Name: human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium at JoVE.com

بتأييد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة منح P01 AI125181 و K01 DK106323 (ججي) K01 DK113043 (الاتحاد الياباني). ونحن نشكر جيمس Kaper (جامعة ميريلاند، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير كولاي سلالة HS والقولونيه. ونقدر أيضا فسيولوجيا متكامل والتصوير النوى في هوبكنز كونتي الجهاز الهضمي الأمراض الأساسية ويشغل مركز البحوث الأساسية (P30 DK089502) و "جونز هوبكنز الكتلي" والبروتينات الأساسية.

هذا البروتوكول يستند إلى الدراسات المنشورة سابقا بالمؤلفين. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 الخطوات التالية التي ينبغي أن يتم في مجلس وزراء عقيمة السلامة البيولوجية باستخدام تقنيات العقيم السليم. كافة الأساليب التي تنطوي على العينات البشرية أقرتها "المؤسسية استعراض المجلس لجامعة جونز هوبكنز مدرسة للطب" (NA_00038329 مجلس الهجرة واللاجئين).
1-معطف إدراج ثقافة الخلية مع المصفوفة خارج الخلية
<ol><li>إعداد 5 مل من محلول الكولاجين الأسهم رابعا (1 ملغ/مل) في حامض الخليك 100 مم. اسمحوا الوقوف عند 4 درجة مئوية لحوالي 4 ح الصودا الكاوية/تذوب تماما.</li>
	<li>اليكووت الكولاجين الرابع الأسهم حل وتخزين عند 4 درجة مئوية (≤ 1 في الشهر) أو-20 درجة مئوية (> 1 شهر).</li>
	<li>فورا قبل الطلاء، تمييع الحل الرابع الكولاجين الأسهم في زراعة الأنسجة المعقمة الصف المياه إلى تركيز نهائي 34 ميكروغرام/مل. 24-كذلك لوحة إدراج خلية ثقافة، معطف كل إدراج مع 100 ميكروليتر من الحل الذي يتوافق مع 10 ميكروغرام/سم2.</li>
	<li>احتضان اللوحة في قياسية CO2 زراعة الأنسجة حاضنة في 37 درجة مئوية ل ≥ 2 حاء، أو للراحة، ختم حواف اللوحة مع الفيلم البارافين واحتضان في الأسبوع بين عشية وضحاها أو 1 يصل إلى 4 درجات مئوية.</li>
</ol>2-عزل انتيرويدس/كولونويدس من الثقافة 3D
ملاحظة: انتيرويدس أو كولونويدس هي أنشئت من خزعات المانحين وأن أبقى على ثقافة 3D وفقا للبروتوكولات القياسية المذكورة سابقا. 14 , 18 بإيجاز، الأقبية يتم حصادها من الخزعات المعوية أو ريسيكتيونس عن طريق إزالة معدن ثقيل والانفعالات الميكانيكية. يتم غسلها الأقبية وتحصد ومطلي في بم. إضافة إلى الثقافة التوسع في وسائل الإعلام (كما هو موضح في الخطوة 4، 2) واستبدال كل يومين. تشكيل ثقافة 3D مرئية في غضون ساعات بعد الطلاء.
<ol><li>نضح المتوسطة الثقافة من لوحة 24-جيدا واستبدال مع الحل 1 مل الحصاد المثلج (انظر الجدول للمواد) كل بئر.</li>
	<li>استخدام مكشطة خلية مصغرة لإزاحة وتفكك بيليه مصفوفة غشاء الطابق السفلي، مع إيلاء اهتمام خاص لأي مادة قرب الحواف جيدا.</li>
	<li>تحرض على لوحة على شاكر مداري في حوالي 200 لفة في الدقيقة، 4 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة.</li>
</ol>3-فصل 3D انتيرويدس/كولونويدس
<ol><li>استخدام ماصة قناة واحدة P200 أو ماصة متعدد القنوات مزودة العقيمة تصفية نصائح إلى تريتوراتي تعليق خلية.</li>
	<li>تجمع رفع الخلية في قنينة مخروطية 15 مل. استخدام قارورة متعددة إذا كان تعليق إجمالي حجم > 6 مل.</li>
	<li>إضافة وحدة تخزين متساوية من DMEM/F12 المتقدمة المتوسطة التي تحتوي على 10 مم هيبيس، ديبيبتيدي ل-alanyl-L-الجلوتامين (س 1) والبنسلين-ستربتوميسين (س 1) (غسل المتوسطة). عكس الأنبوب 3-4 مرات لخلط. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية.<ol>
<li>اختيارياً، نضح المتوسطة المياه والصرف الصحي واستبدال مع 0.5 مل/بئر التربسين (انظر الجدول للمواد). ريسوسبيند كولونويدس مع ماصة P200 وكاب الأنبوب ووضع في حمام مائي 37 درجة مئوية لحوالي 2 دقيقة فورا إزالة الأنبوب، وإضافة يغسل المتوسطة إلى وحدة تخزين نهائي من 10 مل، وتكرار استخدام الطرد المركزي كما هو الحال في "الخطوة 3، 3". ملاحظة: قد تكون هذه الخطوة الأفضل إذا تريتوريشن لا يؤدي إلى شظايا موحد الحجم.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-طلاء تعليق انتيرويد/كولونويد
<ol><li>إذا تم تخزين إدراج المغلفة عند 4 درجة مئوية، حجته في 37 °C/5% CO2 زراعة الأنسجة حاضنة لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل طلاء الخلية.</li>
	<li>لكل إدراج يكون مطلي، إعداد 1 مل توسيع الحارة (بين 25-37 درجة مئوية) متوسطة (م) وإضافة 10 ميكرومترات Y-27632 و 10 ميكرومترات شير 99021. ملاحظة: م تتألف من متقدمة DMEM/F12 المحتوية على B27 (س 1)، 50% WNT3A مكيفة المتوسطة، والمتوسطة RSPO1 مكيفة 15%، 10% رأس مكيفة متوسط، 50 نانوغرام/مل لو البشرية، 500 نانومتر A-83-01، 10 ميكرومترات SB 202190، المضادات الحيوية/فطري كوكتيل (س 1)، 10 مم حبيس، ديبيبتيدي ل-alanyl-L-الجلوتامين (س 1) والبنسلين-ستربتوميسين (س 1) (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>نضح المتوسطة يغسل من الأنبوب الذي يحتوي على خلية بيليه وريسوسبيند في وحدة م كافية لتعطي على الأقل 100 ميكروليتر/إدراج.</li>
	<li>نضح الحل الرابع الكولاجين من كل إدراج ويغسل مرتين مع 150 ميكروليتر من المتوسطة غسل كل إدراج.</li>
	<li>بيبيت 600 ميكروليتر م في الفضاء تحت كل إدراج.</li>
	<li>بيبيت 100 ميكروليتر تعليق خلية في كل إدراج.</li>
	<li>العودة اللوحة للحاضنة زراعة الأنسجة وترك دون عائق لمالا يقل عن 12 ح. ملاحظة: تجنب المصافحة أو شدة إمالة لوحة لمنع التوزيع غير المتكافئ للشظايا كولونويد على الغشاء إدراج.</li>
	<li>رصد المرفق الخلية وينتشر بشكل أحادي الطبقة المتلاقية بوضع اللوحة على مجهر تباين مرحلة خفيفة تحت 2.5 x-10 x عدسة الهدف.</li>
	<li>وبعد أيام 1-2، ينبغي أن تلتزم معظم الشظايا المصفوفة الكولاجين. تحديث المتوسط الثقافة والتوقف عن العلاج مع Y-27632 وشير 99021. الاستمرار في تحديث المتوسط كل 2-3 أيام حتى روافد. عموما يتم التوصل إلى كونفلوينسي في 7-10 أيام.</li>
</ol>5-قياس المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال
<ol><li>قم بإرفاق مسرى الخيوط والطاقه في فولتوهميتير الظهارية (افوم). تحقق من أن يتم تعيين دالة القياس أوم.</li>
	<li>تراجع نصائح القطب بإيجاز في الإيثانول 70% والقضاء على الجفاف مع أنسجة مختبرية. حجته مسرى في 5 مل من غسل المتوسطة لمدة 5 دقائق تقريبا.</li>
	<li>تزج نصيحة القطب أقصر في الأجلين المتوسط وإدراج وتوجيه نصيحة القطب أطول في اللوحة السفلي جيدا. الحفاظ على مسرى في اتجاه عمودي كامل حتى يتم قراءة افوم مستقرة نسبيا، أو لمدة لا تزيد على 60 ثانية. ملاحظة: إذا إمالة الجمعية القطب بعيداً عن العمودي، أو غير سليمة يتم ضبط ارتفاع الحافة، أقصر نصيحة قد تأتي في اتصال مع وتعطيل أحادي الطبقة الخلية.</li>
	<li>مقارنة القياسات افوم للقيمة التي تم الحصول عليها من إدراج خلية خالية غارقة في الثقافة المتوسطة لتقييم التقدم المحرز تجاه كونفلوينسي أو التفريق.</li>
</ol>6-التفريق بين المتلاقية انتيرويد/كولونويد مونولاييرس
<ol><li>تبادل م للتمايز المتوسطة (مارك ألماني)، والاستمرار في تحديث وسائل الإعلام كل يومين حتى يوم 5. مارك ألماني هو م التي تفتقر إلى WNT3A، RSPO1، ألف-83-01، وس. ب 202190.</li>
	<li>مواصلة رصد مكررا ثانيا للتحقق من أن التمايز يسير كما هو متوقع. ثالثا ستواصل زيادة خلال الأيام 1-5 من التفريق. قد يستمر مونولاييرس زيادة تير والاحتفاظ بالبقاء إلى ما بعد يوم 5-6 ولكن يحمل النتائج القصوى واستنساخه بآخر عند استخدامها في يوم 5-6.</li>
</ol>7-البكتيرية عدوى المسببة للأمراض أو كومينسال كولاي
<ol><li>أغسل يوم واحد قبل القيام بالعدوى، وتغذية مونولاييرس مع م خالية من المضادات الحيوية أو مارك ألماني.</li>
	<li>استخدم حلقة الأحياء المجهرية عقيمة بلطف كشط سطح الأوراق المالية المجمدة والغليسيرول البكتيرية وتطعيم 2 مل مرق رطل. نقل الأنبوب إلى معيار تهز حاضنة في 37 درجة مئوية ح 12-16.</li>
	<li>تمييع 50 ميكروليتر من ثقافة كاتب إلى 5 مل مرق LB الطازجة (1: 100)، وتستمر الحضانة مع الرج ل 90 دقيقة. وهذا سوف تسفر عن ثقافة مرحلة سجل بكثافة 105-106 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي)/مل.<ol>
<li>اختيارياً، تأكيد تركيز البكتيريا بقياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) في جهاز المطياف الضوئي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تدور أسفل ثقافة البكتيرية في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق وإزالة المادة طافية ريسوسبيند البكتيريا في م خالية من المضادات الحيوية أو مارك ألماني إلى تركيز نهائي لزيمبابوى7 10/مل.</li>
	<li>إضافة 10 ميكروليتر من تعليق البكتيرية للإدراج (تركيز نهائي 106 زيمبابوي/mL). بيبيت ببطء لخلط وتجنب الإخلال بطبقة المخاط خارج الخلية.</li>
	<li>العودة اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة لفترة الإصابة المرجوة.</li>
</ol>8-تثبيت للمخاط المحافظة وإيمونوستين
<ol><li>رفع إدراج خلية ثقافة من لوحة 24-جيدا، وعكس بعناية على ورقة مختبر أنسجة إزالة المتوسطة قمي، ومسح السائل الخارجي بعيداً التشبث الإدراج.</li>
	<li>في صفيحة 24-بئر جديدة، تزج الإدراج في حل 1:3 من حامض الخليك الجليدية في الإيثانول المطلق (حل كلارك) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>عكس الإدراج إزالة مثبت وترطيب الخلايا في برنامج تلفزيوني x 1 للحد الأدنى 10 المضي قدما مع البروتوكولات القياسية إيمونوستينينج.</li>
	<li>استخدام شفرة الحلاقة لقص حول محيط الغشاء إدراج. نقل الغشاء على شريحة مجهر زجاج باستخدام الملقط وإلصاق كوفيرجلاس مع تصاعد المتوسطة.</li>
</ol>9-إعداد ليساتيس خلية إيمونوبلوتينج
ملاحظة: الخطوات التالية على الجليد أو في غرفة باردة.
<ol><li>نضح إدراج متوسطة الحجم ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>إضافة 150 ميكروليتر تحلل العازلة التي تحتوي على مبطلات مثبطات (انظر الجدول للمواد) للإدراج واسمحوا الوقوف دقيقة 5-10 يحتوي المخزن المؤقت لتحلل 50 مم تريس pH 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% CA إيجيبال-630، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5%، 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي، 1: 100 حوزتي المانع كوكتيل.</li>
	<li>استخدام مكشطة خلية مصغرة لإزالة الخلايا من الإدراج، ثم استخدم ماصة P200 إلى تريتوراتي بإيجاز إلى تعليق ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.</li>
	<li>Sonicate التعليق مع 5 × 1 s البقول في السعة 20% من ميكروتيب باستخدام التحقيق (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>إضافة تحميل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت إذا كان القيام فورا بالتفريد أو قاسمة وتخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13, 633-642 (2016).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+stimulates+a+complex+physiological+response+in+the+immature+human+intestinal+epithelium.">Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium.</a> eLife. 6, e29132 (2017).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology.">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+Toxin+Production+by+Clostridium+difficile+within+Human+Intestinal+Organoids+Result+in+Disruption+of+Epithelial+Paracellular+Barrier+Function.">Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function.</a> Infection and Immunity. 83, 138 (2015).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids+as+a+Model+of+Upper+Small+Intestinal+Ion+Transport+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150, (2016).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+and+Differentiation-Associated+Alterations+of+Anion+Secretion+in+Human+Duodenal+Enteroid+Monolayers.">Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).</li><li>Tse, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+E.+coli+(EHEC)&#8212;Secreted+Serine+Protease+EspP+Stimulates+Electrogenic+Ion+Transport+in+Human+Colonoid+Monolayers.">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)&#8212;Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers.</a> Toxins. 10, 351 (2018).</li><li>Jabaji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+collagen+gel+as+an+alternative+extracellular+matrix+for+the+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+murine+small+intestinal+epithelium.">Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+Monolayer+of+Primary+Colonic+or+Rectal+Epithelial+Cells.">Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64, 911 (2015).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell&#8211;derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell&#8211;derived human enteroids.</a> Science. 353, 1387 (2016).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+a+Human+and+Mouse+Intestinal+Epithelial+Cell+Monolayer+Platform.">Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform.</a> Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).</li><li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Reduces+Mucus+and+Intermicrovillar+Bridges+in+Human+Stem+Cell-Derived+Colonoids.">Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions.">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270 (2017).</li><li>Vernetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Coupling+of+Human+Microphysiology+Systems:+Intestine,+Liver,+Kidney+Proximal+Tubule,+Blood-Brain+Barrier+and+Skeletal+Muscle.">Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle.</a> Scientific Reports. 7, 42296 (2017).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterotoxigenic+Escherichia+coli+is+phagocytosed+by+macrophages+underlying+villus-like+intestinal+epithelial+cells:+modeling+ex+vivo+innate+immune+defenses+of+the+human+gut.">Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut.</a> Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon,+Adenoma,+Adenocarcinoma,+and+Barrett's+Epithelium.">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Johansson, M. E. V., Sj&#246;vall, H., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+mucus+system+in+health+and+disease.">The gastrointestinal mucus system in health and disease.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 10, 352-361 (2013).</li><li>Hews, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+StcE+metalloprotease+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+reduces+the+inner+mucus+layer+and+promotes+adherence+to+human+colonic+epithelium+ex+vivo.">The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo.</a> Cellular Microbiology. 19, e12717 (2017).</li><li>Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+type+IV+collagen,+laminin,+heparan+sulfate+proteoglycan,+and+fibronectin+to+the+basal+lamina+of+basement+membranes.">Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 95, 340 (1982).</li><li>Timpl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+basement+membranes.">Macromolecular organization of basement membranes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).</li><li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+colonic+epithelium+adheres+to+carcinoembryonic+antigen+and+type+IV+collagen.">Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen.</a> Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).</li><li>Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagens+facilitate+epithelial+migration+in+restitution+of+native+guinea+pig+intestinal+epithelium.">Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium.</a> Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Organ-on-a-Chip+Models+of+Human+Intestine.">Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تتضمن معلمات الحاسمة لنجاح تشكيل مونولاييرس انتيرويد/كولونويد 1) صحية، تنتشر 3D الثقافات بداية من المواد؛ 2) طلاء السطح إدراج ثقافة الخلية مع الكولاجين البشرية الرابع قبل البذر أحادي الطبقة؛ 3) تجزؤ 3D الثقافات أما ميكانيكيا أو انزيماتيكالي، ولكن ليس على مستوى الخلية الواحدة.
أثناء عزلة 3D انتيرويدس/كولونويدس، يمكن أن تختلف سرعة الهز الأمثل حسب القطر التناوب من نموذج معين شاكر. القصد هو ليس فقط تحرض اللوحة للاختلاط كفاءة، ولكن أيضا تجنب الرش تعليق خلية على غطاء لوحة أو في الآبار المجاورة. قد تسفر عن فترات حضانة من < 30 دقيقة متبقية بم التشبث بالخلايا، والتي يمكن أن تعوق مرفق وتشكيل خلية موحدة مونولاييرس عند مطلي بشأن إدراج. حضانة واسعة النطاق (≥ ح 1) سوف تسفر عن بقاء الخلية انخفض إلى حد كبير.
يمكن أن تختلف مدى تريتوريشن المطلوبة لفصل 3D انتيرويدس/كولونويدس مع براعة المكبس المستخدم وصلابة. لتحديد جزء من التوحيد خلال تريتوريشن، بهدف خلايا حوالي 30 كل جزء يوصي بالفحص الدوري لمحتويات جيدا في مجهر تباين مرحلة خفيفة. التعليق بدلاً من، أو بالإضافة إلى تريتوريشن، يمكن هضمها بإيجاز مع التربسين للحصول على أصغر أجزاء موحدة. قد يكون من المستصوب إذا مونولاييرس تحتوي على نسبة كبيرة من هياكل مثل 3D بين طبقة طلائي إلا واحد هضم التربسين. الانفصال إلى خلايا مفردة غير مرغوب فيه، وهذا يقلل بشكل ملحوظ بقاء الخلية. بئر واحدة من انتيرويدس/كولونويدس المستزرعة في معالجة تجميعية بم ميكروليتر 35 يكون بصورة عامة ما يكفي لملء إدراج 2-3، ولكن هذا العامل يمكن أن تختلف تبعاً لعدد وحجم متوسط من انتيرويدس/كولونويدس.
مونولاييرس كولونويد قد استيعاب حجم كبير من المتوسط قمي كما أنها تفرق. وهذا يمكن التحايل عليها بتطبيق إضافية مارك ألماني إلى الدائرة إدراج العلوي (150-200 ميكروليتر)، على الرغم من أن تجفيف مجلس الشيوخ لا يبدو أن تؤثر سلبا على سلامة أحادي الطبقة أو دالة في الاختبارات النهائية. بعد حوالي 4-5 أيام للتمايز، وضع مونولاييرس كولونويد المخاط خارج الخلية التي قد تكون مرئية كمواد هلامية/سميكة على سطح الخلية بعد تطلع حذراً من مارك ألماني.
القولونية التفاعل مع طبقة المخاط الخارجي، نستخدم بشكل روتيني البكتيرية عيار والحضانة الفترة المحددة في البروتوكول. ومع ذلك، ينبغي في البداية جزيئي السلالات البكتيرية فريدة من نوعها في تركيزات متعددة وفترات حضانة لتحديد المعلمات المناسبة للتأثير المطلوب.
أثناء تثبيت المخاط، يسفط المتوسطة قمي المحتمل سيزيل معظم طبقة المخاط فاتحة خارج الخلية. ولذلك، من المهم أن صب بدقة المتوسطة. إذا كان يتم الاحتفاظ المتوسطة في الإدراج بالتوتر السطحي، استخدام الركن من الأنسجة المختبرية مطوية لكسر التوتر السطحي والفتيل بعيداً أكثر من المتوسط. بعد التثبيت وتلطيخ، يمكن عن غير قصد فكها طبقة المخاط أو سويت بالأرض بينما تصاعد كوفيرجلاس على إدراج عامل التصفية. للحفاظ على ارتفاع المخاط، وضع عامل التصفية على قطره من تركيب وسائط ووضع بعناية كوفيرجلاس على عامل التصفية. لا انقر أو اضغط على كوفيرجلاس كهذا قد تتسطح إلى حد كبير في طبقة المخاط.
بشكل أحادي استقطاب الطبقة من الخلايا في ثقافة 3D، من الضروري أن تستنسخ التفاعل بين basolateral integrins غشاء الخلايا الظهارية المعوية والبروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). رابعا الكولاجين وفيبرونيكتين، Laminin ومجموعة من بروتيوجليكانس تشكل ECM الظهارية المعوية. 21 , 22 قارنا laminin المستمدة من الخلايا البشرية، فيبرونيكتين، الكولاجين الرابع، والمستمدة من الفاري بم كإدراج الطلاء. فقط الكولاجين الرابع يؤيد تشكيل مستقر وطويل الأجل (تصل إلى 4 أسابيع) مونولاييرس انتيرويد/كولونويد المتلاقية (الأرقام 1-2). وتم الحصول على بقع صغيرة من أحادي الطبقة مثل النمو في كل من اختبار المصفوفات الأخرى، ولكن فشلت هذه المناطق للتقدم إلى كونفلوينسي. استخدام الكولاجين البشرية الرابع كمركب ECM لديها عدد من المزايا. بم المستمدة من انجيلبريث-هولم-سرب (EHS) الخلايا ساركومه مورين ليسوا من أصل البشرية، بينما الكولاجين البشرية الرابع عموما أكثر فعالية من حيث التكلفة والمتاحة تجارياً. بالإضافة إلى ذلك، بم هو خليط معقد من البروتينات مع تقلب الملازمة، وقد تحتوي على عوامل النمو التي يفرزها ساركومه التي تؤثر على التعبير الجيني. 23
التفاعلات بين الخلايا الظهارية المعوية والمحتوى الأساسي في رد الظهارية المعوية المفهوم لا يزال غير كامل. وقد اقترح أهمية الكولاجين الرابع، ولكن لا لامينين، بوصفها يجند التصاق كولونوسيتيس البشرية24 ومحسن للخلايا الظهارية المعوية سرداب رد25 استخدام الأجسام المضادة ضد الكولاجين الرابع التي حالت دون المرفقات . أعرب طلائي β1-إنتغرين يبدو هاما لتفاعل إدارة المحتوى في المؤسسة، كما حظر جسم معين ل β1-إنتغرين كثيرا انضمام كولونوسيتيس نوع الكولاجين الرابع. 24 بينما يوفر الكولاجين الرابع إدارة المحتوى في المؤسسة موثوق بها لأحادي الطبقة انتيرويد/كولونويد تشكيل على إدراج، الظهارية يعيد البناء من إدارة المحتوى في المؤسسة مرور الوقت ما لم يقيم في هذا النموذج، ولا له تأثير خلائط ECM أكثر تعقيداً ومحددة من الكولاجين الرابع، لامينين، وفيبرونيكتين.
انتيرويدس/كولونويدس البشرية في شكل أحادي الطبقة (الأرقام 1-4) تمكين التلاعب وأخذ العينات التي ستكون مرهقة أو من المستحيل تحقيق استخدام الثقافات جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ثلاثية الأبعاد. 3D انتيرويدس/كولونويدس تختلف في الحجم والتعقيد الهيكلي، وحجم لومينال، وهكذا يصعب microinjection ميكروبات أو جزيئات صغيرة من كوانتيتاتي بدقة. خلافا مونولاييرس (الجدول 1)، بالإضافة إلى ذلك، منع الثقافات 3D الوصول المباشر إلى الأسطح لومينال وباسولاتيرال لقياس الأيونات، والعناصر الغذائية، السيتوكينات أو يفرز العوامل المرتبطة بالعمليات الفسيولوجية أو باثوفيسيولوجيك . كونفلوينسي (الأرقام 1-2) واحدة من الخصائص الرئيسية لأحادي الطبقة انتيرويد/كولونويد اللازمة لوضع ليس فقط التدرجات الفسيولوجية للمواد الغذائية، والايونات، والأخرى الجزيئات،16 ولكن أيضا إنشاء الحاجز السليم بين الحجمية لومينال والوسيطة/المناعة العقيمة المأهولة بالخلية من بيئات سيرسال. هذه الجوانب هامة للنظر في الدراسات المستقبلية التي تتضمن مونولاييرس انتيرويد/كولونويد مع أنواع الخلايا الوسيطة، ومحصنة، أو العصبية لبناء نماذج الفسيولوجية أكثر تعقيداً.
تشمل القيود لاحظ نموذج إدراج ثقافة الخلية الموصوفة هنا عدم وجود القوات المادية مثل السوائل القص إجهاد وتمتد الميكانيكية/ضغط (التمعج)، وعدم وجود بيئة قمي اللاهوائية عادة من ذوي الخبرة بالامعاء المجراة في ابيثيليا. هذه العناصر لها القدرة على معالجة أكثر تطورا من منصات ميكروفيسيولوجيكال،26 ولكنها تتطلب أيضا نفقات إضافية، والمعدات والخبرة اللازمة لتنفيذ. 3D وأحادي الطبقة الثقافات أيضا دون المساهمات من ميكروبيومي المعوية، والسكان الخلية اللحمية، والجهاز المناعي أو التفاعلات مع ما لم يتم إضافة هذه المكونات هادف.
التطبيقات المستقبلية المونولاير انتيرويد/كولونويد على إدراج الثقافة الخلية المغلفة بالرابع الكولاجين قد تشمل دراسات أخرى للتفاعل الميكروبية المسببة للأمراض أو commensal، الإقبال على المخدرات أو المواد الغذائية، وسمية، والايض، وظيفة الحاجز، والوظيفية تعزيز تحفزها ثقافة المشارك مع أنواع إضافية من الخلايا المعوية. ويمكن إجراء تقييمات ليس فقط داخل epithelia المانحين صحية ولكن أيضا من الأفراد مع الطفرات الوراثية أو الاضطرابات المعوية، شريطة أن تعمل المجراة في إنشاء للاحتفاظ بها في السابقين فيفو انتيرويد/كولونويد الثقافة.

أورجانويدس المعوية، وانتيرويدس، وكولونويدس أدت إلى العديد من أوجه التقدم في فهم سلوك الخلايا الجذعية، ووظيفة الحاجز والنقل والتنمية المعوية والتمايز الخلوي. 1 ولكن الثقافة 3D يحد دراسة التفاعل الظهارية الممرض المضيف التجويف غير قابل للوصول مباشرة للبكتيريا أو عوامل الفوعة ما لم يتعرض الهياكل المغلقة إلى microinjection. 2 , 3 بالإضافة إلى ذلك، يفرز مواد مثل الجزيئات الصغيرة، البروتينات، أو لا يمكن تذوق المخاط بسهولة من الثقافة ثلاثي الأبعاد لتحليل المتلقين للمعلومات. وقد تم تقييم أثر العوامل المسببة للأمراض في الحاجز الظهارية الدالة4 وأيون النقل5 في الثقافة ثلاثي الأبعاد باستخدام الأصباغ الفلورية والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، ولكن مونولاييرس نمت على نفاذية الأنسجة الثقافة يدعم قابلة تقنيات إضافية مثل تير قياس وتسجيل المشبك الدائرة/التيار الكهربائي أوسينج. 6 , 7
وقد وصف العديد من المنشورات البروتوكولات للثقافة 2D أو أحادي الطبقة من انتيرويدس/كولونويدس. وتشمل المواد التي وجدت لتعزيز مرفق الخلايا الظهارية الكولاجين الهلاميات المائية، الجيلاتين 0.1%9 8،،10 طبقة رقيقة مورين المستمدة من ساركومه الغشاء مصفوفة (بم)،،،من1112 13 والكولاجين البشرية الرابع. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 وتشمل النهج استمطار تجزئة الميكانيكية التي بيبيتينج6،،من1415 و/أو الانفصال من عوامل التصاق الخلية باستخدام التربسين،،من1011 ديسباسي،13 أو يدتا. 9 استخدام بروتوكولات قليلة بلاستيكواري زراعة الأنسجة غير المسامية للبذر، ولكن هذا يقيد الوصول باسولاتيرال، حيث معظم تطبيقات تعتمد على إدراج نفاذية زراعة الأنسجة. الوثائق المتعلقة بتشكيل المونولاير المتلاقية مستقرة وصيانة تفاوتاً كبيرا فيما بين المنشورات. بالإضافة إلى ذلك، التراكيب وسائط النمو والتمايز للثقافات الإنسانية تختلف فيما بين مختلف المجموعات، وتستمر في التطور باعتماد المزيد من الباحثين وضبط المنهجية لتناسب التطبيق والموارد المتاحة.
ولمعالجة أوجه قصور الثقافة الظهارية المعوية 3D في دراسات التفاعل المضيف الممرض، نقدم بروتوكول تعديل لتحويل 3D انتيرويدس البشرية أو كولونويدس إلى أحادي الطبقة. بعد تحقيق كونفلوينسي في سرداب مثل دولة غير ناضجة، والانسحاب من عوامل النمو WNT3A، و RSPO1، ومثبطات 202190 س وألف-83-01 يؤدي إلى تمايز الممثل زغابة معوية صغيرة أو ظهارة colonic السطحية. يصف لنا مصفوفة مثالية، الكولاجين البشرية النوع الرابع، معطف إدراج والحصول على شظايا انتيرويد أو كولونويد موحدة للطلاء. نظهر أن ينتج هذا البروتوكول أحادي الطبقة المتلاقية مع ارتفاع مونولاييرس كولونويد مكررا تفرز طبقة سميكة مخاط قمي، مما يسمح لدراسات السابقين فيفو مخاط الممرض التفاعل عن طريق إيمونوبلوتينج أو إيمونوستينينج. ويرد أيضا إجراء تعديل تثبيت للحفاظ على طبقة المخاط colonic إيمونوستينينج. هذا الأسلوب يهدف إلى توفير نموذج المرونة دراسة التفاعلات المعوية المضيف-الممرض أقرب إلى الإصابة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Tris base, Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>ALK4/5/7 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Fluorescent probe for F-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic cocktail</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td>Primocin (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27, 50x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Transwell, PET membrane, 0.4 &#956;m pore, 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>GSK3&#946; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Depolymerizes basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain HS</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorSave mounting medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>345789</td>
			<td>For mounting insert membrane on microscope slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/Noggin-Fc cell line</td>
			<td>van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research</td>
			<td></td>
			<td>For production of Noggin conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td>For production of Rspondin-1 conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Fluorescent nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted cell culture light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WNT3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>For production of Wnt3a conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix for 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cell scraper</td>
			<td>United BioSystems</td>
			<td>MCS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 antibody, mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11197</td>
			<td>Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 shRNA lentiviral particles</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>RHS4531</td>
			<td>GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>PSU-10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator with microtip</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for mammalian cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td>p38 MAPK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dexoycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express, 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody, rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, tissue culture grade, sterile filtered</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>RhoA/ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium

3-الأبعاد (3D) انتيرويد أو كولونويد الثقافات الإنسانية المستمدة من الخلايا الجذعية قاعدة القبو حاليا السابقين فيفو النموذج الأكثر تقدما من ظهارة الأمعاء. بسبب هياكلها مغلقة والمصفوفة خارج الخلية الداعمة الهامة، 3D الثقافات ليست مثالية للدراسات المضيف الممرض. انتيرويدس أو كولونويدس يمكن أن تزرع مونولاييرس الظهارية في زراعة الأنسجة نفاذية الأغشية للسماح للتلاعب على حد سواء لومينال وأسطح الخلية باسولاتيرال والسوائل المرافقة. وييسر هذا الوصول السطحية لومينال المعززة نمذجة التفاعلات البكتيريا المضيفة طلائي مثل القدرة المهينة المخاط من انتيروهيمورهاجيك كولاي (الإشريكيّة) على ظهارة colonic. ويرد وصف طريقة لتجزئة الثقافة 3D، وبذر أحادي الطبقة، وقياسات المقاومة الكهربية (ثالثا) ترانسيبيثيليال لرصد التقدم المحرز نحو كونفلوينسي والتمايز. كولونويد أحادي الطبقة التمايز غلة يفرز المخاط التي يمكن دراستها باستخدام تقنيات الفلورة أو إيمونوبلوتينج. وبصورة أعم، تمكن مونولاييرس انتيرويد أو كولونويد منصة ذات صلة بالناحية الفسيولوجية لتقييم السكان الخلية المحددة التي قد تكون مستهدفة من قبل الحجمية المسببة للأمراض أو كومينسال.

الثقافات انتيرويد وكولونويد البشرية نمت كهياكل ثلاثية الأبعاد، ثم فصلها ومجزأة للطلاء على إدراج الثقافة الخلية المغلفة بالرابع الكولاجين البشرية. هو بسهولة رصد التقدم المحرز تشكيل المونولاير يوميا عبر الحقل مشرق مجهرية، الفلورة تلطيخ (الشكل 1)، وزيادة مطردة في المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال (ثالثا) (الشكل 2)، مما يعكس نفاذية تقاطعات ضيق للايونات ويرتبط مع كونفلوينسي أحادي الطبقة. ثالثا من إدراج 24-بئر فارغة حوالي 50-100 Ω·cm2، وعند الوصول إلى كونفلوينسي يزيد إلى حوالي 400-500 Ω·cm2. كافة الخلايا الظهارية في مونولاييرس المتلاقية ترتبط بهالة مجمعات الكشف عنها بواسطة الطوق واكتين في محيط الخلية (الشكل 1). تمثل مونولاييرس في وسائل الإعلام عامل النمو الكامل ظهارة مثل سرداب التكاثري تتألف أساسا من نشاط تقسيم الخلايا التي تتضمن نوكليوزيد إيدو التناظرية (الشكل 2). انسحاب عوامل النمو WNT3A و RSPO1 يعزز التمايز، مما يؤدي إلى الثقافات الزوائد الشبيهة التي تفتقر إلى تكاثر الخلايا. تحتوي على انتيروسيتيس (انتيرويدس) أو كولونوسيتيس (كولونويدس) مونولاييرس المتباينة ووضع الخلايا الظهارية المعوية المتخصصة كما تبين في 3D الثقافات،18 بما في ذلك الخلايا قدح وانتيروندوكريني. 15 مونولاييرس المتباينة كما تبين زيادة كبيرة في ثالثا (> 1000 Ω·cm2) (الشكل 2)، مما يشير إلى تقاطعات ضيق ناضجة.
في الفسيولوجيا البشرية العادية، يفصل الطبقة الظهارية المعوية المغذيات والفضاء لومينال أثري ميكروب من البيئة سيرسال العقيمة. وينظم الظهارة محكم عبر الحديث بين هذه الأقسام اثنين. مونولاييرس انتيرويد وكولونويد المحافظة على هذه الممتلكات تجزئة الهامة كما يتضح من تحليل البروتين في الجدول 1- هناك اختلافات جوهرية بين تكوين البروتين في قمي ومكيفة basolateral الوسائط التي تم جمعها من مونولاييرس انتيرويد المتباينة. يسمح الوصول إلى كلا الجانبين قمي وباسولاتيرال لجمع كل سوبيرناتانتس بطريقة تعتمد وقت لقياس إفراز التفاضلية للجزيئات الأخرى مثل السيتوكينات والمستقطبات. 15 , 17
مونولاييرس نماذج مريحة واستنساخه بدرجة عالية للكشف عن التغييرات في التعبير البروتين باستخدام إيمونوبلوتينج وإيمونوستينينج. وهكذا، يتغير في الميوسين 2 (MUC2) التعبير بضربه قاضية شرنا (دينار كويتي) يمكن الكشف عنها باستخدام كلا التقنيتين (الشكل 3). كان يؤديها في كولونويدس 3D تنبيغ شرنا وصيانتها في وسائل الإعلام اختيار المضادات الحيوية. بعد التحقق من دينار كويتي، يمكن باستمرار الإبقاء كثقافات 3D كولونويدس أو مطلي بوصفها مونولاييرس لأغراض تجريبية. وعلاوة على ذلك، MUC2 د. ك لا يؤثر على كفاءة تشكيل المونولاير مقارنة بخط كولونويد الأبوية نوع البرية. مجموعة من مونولاييرس إيمونوبلوتينج بسيط ومشابه للبروتوكولات ووصف لخطوط الخلايا الظهارية البشرية المستمدة من غدية. وعادة، ما يقرب من 50 ميكروغرام أو أكثر من مجموع البروتين يمكن أن تستخلص من المونولاير نابعة من إدراج2 سم 0.33 واحد. كما هو موضح في الشكل 3، قابلاً للاكتشاف بالكاد في وزن (UD) غير متمايز كولونويد مونولاييرس MUC2 لكن يتم التعبير عن درجة عالية في متمايزة WT (مدافع) مونولاييرس. MUC2 أقل من مستوى الاكتشاف في المكتب المصغر ومدافع مونولاييرس كولونويد ترانسدوسيد مع MUC2 شرنا.
الأهم من ذلك، مونولاييرس نموذج مناسب لدراسة تفاعلات المضيف للميكروبات في السطح قمي ابيثيليا. مونولاييرس كولونويد تشكل طبقة مخاط MUC2 إيجابية مرفقة سميكة على التفريق الذي هو لا تتغلغل بسهولة من كومينسال البكتيريا كولاي HS (الشكل 4)، مماثلة لما قيل في القولون البشرية العادية. 19 ولكن انتيروهيمورهاجيك كولاي (الإشريكيّة)، ممرض colonic بشرية، قد ثبت لديهم القدرة على تدمير طبقة المخاط المرفقة أثري MUC2 لتصل إلى سطح قمي الظهارة (الشكل 4). 14 , 20 MUC2 المتبقية موجودة فقط داخل الخلايا قدح.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg"> رقم 1: إنشاء البشرية انتيرويد/كولونويد مونولاييرس- (أ) مثال كولونويد شظايا بعد انحلال بم وتريتوريشن. (ب) مثال لإدراج فورا بعد طلاء شظايا كولونويد. مقياس بار (أ-ب) = 200 ميكرومتر. الممثل الإسقاط أقصى شدتها (ج) و (د) [كنفوكل] بصري ض-قسم مع الإسقاطات متعامد المقابلة تبين أن شظايا كولونويد المصنف إلى الكولاجين البشرية النموذج الرابع المغلفة مرشحات متعددة أحادي الطبقة جزر 2-4 أيام بعد البذر. المناطق الخالية من الخلية (العلامة النجمية) يمكن تمييزها بسبب غياب سواء النووية (هويشت 33342، الأزرق) وتلطيخ قمي واكتين (فالويدين) الخضراء في جيم ودال الممثل الإسقاط أقصى شدتها (ه) و (و) [كنفوكل] بصري إظهار المقطع مع الإسقاطات متعامد المقابلة أحادي الطبقة كولونويد المتلاقية مع سطح قمي المستمر الكشف عنها بواسطة أكتين و إيمونوستينينج 1 أسبوع تقريبا بعد البذر. (ز) إظهار التكبير عالية (ح) قسم البصري [كنفوكل] مع الإسقاطات متعامد المقابلة والإسقاط الممثل أقصى شدتها أن تشكل الخلايا في مونولاييرس كولونويد متكدسة بيريجونكشونال واكتين حلقات (السهم الأبيض) وإلى حدود فرشاة قمي غير ناضجة (رؤساء السهم الأصفر). مقياس بار (ج-ح) = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg"> رقم 2: تقييم للتمايز أحادي الطبقة انتيرويد/كولونويد. (أ) إدماج إيدو (أحمر) يوضح فقدان تدريجي للانتشار خلال التمايز أحادي الطبقة جيجونال. (ب) "مكررا ثانيا متوسط" القياسات في مونولاييرس jejunal متكدسة في وسط توسع أو التفريق. أشرطة الخطأ تمثل UD sem.، متمايز؛ مدافع، متباينة. أرقام تناظر يوما بموجب الشرط المحدد؛ UD1 هو أول يوم من كونفلوينسي، 1 أسبوع تقريبا بعد البذر. (ج) قد أإن جيجونال مونولاييرس خلايا واسعة وأقصر وحدود فرشاة المستندة إلى أكتين قمي أقل نضجاً من مدافع يوم 5 جيجونال مونولاييرس. مقياس بار (أ، ج) = 50 ميكرومتر. جميع مونولاييرس وقد صورت مدتها أسبوع واحد على الأقل بعد البذر والمتلاقية قبل بدء المفاضلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg"> الشكل 3: كولونويدس نوع البرية وشرنا ترانسدوسيد كولونويدس ضربة قاضية (دينار كويتي) كل شكل مونولاييرس المتلاقية. صور الممثل من نوع البرية (WT) كولونويد المتلاقية البشرية أحادي الطبقة متباينة لمدة 5 أيام (A) و (ب) وبالمثل زاد مونولاييرس المستمدة من الثقافات كولونويد MUC2 دينار كويتي. مقياس بار (أ-ب) = 50 ميكرومتر (ج) ممثل إيمونوبلوت من الثقافات كولونويد ترانسدوسيد مع شرنا المجمعة أو شرنا MUC2 يوضح أنه يمكن quantitated التغييرات في التعبير البروتين بسبب دينار كويتي من إيمونوبلوت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg"> الشكل 4: مونولاييرس انتيرويد/كولونويد نماذج مناسبة لدراسة التفاعلات بين المضيف ميكروب لومينال. قسم الضوئية متعامد من أحادي الطبقة كولونويد والإسقاط الممثل أقصى شدتها (A) يظهر المخاط MUC2 إيجابية قمي سميكة الطبقة التي لا يسهل اختراقها إلى كولاي HS (رؤوس سوداء) يجلس في المخاط قمي السطح. كانت مصابة أحادي الطبقة لمدة 6 ساعات مع 106 زيمبابوي/mL النظام المنسق. (ب) ممثل أقصى شدتها الإسقاط من أحادي الطبقة كولونويد البشرية من المصابين القولونية (10 مليلتر زيمبابوي6 ، 6 ساعات). مقياس بار (أ-ب) = 50 ميكرومتر. (ج) قياس كثافة الفلورة MUC2 تظهر انخفاضا كبيرا في MUC2 في مونولاييرس كولونويد القولونية المصابين مقارنة بعناصر التحكم غير مصاب. أشرطة الخطأ تمثل sem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>البروتين</td>
			<td>رقم الدخول</td>
			<td>وفرة الببتيد</td>
		</tr>
<tr>
<td>باسولاتيرال وسائل الإعلام</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>البروتين ملزمة الأحماض الدهنية، الكبد [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001434.1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
<tr>
<td>بروفيلين-1 [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_005013.1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف الابوليبوبروتين A-رابعا [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_000473.2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>ecto-شرطة أبوظبي-ريبوسيلترانسفيراسي 4 السلائف [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_066549.2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
<tr>
<td>جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات نازعة isoform 1 [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_002037.2 (+ 1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف سيروترانسفيرين [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001054.1 (+ 1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
<tr>
<td>فيتامين د-ملزمة البروتين isoform 3 السلائف [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+ 2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
<tr>
<td>كتالاز [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001743.1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
<tr>
<td>agrin isoform 1 السلائف [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
<tr>
<td>لاكتوترانسفيرين إيسوفورم 1 السلائف [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_002334.2 (+ 1)</td>
			<td>262</td>
		</tr>
<tr>
<td>وسائط قمي</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف عامل 3 البرسيم [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_003217.3</td>
			<td>326</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف عامل 1 البرسيم [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_003216.1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparan الخاصة بالغشاء كبريتات بروتيوغليكان الأساسية بروتين isoform سليفة [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+ 3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
<tr>
<td>إيسوفورم فيلامين-ب 1 [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+ 2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف عامل 2 البرسيم [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_005414.1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
<tr>
<td>حذف في المخ الخبيثة الأورام 1 بروتين isoform ب السلائف [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_015568.2 (+ 3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
<tr>
<td>الكيراتين، النوع الثاني سيتوسكيليتال 1 [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_006112.3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
<tr>
<td>الميوسين-9 [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_002464.1</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف أمينوبيبتيداسي ن [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_001141.2 (+ 1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
<tr>
<td>السلائف agrin [الإنسان العاقل]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. تختلف قائمة جزئية من الببتيدات حددها السائل اللوني/جنبا إلى جنب الكتلي في قمي والسوائل باسولاتيرال عينات من مونولاييرس جيجونال.

Watch this Scientific Journal Video about Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium at JoVE.com

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

نقدم هنا، بروتوكولا للثقافة البشرية انتيرويد أو مونولاييرس كولونويد التي لها وظيفة الحاجز سليمة لدراسة التفاعلات الظهارية الحجمية المضيف على المستوى الخلوي والكيمياء الحيوية.

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

3D الثقافة العضوية المعوية يحد من دراسة التفاعل الظهارية-الممرض المضيف لأن التجويف لا يمكن الوصول إليها مباشرة من البكتيريا أو عوامل الفوعة. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن بسهولة أخذ عينات من المواد المُفرزة مثل الجزيئات الصغيرة أو البروتينات أو المخاط من الثقافة ثلاثية الأبعاد لتحليل المصب. لمعالجة هذه القيود، نقدم بروتوكول معدلة لتحويل الoids الإنسان 3D أو colonoids إلى أحادية الطبقات.monolayers القولون تفرز سميكة، طبقة المخاط apical، مما يسمح لدراسات الجسم الحي السابق للتفاعل المخاط الممرض. تهدف هذه الطريقة إلى توفير نموذج قابل للذاكرة لدراسة أقرب تفاعلات المضيفة المسببة للأمراض المعوية عند العدوى. سوف تسمح monolayers القولون لطريقة جديدة لدراسة علم الأحياء المخاط، وهو أمر مهم في التفاعل المضيف الممرض، والدراسات الميكروبيوم، ومرض التهاب الأمعاء.يمكن تطبيق هذه الطريقة على أجهزة أخرى إفراز المخاط مثل الجهاز الهضمي العلوي، والجهاز التنفسي، والجهاز التناسلي للإناث. سوف مظاهرة البصرية مساعدة المستخدم مع الحفاظ على المخاط خلال نمو أحادية الطبقات وأثناء التثبيت للمناعة. إثبات الإجراء سيكون كارول دوكلادني، عالم الموظفين من مختبرنا.بعد احتضان ثقافة الخلية المغلفة ، يُفطن متوسط الثقافة من لوحة 24 بئرًا واستبدلها بمحلول حصاد بارد من الجليد في المليلتر في البئر. استخدام مكشطة خلية صغيرة لإزاحة وتفتيت بيليه غشاء غشاء الطابق السفلي. إيلاء اهتمام خاص لأية مواد بالقرب من حواف البئر.ثم، يهيج لوحة على شاكر المدارية في ما يقرب من 200 الثورات في الدقيقة الواحدة في أربع درجات مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. استخدم ماص قناة واحدة P200 مزودة بنصائح فلتر عقيمة لإعادة إجراء تعليق الخلية. تسليم تعليق الخلية في 15 ملليلتر قارورة مخروطية.استخدم قوارير متعددة إذا كان إجمالي حجم التعليق أكبر من ستة ملليلترات. بعد ذلك، إضافة إلى القارورة حجم متساو من متقدمة DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 10 ملليمتر HEPES, L-ألانيل-L-الجلوتامين ديببتيد, والبنسلين-ستربتوميسين. هذا هو وسيلة الغسيل.عكس القارورة ثلاث إلى أربع مرات لخلط. أجهزة الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. قبل طلاء الخلايا، اكويّل الزُيّاة المغلفة في حاضنة استزراع الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل.لكل إدراج أن تكون مطلية، دافئة ملليلتر واحد من التوسع المتوسطة في حمام الماء 37 درجة مئوية وإضافة اثنين من مثبطات. ثم يضاف الخليط إلى الآبار. استلهمي الغسل المتوسط من الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الخلية واستبدالها بوسيط التوسع مع حجم يكفي لتحقيق ما لا يقل عن 100 ميكرولترات لكل إدراج و resuspend.ثم، التعرق الحل الرابع الكولاجين من كل إدراج وغسل مرتين مع 150 ميكرولترات من وسط غسل لكل إدراج. ماصة 600 ميكرولترات من التوسع المتوسطة في الفضاء تحت كل إدراج. Pipette 100 ميكرولترات من تعليق الخلية من القارورة في كل إدراج.إعادة لوحة إلى حاضنة ثقافة الأنسجة وترك دون عائق لمدة 12 ساعة على الأقل. تجنب اهتزاز أو إمالة لوحة حادة. بعد احتضان، ضع لوحة على المجهر ضوء النقيض المرحلة مع 2.5 مرات إلى 10 مرات عدسة الهدف.تحديث مع ثقافة المتوسطة دون مثبطات لوقف العلاج تثبيط. استمر في تحديث الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى التقاء. ارفع إدراجات ثقافة الخلية من لوحة 24-well مع ملقط أو ملاقط ذات رؤوس دقيقة.عكس بعناية على ورقة الأنسجة المختبرية لإزالة المتوسطة ونظف السائل الخارجي المتشبثة بإدراج. في لوحة جديدة 24-جيدا، تزج إدراج في حل واحد إلى ثلاثة من حمض الخليك الجليدي والإيثانول المطلق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، على مقاعد البدلاء، عكس إدراج على ورقة الأنسجة لإزالة المثبت.ضع الإدراجات في حاوية بلاستيكية مليئة بـ 1X PBS لمدة 10 دقائق لإعادة هيدرات الخلايا قبل الشروع في بروتوكولات المناعة القياسية. للحفاظ على, استخدام شفرة حلاقة لقطع حول محيط غشاء إدراج. باستخدام ملقط، نقل الغشاء إلى شريحة المجهر الزجاجي.ثم، إضافة المتوسطة المتصاعدة ولصق غطاء الزجاج. في هذه التجربة، تزرع الثقافات المعوية والمستعمرات البشرية كهياكل ثلاثية الأبعاد، ثم تنفصل ومجزأة للطلاء على إدراج ثقافة الخلايا المغلفة بالكولاجين-IV البشري. يتم رصد التقدم المحرز في تشكيل أحادي الطبقات على أساس يومي عن طريق المجهر الميداني الساطع وتلطيخ المناعة.تشكل شظايا القولون المصنفة على مرشحات الإنسان-الكولاجين-IV المغلفة جزر أحادية الطبقات متعددة من يومين إلى أربعة أيام بعد البذر. وتبين كل من الإسقاط ذي الكثافة القصوى والمقطع البصري Z مع الإسقاطات المتعامدة المقابلة أن المناطق الخالية من الخلايا يمكن تحديدها من خلال عدم وجود تلطيخ F-actin النووي والأبلاسي. تم الكشف عن أحادية القولون مع سطح apical مستمر من قبل F-actin مناعة ما يقرب من أسبوع واحد بعد البذر.التكبير عالية من عرض تمثيلي أقصى كثافة وقسم البصرية confocal مع الإسقاطات المتعامدة المقابلة تبين أن الخلايا في monolayers القولون ينق تشكل حلقات F-actin perijunctional وفرشاة غير ناضجة الحدود. EdU التأسيس يدل على فقدان تدريجي للانتشار خلال التمايز أحادية الطبقات jejunal. أحادية الطبقات الجيونلية غير المتمايزة لديها خلايا أوسع وأقصر ، وحدود فرشاة apical actin تعتمد على أقل نضجًا مقارنة بطبقات مجونة بعد خمسة أيام من التمايز.تفتيت المستعمرات أمر بالغ الأهمية. إذا كانت الأجزاء كبيرة جداً، فإنها لن تعلق على مرشح المغلفة، ولكن بدلاً من ذلك سيتم إصلاح في colonoid 3D. لقد عرضنا طريقة معدلة لدراسة علم الأحياء المخاطي على monolayers القولون.يمكن إجراء دراسات أخرى لمسببات الأمراض المضيفة للنظر في التفاعل بين الممرض والسطح الأمعاء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة من نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

نظام ثقافة الجهاز الأمعاء المعوية لتحليل التفاعلات المضيف الميكروبيوتا

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

عدوى الخلايا الظهارية الأنفية الأولية التي تنمو في واجهة الهواء السائل لتوصيف التفاعلات بين الإنسان والفيروس التاجي والمضيف

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...