımlar bu sınırlamaları aşmak için söz; örnekler görüntüleme kütlesi sitometri ve tyramid sinyal amplifikasyon6,7.
Akış cytometri Proliferasyona hücreleri algılamak için başka bir güçlü teknolojidir. Aynı hücrelerde işaretçilerin Multiplex tespiti için izin verir ama çoğu olmayan hematopoetik hücre türleri için doku ayrışma gerektirir. Proliferasyon hücrelerinin analizi, DNA 'Yı bağlayan boyaların kullanımı ile rutin olarak yapılır (örn., Propidium Iyodide (PI))8. Akış sitometri Ayrıca BrdU kuruluşunda9algılanması ile birleştiğinde hücre döngüsü aşamalarının daha hassas bir şekilde belirlenmesine izin verir. Güçlü bir yaklaşım olsa da, BrdU/PI akış sitometri dezavantajları vardır. Faz spesifik antikorların eklenmesi olmadan G2/M ve G0/G1 aşamalarını çözemeyebilir. Ancak, kullanılabilecek antikorların sayısı hücresel autofluorescence ile sınırlıdır, fluorophore emisyonları spektral yayılma, ve tazminat kontrolleri kullanımı. Bu sınırlama, hücre döngüsü işaretleyicilerinin POI 'ler ile ifade edilmesini daha zorlu ve zahmetli bir şekilde işaretler. Daha facile bir yaklaşım kitle sitometri10,11kullanmaktır. Bu teknoloji, dar algılama yelpazesine sahip metal konjuge antikorları kullanır. Hücreler metal etiketli antikorlar ile lekelendikten sonra, buharlaştırılmış ve cytometri zaman-of-Flight (CyTOF) kütle spektrometresi tarafından algılanan metaller. Bu özellikler nedeniyle kitle sitometrisi, mevcut platformları10,11kullanarak > 40 farklı işaretçinin Multiplex algılamasını sağlar. Buna ek olarak, numune-Numune boyama değişkenliği azaltarak değerli antikorların tasarrufuna neden metaller ile barkod örnekleri mümkündür. Öte yandan, kitle sitometrisi çeşitli dezavantajları vardır. Non-kan türetilen hücreler için ticari olarak kullanılabilir metal etiketli antikorlar sınırlı sayıda vardır. DNA içeriğinin ölçülme özelliği, floresan DNA boyalarının kullanımına kıyasla daha az hassastır ve kitle sitometri floresan Akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında düşük dinamik sinyal algılama aralığına sahiptir.
Burada açıklanan protokol, yeni izole keratinositlerden (KCs) gelen hücre döngüsü dinamiklerini fare derisinden analiz etmek ve kitle sitometrisi kullanarak bu hücrelerde hücre döngüsünün spesifik protein ifadesini karakterize etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerle de kullanılabilir veya diğer hücre türlerine adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

Bu protokolün amacı, fare derisinin epidermis izolasyonlu tek hücreleri kullanarak bir hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifade değişikliklerini algılamak ve ölçmek için. Yedi önemli adım vardır: dermis epidermis ayrılması, epidermis sindirim, cisplatin ile epidermal hücre nüfus boyama, örnek barkodlama, hücre döngüsü işaretçileri ve proteinleri için metal etiketli antikorlar ile boyama faiz, kütle sitometri tarafından metal etiketli antikorların tespiti, ve çeşitli hücre döngüsü aşamalarında ifade analizi. Histolojik yöntemler üzerinde bu yaklaşımın avantajı, hücre döngüsünün farklı aşamalarında tek bir hücrede > 40 farklı işaretçileri ifade deseni tahlil potansiyeldir. Bu yaklaşım, histolojik/görüntüleme yöntemlerinden daha ölçülebilir olan protein ifadesinin çok değişkenli korelasyon analizine de izin verir. Bu protokolün dezavantajı, tek hücrelerin süspansiyonunun gerekli olduğu, bu da doku bölümlerinin boyama tarafından sağlanan konum bilgilerinin kaybına neden olmaktadır. Bu yaklaşım da ham hücre süspansiyonları farklı hücre türlerini tanımlamak için ek işaretçileri eklenmesi gerektirebilir. Bu protokolün uygulanması hiperplastik cilt hastalığı modellerinin analizinde belirgindir. Dahası, bu protokol, belirli alt tür hücrelerin analizi için uyarlanabilir (örn., kök hücreler), köklere özgü antikorların ilavesi ile. Bu protokol Ayrıca diğer deneysel türlerin cilt hücrelerinin analizi için uyarlanabilir.

Tablo 1 , Yetişkin fare kulağı (Şekil 1) ve yenidoğan cildin patolojik olmayan koşullarda beklenen hücre verimleri ve canlılığı gösterir. Tablo ayrıca Mixed C57/126 arka planda hayvanların temsili verilerini gösterir. Diğer suşların cildin benzer hücre verimleri ve yeteneklerine neden olacağını bekleniyor. Yaklaşık verim cildin yüzey alanına bağlıdır ve yenidoğan cildin daha büyük sayıda hücre gerektiren dene...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Bu protokol iki ana nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, bir kullanıcının bir hayvan modelinden izole edilmiş deri hücrelerinin hücre döngüsü durumlarını belirleyebilmelerini sağlar. Ayrıca hücre döngüsünün ayrık evrelerinde protein ekspresyonunu analiz edebilmemizi sağlar.Hücre çoğalmasını belirleyen önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz hücre döngüsündeki farklı evrelerin daha kesin belirlenmesine izin verir ve hücre bölünmesinin çeşitli aşamalarında 40'tan fazla farklı belirteçleri analiz edebiliriz. Bu büyük ölçüde uygulama ve yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Bu protokol kanser araştırmalarında ve hücre döngüsüne özgü protein ekspresyonu desenlerini belirlemeye ihtiyaç duyulan başka bir hastalık türünde kullanılabilir.Buna ek olarak, bu protokol diğer hücre tipleri ve diğer model organizmalar değiştirilebilir. İlk kez kullanıcı mümkün olan en kaliteli hücre hazırlanması almaya odaklanmalıdır. Bu taze reaktifler kullanarak deneysel cildin zamanında işlenmesini gerektirir, minimal doku sindirim süresi, ve hücrelerin bütünlüğünü ve miktarını korumak için santrifüj sonrası supernatant dikkatli bertaraf.Başlamak için, el yazması açıklandığı gibi ücretsiz bir online panel tasarım yazılımı kullanarak metal etiketli antikor paneli tasarlayabilirsiniz. Daha sonra IdU tozunu mililitrebaşına 10 miligramlık 60 santigrat derecede 0,1 normal sodyum hidroksitte eriterek Bir IdU stok çözeltisi hazırlayın. Mikrocentrifuge tüpler içine IdU stok çözüm aliquoting sonra, uzun süreli depolama için eksi 20 derece santigrat onları dondurmak.Kullanımdan hemen önce, IdU çözeltisinin pH'ını 12 normal hidroklorik asitle 7,5'e ayarlayın ve çözeltinin pH 7.5'te olduğundan emin olmak için bir ataliquot üzerinde bir pH şeridi ile test edin. İki x paraformaldehit sabitleme çözeltisi hazırlamak için, beş mililitre 10 x PBS ve bir mililitre 16%PFA ile 44 mililitre saf moleküler dereceli distile suyu birleştirin. 100 milimoler sisplatin çözeltisi hazırlamak için, 10 mililitre DMSO'da 300,5 miligram sisplatin tozunu çözün.Deneylerin bir gün içinde kullanılması için 10 milimolar kisplatin çalışma çözeltisi hazırlayın. Fareleri tartın ve gram vücut ağırlığı başına 0,1 miligram IdU'da bir doz belirleyin. Bir intraperitoneal enjeksiyon ile IDU hesaplanan doz uygulayın ve hücreleri hasat önce iki saat bekleyin.Daha önce kulak tabanında İdU enjekte edilen ötenazili farenin kulağını cerrahi olarak çıkarmak için bir çift cerrahi dereceli makas kullanın. Kulağı kuru 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Kesme alanının ortasında veya kenarında bir cep oluşturmak için ince forsepsler kullanarak ön kısmı arka deriden dikkatlice ayırın, sonra iki deri kapağını birbirinden ayırın ve hem ön hem de arka derilerle devam edin.Bir kulağın ön ve arka derilerini, bir mililitre taze hazırlanmış dispase/kollajenaz solüsyonu ile dolu 12 kuyulu bir kültür plakasının bir kuyuya, derinin derma tarafının solüsyona değmesiyle dikkatlice yerleştirin. Cildi sindirmek için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Sindirilmiş kulak veya yenidoğan derisini epidermisin tarafı kabın yüzeyine dokunarak temiz bir Petri kabına yerleştirin.Forceps kullanarak, deri düzleştirmek ve yavaşça dairesel bir desen kenarlarına merkezinden çalışarak epidermis kapalı dermis slayt. Forseps ile, kenarlarında epidermis kapmak ve yavaşça Petri çanak yüzeyinden soyma tarafından kaldırın. Epidermisini önceden ısıtılmış hücre ayırma solüsyonuna dikkatlice bir tabakanın bir kuyusu halinde yerleştirin.37 santigrat derecede beş dakika veya oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Hücreleri ayrıştırmak için epidermisin isini çanak altına doğru sürükleyerek epidermisin kavrayışına ve temizlenmesiiçin steril çterler kullanın. %1 FBS içeren bir mililitre DMEM ekleyin ve 40 mikrometrelik bir elekten toplama tüpüne geçirin.DMEM ek iki mililitre ile iyice durulayın ve hücre süspansiyon ekleyin. Beş dakika boyunca 120 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant aspire. Hücre peletini %1 FBS içeren 1-2 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve daha önce olduğu gibi hücreleri tekrar peletlendirin.Canlı ve ölü hücreleri belirlemek için hücreleri etiketlemek için, 25 mikromolar sisplatin içeren bir mililitre dmem bir ila üç milyon hücre resuspend ve bir dakika kuluçka. Eşit hacimde FBS ile boru lama ile söndürün. Beş dakika boyunca 120 kez g santrifüj sonra, seyreltilmiş çamaşır suyu içeren bir beher içine supernatant decant ve bir kağıt havlu üzerine kalan çözüm drenaj tüpleri ters.İki mililitre baryum katyonsuz PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın ve daha önce açıklandığı gibi tekrar santrifüj edin. Hücreleri onarmak için, baryum katyoniçermeyen PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Sürekli düşük güç altında hücreleri Girdap ve iki x PFA fiksasyon tampon damla akıllıca bir mililitre ekleyin.Sallanan bir platforma yerleştirin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant decant. Hücreleri iki mililitre baryum katyonsuz PBS ile yıkayın, aynı koşullar altında tekrar santrifüj edin ve yıkama adımını tekrarlayın.Son olarak, baryum katyon içermeyen PBS iki mililitre pelet resuspend. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice dekant. Bir x fiksasyon tamponunun bir mililitresinde hücreleri yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve santrifüjü tekrarlayın.Hücreleri yıkamak için, barkod permeabilization tampon bir mililitre ekleyin. Hücre santrifüjü sırasında 500 kez g beş dakika, onlara barkod permeabilizasyon tampon 100 mikrolitre ekleyerek barkod hazırlamak ve hemen karıştırın. Barkod permeabilizasyon tampon800 mikrolitre hücre pelet resuspend.Hücrelere barkod çözeltisi ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj. Hücreleri iki mililitre hücre boyama tamponu ve santrifüjde tekrar yıkayın.Sonra, nükleer antijen boyama tampon çalışma solüsyonu bir mililitre bir ila üç milyon hücre askıya, ve 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant decant. Nükleer antijen boyama permeabilizasyon tampon ve santrifüj bir mililitre hücreleri yeniden askıya.Tekrar resuspension ve santrifüj sonra, nazik girdap ile kalıntı hacminde hücre pelet yeniden askıya. Hücre içi antikor kokteyl, mix 50 mikrolitre ekleyin ve 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Hücre boyama tampon iki mililitre ekleyin.Bir önceki adımda olduğu gibi aynı koşullar altında tekrar santrifüj ve supernatant kaldırın. Hücre boyama tampon iki mililitre pelet resuspend, beş dakika için 500 kez g santrifüj, ve resususpend ve santrifüj tekrarlayın. Hücreleri bir mililitre intercalation çözeltisinde yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede bir ila üç gün saklayın.Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, aynı koşullar altında hücre boyama tampon, santrifüj iki mililitre ile pelet yıkayın ve aynı santrifüj ile, iki mililitre su ile iki ek yıkama gerçekleştirin. Seyreltilmiş EQ boncuk çözeltisi ile mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu hücre pelet resuspend ve sonra kitle sitometre üzerinde örnekleri çalıştırın. Erişkin fare kulağı ve yenidoğan derisinden beklenen hücre verimleri ve canlılık belirlenir.Yaklaşık verim cildin yüzey alanına bağlıdır. Yenidoğan cilt hücrelerinin daha fazla sayıda gerektiren deneyler için daha iyi bir seçimdir. Barkodlu kitle sitometri verilerinin normalleştirilmesi ve deconvolution sonra bozulmamış, tek ve canlı hücreler için seçmek için temel gating stratejisi gösterilir.Canlı hücrelerin yüzdesi boyama önce hücrelerin kalitesi veya durumu göstergesi olabilir. Kültürlü karsinom hücreleri ile izole fare kulak hücreleri arasındaki canlılık farklılıkları da gösterilmiştir. Canlı hücreler hematopoetik hücreleri dışlamak için olay uzunluğu na karşı CD45'e kapılı idi.Soy belirteçlerinin eklenmesi, farklı hücre döngüsü evrelerinde ilgi çeken hücre popülasyonlarının seçilmesine olanak sağlar. Temel hücre döngüsü profili floresan bazlı akış sitometrisinde BrdU ile PI'nin saptanması ile elde edilir. Ancak, kitle sitometrisi ile diğer proliferasyon belirteçlerinin dahil edilmesi, hücre döngüsü fazlarının daha kesin bir şekilde tanımlanmasını sağlar.Bu yaklaşımı takiben, hücre döngüsü profilleri farklı hücre tipleri veya aynı deneyden CD45 negatif karşı CD45 pozitif hücreler için profiller gibi deneysel koşullar için oluşturulabilir. Başka bir örnekte, G-bir fazında EGFR ve mTOR PI3K sinyal yollarını tanımlayan işaretleyicilerin analizinde, turuncu olarak gösterilen CD45 negatif hücrelerde benzer ifade profilleri ve mavi renkle gösterilen CD45 pozitif hücrelerde benzer ifade profilleri ortaya kondur. Kitle sitometrisi çok fazla yüksek kaliteli hücre gerektirir.Bir kullanıcı nadir bir hücre popülasyonuyla ilgileniyorsa, daha fazla sayıda hücre gerekebilir. İzole canlı hücreler DNA veya RNA analizi, biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilir veya kitle sitometriiçin fiksasyon ve boyama öncesinde doku kültüründe kullanılabilir. Kullanıcı paraformaldehit, hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ile çalışırken gerektiğinde kişisel koruma ekipmanı ve bir güvenlik kabini kullanmalıdır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...