Name: automated 3d optical coherence tomography to elucidate biofilm morphogenesis over large spatial scales
Uploaded: 2019-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales at JoVE.com

Wir danken Mauricio Aguirre Morales für seinen Beitrag zur Entwicklung dieses Systems.  Finanzielle Unterstützung kam vom Schweizerischen Nationalfonds an T.J.B.

1. Einrichtung des Positioniergeräts
<ol><li>Verdrahten Sie das Positioniergerät mit einer Mikrocontrollerplatine, die den Anweisungen in https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl folgt.</li>
	<li>Schließen Sie den Mikrocontroller über ein USB-Kabel an einen Single-Board-Computer mit Internetverbindung an und installieren Sie den GRBL-Server wie in https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git beschrieben. Nun sollte das Positionierungsgerät über eine Webseite, die in http://IP:5020/ gehostet wird, n...

<ol>
	<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li><li>Flemming, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+characteristics+of+biofilm+streamers+in+turbulent+flowing+water+as+related+to+drag+and+pressure+drop.">Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop.</a> Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+migratory+ripples+in+a+mixed+species+bacterial+biofilm+growing+in+turbulent+flow.">The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow.</a> Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).</li><li>Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation.">Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).</li><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Microbiology. 14, 251-263 (2016).</li><li>Battin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+landscapes:+new+paths+to+biofilm+research.">Microbial landscapes: new paths to biofilm research.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).</li><li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+techniques,+sensors,+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales.">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).</li><li>Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+coherence+microscopy+for+the+in+situ+investigation+of+the+biofilm.">Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm.</a> J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).</li><li>Wagner, M., Horn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+in+biofilm+research:+A+comprehensive+review.">Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography.">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li><li>Haisch, C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+transient+processes+in+biofilms+by+optical+coherence+tomography.">Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography.</a> Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).</li><li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).</li><li>Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+&#8211;+development,+principles,+applications.">Optical coherence tomography &#8211; development, principles, applications.</a> Zeitschrift f&#252;r Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).</li><li>Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+speed+spectral-domain+optical+coherence+microscopy.">Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy.</a> Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).</li><li>Fortunato, L., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+biofouling+assessment+in+spacer+filled+channels+using+optical+coherence+tomography+(OCT):+3D+biofilm+thickness+mapping.">In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping.</a> Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li><li>Roche, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benthic+biofilm+controls+on+fine+particle+dynamics+in+streams.">Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams.</a> Water Resources. 53, 222-236 (2016).</li><li>Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approach+to+characterize+fouling+on+a+flat+sheet+membrane+gravity+driven+submerged+membrane+bioreactor.">Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor.</a> Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).</li><li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+engineering:+linking+biofilm+development+at+different+length+and+time+scales.">Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).</li></ol>

Die OCT-Bildgebung eignet sich gut, um Strukturen im Mikrometerbereich mit einem FOV von mehreren Quadratmillimetern aufzulösen. Es ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die Biofilmforschung10,18. Allerdings ist OCT derzeit auf eine maximale Scanfläche von 100 - 256 mm2beschränkt, während Biofilmstrukturmuster diese räumliche Skala oft übersteigen19, insbesondere wenn die morphologische Differenzierung durch große...

Biofilme sind eine sehr erfolgreiche mikrobielle Lebensstilanpassung und diese interphasenassoziierten und matrixumschlossenen Gemeinschaften von Mikroorganismen dominieren das mikrobielle Leben in natürlichen und industriellen Umgebungen1,2. Dort bilden Biofilme komplexe Architekturen, wie längliche Streamer3, Ripples4 oder pilzartige Kappen5 mit wichtigen Folgen für Biofilmwachstum, strukturelle Stabilität und Stressresistenz6. Während viel über die strukturelle Differenzierung von Biofilmen aus der Arbeit an Mono-Arten-Kulturen gelernt wurde, die in Miniatur-Flusskammern angebaut werden, sind die meisten Biofilme hochkomplexe Gemeinschaften, die oft Mitglieder aller Lebensbereiche umfassen6. Diese komplexen Biofilme als mikrobielle Landschaften zu würdigen7 und zu verstehen, wie Biofilmstruktur und -funktion in komplexen Gemeinschaften interagieren, steht damit an vorderster Front der Biofilmforschung.
Ein mechanistisches Verständnis der Morphogenese komplexer Biofilme als Reaktion auf Umwelthinweise erfordert sorgfältig konzipierte Experimente in Verbindung mit räumlich und zeitlich aufgelösten Beobachtungen der physikalischen Struktur des Biofilms über relevante Skalen8. Die zerstörungsfreie Beobachtung des Biofilmwachstums in experimentellen Systemen wurde jedoch durch logistische Zwänge wie die Notwendigkeit, Proben (z. B. in ein Mikroskop) zu verschieben, die häufig die empfindliche Biofilmstruktur schädigen, stark eingeschränkt.
Das hier vorgestellte Protokoll führt ein vollautomatisiertes System auf der Grundlage der optischen Kohärenztomographie (OCT) ein, das die in situ, nicht-invasive Überwachung der Biofilmmorphogenese im Mesoscale (mm-Bereich) ermöglicht. OCT ist eine neue bildgebende Technik in der Biofilmforschung mit Anwendungen in der Wasseraufbereitung und Biofouling-Forschung, Medizin9 und Strömungsökologie10. In OCT wird eine lichtarme Lichtquelle in einen Proben- und Referenzarm aufgeteilt; die Interferenz des vom Biofilm reflektierten und gestreuten Lichts (Probenarm) und das Licht des Referenzarms wird analysiert. Eine Reihe von axialen Intensitätsprofilen (A-Scans), die tief aufgelöste Strukturinformationen enthält, wird erfasst und zu einem B-Scan (einem Querschnitt) zusammengeführt. Eine Reihe benachbarter B-Scans bildet den endgültigen 3D-Volume-Scan10. OCT bietet eine seitliche optische Auflösung im Bereich von ca. 10 m und eignet sich daher gut zur Untersuchung der meskopischen strukturellen Differenzierung von Biofilmen10,12. Eine ausführlichere Beschreibung des ÜLG finden Sie unter Drexler und Fujimoto13und Fercher und Kollegen14. Obwohl das Sichtfeld eines einzelnen OCT-Xy-Scans bis zu Hunderte von Quadratischen Mikrometern erreicht, können größere Muster nicht mit Hilfe von OCT in einem einzigen Scan quantifiziert werden. In Bezug auf Biofilme in natürlichen Lebensräumen wie Bächen und Flüssen schränkt dies derzeit unsere Fähigkeit ein, die Biofilmmorphogenese in Schuppen zu bewerten, die der physikalischen und hydraulischen Vorlage des Lebensraums entsprechen.
Um diese räumlichen Grenzen zu überschreiten und OCT-Scans automatisch zu erfassen, wurde eine Spektral-Domain-OCT-Bildsonde auf einem 3-Achsen-Positionierungssystem montiert. Die Installation ermöglicht die Erfassung mehrerer OCT-Scans in einem überlappenden Mosaikmuster (Kachelscan), wodurch die tomographische Abbildung von Oberflächen bis 100 cm2effektiv erreicht wird. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Positionierpräzision dieses Systems eine zuverlässige Überwachung des Wachstums und der Entwicklung von Biofilmmerkmalen an bestimmten Standorten bei Langzeitexperimenten. Das System ist modular aufgebaut und einzelne Komponenten (z.B. Positioniergerät und OCT) der Anlage können als Standalone-Lösungen eingesetzt oder flexibel kombiniert werden. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Hard- und Softwarekomponenten der Installation.
Das System wurde mit einer handelsüblichen GRBL-gesteuerten CNC-Positioniervorrichtung (Materialtabelle )getestet. Die Betriebsabstände dieser speziellen Positionierplattform betragen 600 x 840 x 140 mm, mit einer herstellergenauen Genauigkeit von +/- 0,05 mm und einer programmierbaren Auflösung von 0,005 mm. GRBL ist eine Open-Source-(GPLv3-Lizenz), eine leistungsstarke Bewegungssteuerung für CNC Geräte. Daher sollte jedes GRBL-basierte (Version > 1.1) Positionierungsgerät mit den hier vorgestellten Richtlinien und Softwarepaketen kompatibel sein. Darüber hinaus konnte die Software mit wenigen Modifikationen an andere Schrittmotorregler mit STEP-DIR-Eingangstyp angepasst werden.
Das OCT-Gerät zur Beurteilung der Leistung des Systems (Tabelle der Materialien) verfügt über eine lichtarme Lichtquelle mit einer mittleren Wellenlänge von 930 nm (Bandbreite = 160 nm) und einstellbarer Referenzarmlänge und -intensität. Im hier vorgestellten Beispiel wurde auch ein Tauchadapter zum Eintauchen der OCT-Sonde in fließendes Wasser verwendet (Tabelle der Materialien). Das hier für die automatisierte OCT-Scanerfassung entwickelte Softwarepaket hängt entscheidend vom SDK zusammen mit dem spezifischen OCT-System ab, jedoch sollten OCT-Systeme desselben Herstellers mit unterschiedlichen Scanlinsen und zentralen Wellenlängen leicht kompatibel.
Das GRBL-Gerät wird von einem Webserver gesteuert, der auf einem Einplatinencomputer installiert ist (Abbildung 1). Dadurch wird die Fernsteuerung des Geräts von jedem Computer mit lokalem Netzwerk oder Internetzugang gewährt. Das OCT-Gerät wird von einem separaten Computer gesteuert, so dass der Betrieb des OCT-Systems neben dem automatisierten Versuchsaufbau möglich ist. Schließlich enthalten die Softwarepakete Bibliotheken zum Synchronisieren der OCT-Sondenpositionierung und der OCT-Scanerfassung (d. h. zum automatischen Erfassen von 3D-Bilddatensätzen in einem Mosaikmuster oder in einer Reihe definierterPositionen). Die Definition der Position der OCT-Sonde in 3D ermöglicht effektiv die Einstellung der Brennebene speziell für (regionale) Scans. Insbesondere können auf unebenen Flächen für jeden OCT-Scan unterschiedliche Brennebenen (d.h. unterschiedliche Positionen in z-Richtung) angegeben werden.
Eine Reihe von Softwarepaketen wurde entwickelt, um rohe OCT-Scans zu verarbeiten (Tabelle 1). Die Navigation des Positioniergeräts, die OCT-Scanerfassung und die Datensatzverarbeitung werden mit Python-codierten Jupyter-Notebooks durchgeführt, die eine bemerkenswerte Flexibilität bei der Entwicklung und Optimierung der Software ermöglichen. Zwei bearbeitete und mit Anmerkungen bezeichnete Beispiele solcher Notizbücher (für die Bildaufnahme bzw. -verarbeitung) sind ab https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Sie sind als Ausgangspunkte für die Anpassung gedacht. der Methode. Ein Jupyter-Notebook ist eine Webbrowser-basierte Anwendung, die Zellen mit mit Anmerkungen python-Code enthält. Jeder Schritt ist in einer Zelle des Notizbuchs enthalten, die separat ausgeführt werden kann. Aufgrund der unterschiedlichen Länge des Lichtpfades durch die Scanlinse (sphärische Aberration)15erscheinen die rohen OCT-Scans verzerrt (Abbildung 2A). Wir haben einen Algorithmus entwickelt, um diese Verzerrung in erfassten OCT-Scans automatisch zu korrigieren (enthalten in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Darüber hinaus kann die Biofilmmorphologie als 2D-Höhenkarte visualisiert werden, wie sie zuvor in Membransystemen16verwendet wurde, und wir veranschaulichen, wie Höhenkarten aus Scans, die in einem Kachelarray aufgenommen wurden, genäht werden können.
Schließlich wird die Funktionalität der beschriebenen Laborinstallation anhand eines Flume-Experiments veranschaulicht, bei dem phototropher Strombiofilm einem Gradienten der Strömungsgeschwindigkeit ausgesetzt ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:631px;" width="631">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OCT Probe</td>
			<td style="width:129px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">GAN210C1</td>
			<td style="width:167px;">OCT imaging device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OCT scan lens</td>
			<td style="width:129px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:119px;">OCT-LK3-BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Immersion adapter</td>
			<td style="width:129px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:119px;">OCT-IMM3-SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stepcraft 840 CK</td>
			<td style="width:129px;">STEPCRAFT</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>positioning device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microcontroller</td>
			<td style="width:129px;">Arduino Uno R3</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single-board computer</td>
			<td style="width:129px;">Raspberry PI</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">camera</td>
			<td style="width:129px;">Canon EOS 7D Mark II</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">camera lens</td>
			<td style="width:129px;">Canon MACRO EFS 35 mm</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated 3d optical coherence tomography to elucidate biofilm morphogenesis over large spatial scales

Biofilme sind ein sehr erfolgreicher mikrobieller Lebensstil und setzen sich in einer Vielzahl von Umwelt- und Ingenieurumgebungen durch. Das Verständnis der Biofilmmorphogenese, d. h. der strukturellen Diversifikation von Biofilmen während der Gemeinschaftsversammlung, stellt eine bemerkenswerte Herausforderung über räumliche und zeitliche Skalen hinweg dar. Hier präsentieren wir ein automatisiertes Biofilm-Bildgebungssystem auf Basis der optischen Kohärenztomographie (OCT). OCT ist eine neue bildgebende Technik in der Biofilmforschung. Die Datenmenge, die derzeit erfasst und verarbeitet werden kann, behindert jedoch die statistische Schlussfolgerung großer Muster in der Biofilmmorphologie. Das automatisierte OCT-Bildgebungssystem ermöglicht die Abdeckung großer räumlicher und erweiterter zeitlicher Skalen des Biofilmwachstums. Es kombiniert ein kommerziell erhältliches OCT-System mit einer Robotik-Positionierungsplattform und einer Reihe von Softwarelösungen zur Steuerung der Positionierung der OCT-Scansonde sowie zur Erfassung und Verarbeitung von 3D-Biofilm-Imaging-Datensätzen. Dieses Setup ermöglicht die in-situ und nicht-invasive automatisierte Überwachung der Biofilmentwicklung und kann weiterentwickelt werden, um DIE OCT-Bildgebung mit Makrofotografie und Mikrosensorprofilierung zu koppeln.

Wir demonstrieren die Funktionalität des automatisierten OCT-Bildgebungssystems mit einem Flume-Experiment zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Morphogenese von phototrophen Strombiofilmen. Eine allmählich emittierende Geometrie der Flumen induzierte Gradienten in der Strömungsgeschwindigkeit entlang der Mitte des Flumes (siehe Referenz17).  Die zeitliche Entwicklung und strukturelle Differenzierung des Biofilms wurde über 18 Tage überwacht, um die Auswirkungen hydrodynamischer Bedingunge...

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Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Automatisierte 3D-Optische Kohärenztomographie zur Aufklärung der Biofilmmorphogenese über große räumliche Skalen

Mikrobielle Biofilme bilden komplexe Architekturen an Interphasen und entwickeln sich zu stark maßstabsabhängigen Raummustern. Hier stellen wir ein experimentelles System (Hard- und Software) zur automatisierten Erfassung von 3D-Datensätzen zur optischen Kohärenztomographie (OCT) vor. Dieses Toolset ermöglicht die nichtinvasive und multiskalige Charakterisierung der Biofilmmorphogenese in Raum und Zeit.

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Hier präsentieren wir ein automatisiertes System, das auf optischer Kohärenztomographie oder OCT basiert. So können wir die Struktur von Biofilmen über große räumliche Skalen oder längere Zeiträume überwachen. Die OCT-Bildgebung eignet sich gut, um Strukturen im Mikrometerbereich aufzulösen, ist jedoch derzeit auf eine maximale Fläche von etwa 250 Quadratmillimetern begrenzt.Biofilme übertreffen diese Skala oft, insbesondere wenn die Differenzierung von großen Umweltgradienten getrieben wird. Der Versuchsaufbau ermöglicht es uns, die dreidimensionale Morphogenese von Biofilmen über große räumliche Maßstäbe und längere Zeiträume zu überwachen. Das System ist schnell, präzise und arbeitet autonom.Wir untersuchten die Morphogenese von Biofilmen in Strömen, in denen sie wichtige Ökosystemprozesse vorantreiben. Das System kann jedoch verwendet werden, um Biofilme in anderen natürlichen Oder technischen Umgebungen zu untersuchen. Die Software für Positionierung, Bildaufnahme und Analyse ist in Python geschrieben.Sie sind über Jupyter Notebooks erhältlich. Dies sind benutzerfreundliche, frei verfügbare und flexible Lösungen. Wir glauben, dass die visuelle Darstellung des Setups anderen Benutzern hilft, die Installation zu reproduzieren und die Software besser zu verstehen.Wir hoffen, dass dies andere Forscher zu ähnlichen Ansätzen inspiriert. Hier finden Sie eine Übersicht über die Installation. Das System besteht aus einer Präzisionspositioniervorrichtung, der OCT-Sonde, und wird um einen Plexiglas-Flume montiert.Beginnen Sie mit der Verdrahtung des Positioniergeräts, indem Sie zusammen mit den anweisungen auf GitHub folgen. Installieren Sie den GRBL-Server, wie auf einer separaten GitLab-Seite beschrieben. Das Positionierungssystem kann nun über diese Webseite gesteuert werden; alternativ kann es über ein Python-Skript gesteuert werden, wie im bearbeiteten Beispiel gezeigt.Positionieren Sie den Computer und die OCT-Basiseinheit auf einer Bank neben dem Versuchsaufbau mit mikrofluidischen Geräten, Durchflusskammern, Flumen oder Filtersystemen. Wenn noch nicht installiert, installieren Sie das OCT-System zusammen mit der vom Hersteller beschriebenen verfügbaren Software. Installieren Sie dann die Softwarepakete für die automatisierte OCT-Scanerfassung, wie in den hier verlinkten GitLab-Dokumenten beschrieben.Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, montieren Sie die optische Kohärenztomographiesonde mit einem kompatiblen Schwalbenschwanzhalter an der Positioniervorrichtung. Installieren Sie bei Bedarf einen Tauchadapter auf der Objektivlinse, und schalten Sie dann das OCT-System und das Positioniergerät ein. Öffnen Sie die kommerzielle OCT-Software, finden Sie eine Website von Interesse, konzentrieren Sie sich auf die Probe, und passen Sie die Referenzarm- und Lichtquellenintensität für eine optimale Bildqualität an.Beachten Sie die Koordinaten und wiederholen Sie diesen Vorgang für eine Reihe von Positionen, wobei die gleiche Referenzarmlänge und -intensität beibehalten wird. Öffnen Sie die ImageAcquisition. ipynb Datei gefunden in diesem Artikel ergänzende Datei 2 in Jupyter Notebook.Jede Zelle enthält Code, um bestimmte Aufgaben auszuführen und kann separat durch Drücken von Zelle ausgeführt werden und dann ausführen oder Steuern und Eingeben oder Shift und Enter. Folgen Sie dem bearbeiteten Beispiel, um den Pfad zu den erforderlichen Bibliotheken festzulegen, um das Positioniergerät zu verbinden, um das Positioniergerät zu kalibrieren, um den OCT-Scanner zu initialisieren. Passen Sie dann die Erfassungsparameter an, einschließlich des Brechungsindexes, der Größe des Ansichtsfelds und der Anzahl der A-Scans pro B-Scan.Legen Sie außerdem die Signalgrenzen des OCT-Scans basierend auf Intensitätshistogrammen vorläufiger Scans und dem Zielordner für erfasste Daten und Metadaten fest. Je nach Sichtfeld und Auflösung kann die Dateigröße bis zu 1,5 Gigabyte pro OCT-Scan erreichen. Diese beiden Parameter bestimmen die Größe der Voxel im endgültigen Datensatz und die Größe der Ausgabedatei.Sie sollten der optischen Auflösung der OCT-Sonde entsprechen. Wie im bearbeiteten Beispiel hervorgehoben, können Sie einen einzelnen OCT-Scan mit Standardparametern oder einen einzelnen Scan erwerben, der einen anderen Satz von Parametern angibt. Sie können auch spezifische Koordinaten angeben, um das Positioniergerät zu verschieben und einen einzelnen OCT-Scan zu erfassen.Mit dieser Funktion können Sie im Experiment wiederholt mit hoher räumlicher Genauigkeit an die exakt gleiche Position zurückkehren. Die Daten werden in 8bit gespeichert. Rohformat, um Speicherplatz zu sparen.Metadaten, einschließlich der OCT-Einstellungen und -Koordinaten, werden im selben Ordner in einer json-Datei mit derselben Namenskonvention gespeichert. Alternativ können Sie eine Liste der Sehenswürdigkeiten angeben und die entsprechenden OCT-Scans automatisch erfassen. Um biofilmmorphologische Strukturen über große Umweltgradienten hinweg zu charakterisieren, erfassen Sie Scans in einem Mosaikmuster.Geben Sie hierzu die Anzahl benachbarter Kacheln mit einer Standardüberlappung von 30 % an. Die unformatierten OCT-Scans werden verzerrt angezeigt. Dies ist auf Unterschiede in der Bahnlänge durch das optische System zurückzuführen. Wir haben einen Algorithmus entwickelt, der diese Verzerrung korrigiert, wie in den bearbeiteten Beispielen gezeigt.Um mit der Bildkorrektur zu beginnen, öffnen Sie das Jupyter-Notebook ImageProcessing.ipynb. Nach diesem Beispiel schneiden Sie zuerst die OCT-Scans zu, um falsche Signale auszuschließen, und richten Sie den Datensatz neu aus, sodass der Biofilm über dem Substrat umstraallt. Als nächstes korrekt für sphärische Aberration.Um dies zu erreichen, lokalisiert der Algorithmus eine stark reflektierende flache Oberfläche im OCT-Scan und verwendet diese als Referenz, um die Scans abzuflachen. In einem 20 mal 20 Raster identifiziert der Algorithmus dann lokale Maxima in der Signalintensität, um die Referenzoberfläche zu lokalisieren. Dann wird eine Polynomoberfläche zweiter Ordnung über diese Punkte angepasst und verwendet, um jedes Pixel des OCT-Scans in Z-Richtung zu verschieben.Die Parameter dieses Algorithmus sollten an die Eigenschaften des OCT-Scans angepasst werden. Diese Korrektur ermöglicht eine homogene Referenzfläche über mehrere Bilder hinweg und erleichtert so das Nähen von großformatigen Bildern. Sobald das Bild abgeflacht wurde, werden die Bilder auf Hintergrundrauschen korrigiert, indem ein leerer Bereich des Bildes über dem Biofilm identifiziert und die durchschnittliche Hintergrundintensität subtrahiert wird.Berechnen Sie als Nächstes eine Höhenkarte aus dem 3D-OCT-Datensatz. Definieren Sie dazu eine Referenzfläche wie das Substratum, und wählen Sie einen geeigneten Intensitätsschwellenwert aus. Anschließend wird eine Höhenkarte mit der Höhe des Biofilms gerendert, der als Graustufenwert gemeldet wird.Wenn Bilder in einem Mosaikmuster erfasst wurden, heften Sie die entsprechenden Höhenkarten, indem Sie den Nähalgorithmus anwenden. Mittels automatisierter OCT-Bildgebung wurde die raumzeitliche Morphogenese phototropher Strombiofilme mittels Flume-Experimenten untersucht. Die Flammen bestehen aus Plexiglas und weiten sich nach und nach vom In bis zum Abfluss aus.Dies führt zu einem Gradienten der Strömungsgeschwindigkeit. Hier ist eine Höhenkarte eines Biofilms, der entlang des gesamten Strömungsgeschwindigkeitsgradienten wächst. Wichtig ist, dass das automatisierte OCT-Bildgebungssystem eine kontinuierliche Messung von Strukturparametern wie Biofilmdicke, Rauheit und Biovolumen unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen ermöglicht, die von niedriger Strömungsgeschwindigkeit bis hin zu Hochstromgeschwindigkeitsbedingungen reichen.Zusammen mit morphologischen Veränderungen verringerte sich das durchschnittliche Biovolumen in Abhängigkeit von der Entfernung vom Einlass im Flume signifikant. Die Qualität der OCT-Scans hängt entscheidend von der Referenzarmlänge und dem Fokusabstand ab. Möglicherweise müssen Sie diesen Parameter während der Experimente nachjustiert.Um die Genauigkeit des Positioniergeräts zu gewährleisten, denken Sie daran, regelmäßig Homing-Operationen durchzuführen. Dieses automatisierte Bildgebungsgerät lässt sich problemlos mit Mikrosensor-Profiling für eine funktionelle Charakterisierung von Biofilmen koppeln. OCT ist eine neue bildgebende Technik, und wir gehen davon aus, dass das hier vorgestellte System die Forschung zur Biofilmstruktur anregt.Dies kann für Technologien wie Trinkwasseraufbereitung oder Bioverarbeitung relevant sein.

Research

JoVE Journal

Environment

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Forschung

Umwelt

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Die Verwendung eines automatisierten Systems (GreenFeed) bis Enteric Methan und der Kohlendioxidemissionen von Wiederkäuern Überwachen

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Using Pharmacological Manipulation and High-precision Radio Telemetry to Study the Spatial Cognition in Free-ranging Animals

Mit Pharmakologische Manipulation und Hochpräzisions-Radiotelemetrie die Spatial Cognition in frei lebenden Tiere zu studieren

An animal&#39;s ability to perceive and learn about its environment plays a key role in many behavioral processes, including navigation, migration, ...

Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge

Biofilmentfernung Kohlendioxid Aerosols Verwendung ohne Stickstoffspülung

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Datenverarbeitung für seismische 3D-Bildgebung der unterirdischen Vulkane: Anwendungen der Tarim Flut Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Tracking Infiltration Front Depth Using Time-lapse Multi-offset Gathers Collected with Array Antenna Ground Penetrating Radar

Tracking-Infiltration, die vorderen Tiefe mit Zeitraffer Multi-Offset sammelt mit Array Antenne Bodenradars gesammelt

A Ground Penetrating Radar (GPR) system based on a ground-coupled, densely populated antenna array was used to collect data during an infiltration ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Split Point Analyse und Unsicherheit Quantifizierung von thermisch-optischen organischen/elementaren Kohlenstoffmessungen

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Atom Probe Tomography Analysis of Exsolved Mineral Phases

Atomsonde Tomographie Analyse von exsolved Mineral Phasen

Element diffusion rates and temperature/pressure control a range of fundamental volcanic and metamorphic processes. Such processes are often recorded in ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...