Name: human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院的支持, 该项目提供了 P01 AI125181、K01 DK106323 (JGI) 和 K01 DK113043 (JFA)。我们感谢詹姆斯·卡普 (马里兰州立大学、巴尔的摩、医学博士、美国) 提供大肠杆菌株 HS 和 ehec。我们还感谢霍普金斯霍普金斯·霍特消化系统基础和转化研究核心中心 (P30 DK089502) 和约翰霍普金斯质谱和蛋白质组学核心的综合生理和成像核心。

该协议以作者先前发表的研究报告为基础。6,7.,14,15,16应使用适当的无菌技术, 在无菌生物安全柜中采取以下步骤。所有涉及人体标本的方法都已得到约翰·霍普金斯大学医学院机构审查委员会 (IRB NA_00038329) 的批准。
1. 用细胞外基质插入涂层细胞培养
<ol><li>在 100 mM 醋酸中制备5毫升的胶原蛋白 iv 溶液 (1 Mg/ml)。让支架在4°c 下大约 4小时, 以充分水合溶解。</li>
	<li>在 4°C (≤ 1个月) 或-20°c (> 1个月) 的温度下, 将胶原蛋白 iv 库存溶液储存。</li>
	<li>在涂布之前, 将无菌组织培养等级的水中的胶原蛋白 IV 库存溶液稀释到34Μg/ml 的最终浓度。对于24孔板细胞培养刀片, 在每个刀片上涂上100Μl 的溶液, 相当于 10μgcm 2。</li>
	<li>在37°c 的标准 co2 组织培养孵化器中孵育板≥ 2小时, 或为方便起见, 用石蜡膜密封板边缘, 在4°c 下隔夜或最多1周孵育。</li>
</ol>2. 从3D 培养中分离肠内病/菌落
注: 肠类或类鸦片是根据前面描述的标准协议从捐献者活检中建立起来的, 并在3D 培养中保持。14,简单地说, 通过螯合和机械搅拌从肠道活检或切除中收获的隐窝。在 BMM 中, 这些墓穴被清洗、收获和镀。扩展介质 (步骤4.2 中描述) 将添加到区域性中, 并每2天更换一次。电镀后数小时内就能看到3D 培养的形成。
<ol><li>从24孔板中吸收培养基, 每口用1毫升冰凉收获液 (见材料表) 代替。</li>
	<li>使用一个微型细胞刮刀, 以驱逐和破坏地下室膜基质颗粒, 特别注意任何材料附近的井边。</li>
	<li>在约200转/分、4°C 的轨道振动台上搅拌板30-45。</li>
</ol>3. 分离3D 肠内病/结肠炎
<ol><li>使用 P200 单通道移液器或装有无菌滤嘴的多通道移液器对细胞悬浮液进行三度处理。</li>
	<li>将细胞悬浮液集中在一个15毫升的锥形小瓶中。如果悬浮总量 > 6 毫升, 请使用多个小瓶。</li>
	<li>加入同等体积的先进 DMM/F12 培养基, 含有 10 mM HEPES、l-丙基-l-谷氨酰胺二肽 (1x) 和青霉素-链霉素 (1x) (洗涤介质)。反转管3-4 次混合。离心机在 300 x 克, 10分钟, 4°C。<ol>
<li>(可选) 吸气洗涤介质, 并替换为 0.5 mll/井胰蛋白酶 (见材料表)。用 P200 移液器重新注射结肠炎, 将管盖上, 放在37°c 的水浴中大约 2分钟, 立即取出管, 将洗涤介质添加到10毫升的最终体积, 并按照步骤3.3 中的步骤第3.3一次离心。 注: 如果三化不会导致大小均匀的碎片, 则此步骤可能更可取。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 电镀肠内/结肠吊乳
<ol><li>如果涂层刀片保存在 4°c, 平衡在 37°cc% co% 2 组织培养孵化器中至少 30分钟, 然后再电镀细胞。</li>
	<li>对于要电镀的每个插入物, 制备1毫升温 (25-37°c) 膨胀介质 (EM), 并添加 10μm Y-27632 和 10μm CHIR 99021。 注: EM 由包含 B27 (1x) 的高级 DMM/F12 组成, 50% WNT3A 条件培养基, 15% RSPO1 调理培养基, 10% Noggin 条件培养基, 50 Ng/ml 人 egf, 500 nM a-83-01, 10μm sb 202190, 抗生素抗真菌鸡尾酒 (1x), 10 mM HEPPES,L-丙基-l-谷氨酰胺二肽 (1x) 和青霉素链霉素 (1x) (见材料表)。</li>
	<li>将含有细胞颗粒的导管中的洗涤介质吸出, 并重新悬浮在足以产生至少100μl 插入物的 em 中。</li>
	<li>从每个插入物中吸走胶原蛋白 IV 溶液, 每次插入时使用150Μl 的洗涤介质清洗两次。</li>
	<li>将600Μl 的 em 移入每个刀片下方的空间。</li>
	<li>将细胞悬浮液100Μl 插入每个插入物中。</li>
	<li>将钢板返回组织培养孵化器, 并保持至少12小时不受干扰。 注: 避免晃动或大幅倾斜板, 以防止结肠绿殖民体碎片在插入膜上的分布不均。</li>
	<li>通过将电池连接置于 2.5 x-10倍物镜下的相对比光显微镜上, 监测细胞附件并展开以形成融合单层。</li>
	<li>1-2天后, 大部分片段应粘附在胶原蛋白基质上。刷新培养基, 停止用 Y-27道理和 CHIR 99021 处理。继续每2-3天刷新一次介质, 直到融合。融合通常在7-10 内达到。</li>
</ol>5. 测量上皮电阻
<ol><li>将电极引线连接在上皮电压计 (EVOM) 上并通电。验证测量功能是否设置为欧姆。</li>
	<li>用70% 乙醇短暂浸渍电极尖端, 并用实验室组织擦干。在洗涤介质的5毫升中平衡电极约5分钟。</li>
	<li>将较短的电极尖端浸入插入介质中, 并将较长的电极尖端定向到较低的井板中。保持电极在一个完全垂直的方向, 直到 EVOM 读数相对稳定, 或不超过60秒。 注: 如果电极组件倾斜远离垂直, 或尖端高度调整不当, 较短的尖端可能会接触并破坏电池单层。</li>
	<li>将 EVOM 测量值与从培养基中淹没的无细胞插入物中获得的值进行比较, 以评估融合或分化的进展。</li>
</ol>6. 融合肠内/结肠样单层的分化
<ol><li>将 EM 交换为差异介质 (DM), 并继续每两天刷新一次介质, 直到第5天。DM 是缺少 WNT3A、RSPO1、A-83-01 和 SB 202190 的 EM。</li>
	<li>继续监视 TER, 以验证差异化是否按预期进行。在分化的第一天至 5点, ter 将继续增加。单层可能会在5-6 之后继续增加 TER 并保持活力, 但在5-6 使用时, 会显示出最大和最可重现的结果。</li>
</ol>7. 细菌感染, 同型或致病性大肠杆菌
<ol><li>在实施感染前一天, 用无抗生素 em 或 DM 清洗和喂养单层。</li>
	<li>使用无菌微生物循环轻轻刮掉冷冻细菌性甘油库存的表面, 并接种2毫升的 LB 肉汤。将试管转移到37°c 的标准晃动孵化器12-16小时。</li>
	<li>将起始培养的50μl 稀释为5毫升新鲜 lb 肉汤 (1: 100), 并继续孵育90分钟。这将产生密度为 10 5-10 6个菌落单元 (cfu )/ll 的原木相培养。<ol>
<li>(可选) 在分光光度计中通过600纳米 (OD600) 的光学密度测量来确认细菌浓度。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将细菌培养在 12, 000 x 克下 10分钟, 去除上清液, 并将细菌重新悬浮在不含抗生素的 EM 或 DM 中, 最终浓度为 107 cfu ml。</li>
	<li>在插入物中加入10μl 的细菌悬浮液 (最终浓度为 106 cf ml)。管慢慢混合, 避免干扰细胞外粘液层。</li>
	<li>将钢板返回到组织培养孵化器, 以达到所需的感染期。</li>
</ol>8. 固定保存和免疫粘液
<ol><li>将细胞培养物从24孔板上提起, 小心倒置在实验室纸巾上, 取出顶端介质, 并擦拭粘附在刀片上的外部液体。</li>
	<li>在一个新的24孔板, 将插入物浸泡在1:3 溶液中的冰醋酸在绝对乙醇 (克拉克的溶液) 在室温下10分钟。</li>
	<li>倒置插入物, 去除固定物, 将细胞在 1x PBS 中补充水分 10分钟. 继续使用标准的免疫染色方案。</li>
	<li>使用剃须刀刀片切割刀片膜的周长。使用钳子将膜转移到玻璃显微镜幻灯片上, 并用安装介质贴上覆盖玻璃。</li>
</ol>9. 免疫印迹细胞裂解液的制备
注: 在冰上或在冷藏室执行以下步骤。
<ol><li>吸气介质, 用 PBS 清洗插入一次。</li>
	<li>在插入物中加入150Μl 裂解缓冲液 (见材料表), 让支架 5-10. 裂解缓冲液含有 50 mM Tis ph 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL ca-630, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, 1100: 蛋白酶抑制剂鸡尾酒。</li>
	<li>使用微型细胞刮刀从插入物中取出细胞, 然后使用 P200 移液器短暂三度将悬浮液转移到微型离心管中。</li>
	<li>使用微尖端探头以20% 的振幅将具有 5 x 1 s 脉冲的悬架进行对其进行扫描 (参见材料表)。</li>
	<li>如果立即进行电泳, 则添加 SDS-PAGE 加载缓冲液, 或将脂肪和裂解液储存在-20°c。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

成功形成肠内样单层的关键参数包括 1) 健康、增殖的3D 文化作为起始材料;2) 在单层播种前, 用人胶原蛋白 iv 涂覆细胞培养表面;3) 机械或酶上的3D 培养体的碎片化, 但不分散到单个细胞级别。
在三维肠内结石的分离过程中, 最佳的晃动速度可能会根据给定振动台模型的旋转直径而变化。这样做的目的不仅是为了高效混合而搅拌板材, 而且也是为了避免将细胞悬浮液溅到板盖上或相邻的井中。< 30分钟的潜伏期可能会产生残留的 BMM 粘附在细胞上, 这可能会阻碍在插入物上镀片时附着和形成均匀的细胞单层。广泛的孵育 (≥1小时) 将导致细胞活力显著降低。
分离三维肠溶特类化合物所需的三位一体程度可能随活塞刚度和使用者的灵活性而变化。建议在相对比光显微镜上定期检查井内含量, 以确定片段在三化过程中的均匀性, 目标是每个片段大约30个细胞。作为代替, 或除了三化, 悬浮液可以用胰蛋白酶短暂消化, 以获得较小的均匀碎片。如果单层在一个单一的上皮层中含有很大比例的3d 样结构, 则可能需要使用胰蛋白酶消化。然而, 与单细胞的离解是不可取的, 因为这显著降低细胞的活力。在 35Μl BMM 液滴中培养的肠系膜/类原体的一口通常足以填充2-3 个插入物, 但这一因素可能因肠类/结肠滴的数量和平均大小而异。
结肠样单层可以吸收大量的顶端介质, 因为他们区分。这可以通过在上插入室 (150-200μl) 上应用额外的 DM 来规避, 尽管上腔的部分干燥似乎不会对单层的生存能力或下游检测中的功能产生不利影响。经过大约4-5 的分化, 结肠这种单层细胞外粘液在仔细抽吸 DM 后, 可能会在细胞表面显示为厚胶状物质。
对于 EHEC 与外部粘液层的相互作用, 我们通常使用协议中规定的细菌滴度和潜伏期。然而, 独特的菌株最初应检测在多个浓度和潜伏期, 以确定适当的参数所需的效果。
在粘液固定过程中, 吸气顶端介质可能会去除大部分细胞外未附着的粘液层。因此, 仔细倒出介质是很重要的。如果介质被表面张力保留在刀片中, 请使用折叠的实验室组织的角, 以打破表面张力, 并将大部分介质擦掉。固定和染色后, 在插入滤镜上安装覆盖玻璃时, 粘液层可能会被无意中移开或扁平。为了保持粘液高度, 请将滤清器放在安装介质的一滴上, 并小心地将覆盖玻璃放在过滤器上。不要点击或按下覆盖玻璃, 因为这可能会显著压平粘液层。
为了在三维培养中从细胞中形成偏振单层, 有必要重现肠上皮细胞的亚外侧膜整合与细胞外基质 (ECM) 蛋白之间的相互作用。层压板、胶原蛋白 IV、纤维连接蛋白和一系列蛋白聚糖构成肠道上皮 ECM。21,22我们比较了人类细胞衍生的层压蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白 iv 和穆林衍生的 bmm 作为插入涂层。只有胶原蛋白 IV 支持形成稳定的、长期的 (长达 4周) 的融合肠样单层 (图 1-2)。在其他测试矩阵上获得了少量的单层样生长, 但这些区域未能进展到融合。使用人胶原蛋白 iv 作为 ECM 替代品有许多优点。来自恩格尔布雷斯-霍尔姆-群 (EHS) 小鼠肉瘤细胞的 BMM 不是人类的起源, 而人类胶原蛋白 IV 是商业上可用的, 通常更具成本效益。此外, BMM 是一种具有固有变异性的蛋白质的复杂混合物, 可能包含由影响基因表达的肉瘤分泌的生长因子。23
肠道上皮细胞与肠道上皮恢复中的潜在 ECM 之间的相互作用仍未完全了解。胶原蛋白 IV, 但不是层压蛋白的意义, 作为一个粘附配体对人殖民地细胞 24 和肠道隐窝上皮细胞恢复25的增强剂已建议使用抗体对胶原蛋白 iv, 防止附着.作为Β-1-整合素的抗体, 在菌落细胞对 IV 型胶原蛋白的粘附中表现出明显的阻断抗体, 上皮表达的β1-整合素似乎对 ECM 相互作用很重要。虽然胶原蛋白 iv 为插入物上的肠样单层形成提供了可靠的 ecm, 但随着时间的推移, ecm 的上皮重塑尚未在该模型中得到评估, 也没有更复杂和定义的 ecm 混合物的影响。胶原蛋白 IV、层压蛋白和纤维连接蛋白。
人类肠杆菌/单层形式的结肠炎 (图 1-4) 使操作和采样成为可能, 使用三维矩阵嵌入的培养物将是繁琐或不可能实现的。三维肠杆菌/菌落在大小、结构复杂性和管腔体积上各不相同, 因此微生物或小分子的微注射很难准确定量。此外, 与单层 (表 1) 不同的是, 3d 培养物阻止直接进入腔内和基底外侧表面, 以测量与生理或病理生理过程相关的离子、营养物质、细胞因子或分泌因素.融合 (图 1-2) 是肠内样单层的主要特性之一, 不仅需要建立营养物质、离子和其他大分子的生理梯度,而且要创造适当的屏障在腔内微生物群和无菌间充质/免疫细胞居住的浆膜环境之间。这些方面是重要的考虑, 未来的研究, 纳入肠内样单层与间充质, 免疫, 或神经元细胞类型, 以建立更复杂的生理模型。
这里描述的细胞培养插入模型的局限性包括缺乏物理力, 如流体剪切应力和机械拉伸压缩 (蠕动), 以及缺乏通常经历肠道的厌氧顶端环境体内上皮。这些元素有可能通过更复杂的微生理平台26来解决,但它们也需要额外的费用、设备和专门知识来实施。3D 和单层培养物也没有与肠道微生物群、基质细胞群和免疫系统的相互作用或贡献, 除非有目的地添加这些成分。
肠内样单层在胶原蛋白 iv 包膜细胞培养插入物中的未来应用可能包括其他关于致病性或同源微生物相互作用、药物或营养吸收、毒性、代谢、屏障功能和功能的研究由与其他肠道细胞类型共同培养的增强。评估不仅可以在健康捐献者的上皮内进行, 还可以从有基因突变或肠道疾病的个体进行评估, 前提是体内表型被确定为保存在体外肠内/结肠组培养中。

肠道有机体、肠体和菌落在了解干细胞行为、肠道发育、屏障运输功能和细胞分化方面取得了许多进展。1然而, 3d 培养限制了宿主上皮病原体相互作用的研究, 因为细菌或毒力因素不能直接接触到腔内, 除非封闭结构受到微注射。2,3此外, 分泌的材料, 如小分子、蛋白质或粘液, 不能很容易地从3d 培养中取样, 以便进行下游分析。在3D 培养中, 使用荧光染料和延时显微镜对病原体对上皮屏障功能4和离子转运5的影响进行了评价, 但在透水组织培养支架上生长的单层菌是可以接受的其他技术, 如 TER 测量和使用室电压夹记录。6,7.
许多出版物描述了肠结肠炎/结肠炎的2D 或单层培养协议。被发现促进上皮细胞附着的材料包括胶原蛋白水凝胶,8,9 0.1% 明胶,10薄层小鼠肉瘤衍生基底膜基质 (bmm),11,12, 13和人胶原蛋白 iv。6,7.,14,15,16,17种入途径包括通过移液6、14、15 和使用胰蛋白酶、10、11 的细胞粘附因子分离进行机械碎裂消除,13或 edta。9一些协议使用无孔组织培养塑料制品进行播种, 但这限制了基外侧访问, 因此大多数应用依赖于渗透组织培养插入物。不同出版物之间有稳定的融合单层形成和维护的文献。此外, 不同群体的人类文化增长和差异化媒体成分不同, 并随着更多的研究人员采用和调整方法以适应其应用和现有资源而不断演变。
为了解决在宿主-病原体相互作用研究中3D 肠道上皮培养的局限性, 我们提出了一种改进的协议, 用于将3D 人类肠体或菌落转换为单层。在隐状样未成熟状态下实现融合后, 生长因子 WNT3A、RSPO1 和抑制剂 a-83-01 和 SB 202190 的退出可导致小肠绒毛或表面结肠上皮的分化代表。我们描述理想的基质, 人胶原蛋白类型 iv, 以覆盖插入物, 并获得均匀的肠内或结肠样碎片电镀。我们证明, 该协议产生了一个融合单层具有较高的 ter. 结肠样单层分泌一个厚的顶端粘液层, 允许通过免疫印迹或免疫染色对病理-粘液相互作用进行体外研究。还介绍了一种改进的固定程序, 以保持结肠粘液层的免疫染色。该方法旨在为研究感染后肠道宿主-病原体相互作用提供一个可追溯的模型。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Tris base, Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>ALK4/5/7 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Fluorescent probe for F-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic cocktail</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td>Primocin (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27, 50x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Transwell, PET membrane, 0.4 &#956;m pore, 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>GSK3&#946; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Depolymerizes basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain HS</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorSave mounting medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>345789</td>
			<td>For mounting insert membrane on microscope slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/Noggin-Fc cell line</td>
			<td>van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research</td>
			<td></td>
			<td>For production of Noggin conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td>For production of Rspondin-1 conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Fluorescent nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted cell culture light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WNT3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>For production of Wnt3a conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix for 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cell scraper</td>
			<td>United BioSystems</td>
			<td>MCS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 antibody, mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11197</td>
			<td>Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 shRNA lentiviral particles</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>RHS4531</td>
			<td>GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>PSU-10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator with microtip</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for mammalian cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td>p38 MAPK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dexoycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express, 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody, rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, tissue culture grade, sterile filtered</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>RhoA/ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium

从隐基干细胞中提取的人三维 (3D) 肠内酯或类殖民细胞培养物是目前肠道上皮最先进的体外模型。由于其封闭的结构和显著的支持细胞外基质, 3D 培养物不是理想的宿主病原体研究。肠内或菌落可以作为上皮单层生长在可渗透组织培养膜上, 以允许操作腔内和亚外侧细胞表面及伴随的液体。这种增强的腔表面可及性有助于模拟细菌-宿主上皮的相互作用, 如结肠上皮肠出血性大肠杆菌(ehec) 的粘液降解能力。介绍了一种三维培养碎裂、单层播种和超相电阻 (TER) 测量的方法, 以监测融合和分化的进展。结肠样单层分化产生分泌粘液, 可通过免疫荧光或免疫印迹技术进行研究。更广泛地说, 肠内或结肠样单层使生理相关的平台能够评估可能成为致病性或同源微生物群目标的特定细胞群。

人类肠内和殖民体培养体是作为三维结构生长的, 然后分离和分裂, 用于在人体胶原蛋白 iv 涂层细胞培养插入物上电镀。通过明亮的场显微镜、免疫荧光染色 (图 1) 和经皮电阻 (ter) 的稳步增加 (图 2), 每天都可以很容易地监测单层的形成过程 (图 2), 这反映了紧密连接与离子的渗透性及其与单层融合的关系。一个空的24孔刀片的 TER 约为 50-100是不是 2摄氏度,达到融合后增加到大约 400-500是不是 cm 2.融合单层中的所有上皮细胞都通过在细胞周长的 f-肌动蛋白环检测到的结合点复合物连接 (图 1)。全生长因子介质中的单层代表增殖性隐窝状上皮, 主要由包含核苷类似 edu 的主动分裂细胞组成 (图 2)。RNT3A 和 RSPO1 的生长因子的退出促进了分化, 导致缺乏增殖细胞的绒毛样培养物。分化的单层含有肠细胞 (肠素) 或菌落细胞 (菌落), 并发展专门的肠道上皮细胞, 如3D 培养所示,18包括杯状细胞和肠内分泌细胞。15差异化单层还显示出 ter (&Gt; 1000ωcm 2) 显著增加 (图 2), 表明成熟紧密的连接点。
在正常的人体生理中, 肠道上皮层将营养物质和富含微生物的腔内空间与无菌的血清学环境分离开来。上皮紧密地调节这两个隔间之间的交叉谈话。肠体和结肠组体单层保存这一重要的条块分割性质, 如表 1中的蛋白质组学分析所示。从分化的肠内单层中收集的顶端和同外侧条件培养基的蛋白质组成存在显著差异。通过访问顶端和基外侧, 可以以时间相关的方式收集这两种上清液, 以测量其他分子 (如细胞因子和趋化因子) 的差异分泌。15,17
单层是一种方便且高重现性的模型, 可同时使用免疫印迹和免疫染色检测蛋白质表达的变化。因此, 使用这两种技术都可以检测到 shRNA 敲除 (KD) 在粘液 2 (MUCIN) 表达中的变化 (图 3)。在3D 类殖民细胞上进行了 shRNA 转导, 并在抗生素选择介质中保持。在验证 KD 后, 殖民体可以作为3D 区域性连续维护, 或作为单层进行电镀, 用于实验目的。此外, 与野生型亲本殖民体线相比, MUC2 KD 不影响单层形成的效率。收集用于免疫印迹的单层是简单的, 类似于人类上皮腺癌衍生细胞系的描述方案。通常情况下, 大约50微克或更多的总蛋白可以从一个0.33 厘米2插入生长的单层中提取。如图 3所示, 在未分化 (ud) wt 类殖民类单层中几乎无法检测到 muc2, 但在差异化 (df) wt 单层中表达得很高。在与 MUC2 shRNA 转化的 UD 和 DF 类殖民细胞单层中, MUC2 均低于检测水平。
重要的是, 单层是研究上皮顶端表面的宿主-微生物相互作用的合适模型。结肠样单层在分化时形成厚的附着的 mucus 阳性粘液层, 不容易被大肠杆菌 (图 4)渗透(图 4), 类似于正常的人结肠中的建议。19然而, 肠出血性大肠杆菌(ehec) 是一种人类结肠病原体, 已被证明有能力破坏富含 mucus 的附着粘液层, 以到达上皮的顶端表面 (图 4)。14,20剩余的 muc2 只存在于杯状细胞内。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg"> 图 1:人肠内/结肠样单层的建立.(A)在 bmm 溶解和三化之后的结肠炎片段的例子。(B)电镀结肠样碎片后立即插入的例子。刻度杆 (A-B) = 200 微米。代表(c)最大强度投影和(d)共聚焦光学 z-部分与相应的正交投影显示, 在人类胶原蛋白 iv 涂层过滤器上播种的殖民体片段形成多个单层岛屿2-4天后播种。C 和 D 中都没有核 (Hoechst 33342, 蓝色) 和顶端 f-肌动蛋白 (phalloidin, 绿色) 染色, 就可以识别无细胞区 (星号). 与相应的正交投影部分显示, 在播种后1周左右, 用 f-肌动蛋白免疫染色检测到连续的顶层表面。(G)具有代表性的最大强度投影和(h)共聚焦光学截面的高放大倍率与相应的正交投影表明, 融合的结肠组类单层中的细胞形成 f-肌动蛋白周围的结合点环 (白色箭头) 和一个不成熟的尖刷边框 (黄色箭头)。刻度杆 (C-H) = 20μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg"> 图 2: 肠内样/结肠药单层分化的评估。(A) edu (红色) 合并表明在空肠单层分化过程中逐渐失去增殖。(B)膨胀或分化介质中融合空肠单层的平均 ter 测量值。错误条代表 SEM. UD, 未区分;DF, 区分。数字对应于指定条件下的天数;UD1 是融合的第一天, 大约在播种后1周。(C) ud 空肠单层具有宽, 短的细胞和一个不太成熟的顶端的基于关键的刷边界比 df 天5空肠单层。刻度杆 (A, C) = 50 微米。所有单层都被描绘至少1周后播种和融合之前开始分化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg"> 图 3:野生型殖民体和 shRNA 转染 (kd) 类殖民体各形成融合单层。(A)具有代表性的人类融合类殖民层单层图像, 区分了 5天, (b)来自 MUC2 kd 殖民文化的类似生长的单层。结垢条 (A-B) = 50μm (c)代表的结肠样体培养体免疫印迹与拼接的 SHRNA 或 Uc2 shRNA 一起转化, 表明 kd 引起的蛋白质表达的变化可以通过免疫印迹进行定量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg"> 图 4: 肠内/结肠样单层是研究腔内微生物-宿主相互作用的合适模型.(A)具有代表性的结肠样单层最大强度投影和正交光学切片显示厚顶端的 muc2 阳性粘液层, 不能渗透到位于顶端粘液处的大肠杆菌hs (黑色箭头)表面。单层感染 6小时, 用 10 6 Cfu/mL hs.(B)代表性人类殖民样单层的最大强度投影, 顶部感染 ehec (106 cfukl, 6小时)。刻度杆 (A-B) = 50μm。(C) muc2 免疫荧光强度测量显示, 与未感染对照组相比, 受 ehec 感染的结肠组类单层的 muc2 显著下降。错误条表示 SEM. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>蛋白</td>
			<td>加入号码</td>
			<td>多肽丰富</td>
		</tr>
<tr>
<td>基外侧介质</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>脂肪酸结合蛋白, 肝脏 [智人]</td>
			<td>NP_001434。1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
<tr>
<td>profilin-1 [智人]</td>
			<td>NP_005013。1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
<tr>
<td>载脂蛋白 A-IV 前体 [智人]</td>
			<td>NP_000473。2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ecto-adp-核糖基转移酶4前体 [智人]</td>
			<td>NP_066549。2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
<tr>
<td>甘油三-磷酸脱氢酶等形态 1 [智人]</td>
			<td>NP_002037.2 (+ 1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
<tr>
<td>血清转铁蛋白前体 [智人]</td>
			<td>NP_001054.1 (+ 1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
<tr>
<td>维生素 d 结合蛋白等体3前体 [智人]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+ 2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
<tr>
<td>过氧化氢酶 [智人]</td>
			<td>NP_001743。1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
<tr>
<td>异型1前体 [智人]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
<tr>
<td>乳铁蛋白异种1前体 [智人]</td>
			<td>NP_002334.2 (+ 1)</td>
			<td>36S</td>
		</tr>
<tr>
<td>专题媒体</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>三叶草因子3前体 [智人]</td>
			<td>NP_003217。3</td>
			<td>22 w</td>
		</tr>
<tr>
<td>三叶草因子1前体 [智人]</td>
			<td>NP_003216。1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
<tr>
<td>基底膜特异性肝素硫酸盐蛋白聚糖核心蛋白异基因等体 [智人]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+ 3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
<tr>
<td>丝状物-b 异形 1 [智人]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+ 2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>三叶草因子2前体 [智人]</td>
			<td>NP_005414。1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
<tr>
<td>删除恶性脑肿瘤1蛋白异形 b 前体 [智人]</td>
			<td>NP_015568.2 (+ 3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
<tr>
<td>角蛋白, II 型细胞骨架 1 [智人]</td>
			<td>NP_006112。3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
<tr>
<td>肌球蛋白 9 [智人]</td>
			<td>NP_002464。1</td>
			<td>150人</td>
		</tr>
<tr>
<td>氨基肽酶 N 前体 [智人]</td>
			<td>NP_001141.2 (+ 1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
<tr>
<td>农业前体 [智人]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
</tbody></table>表1。从分化的空肠单层中取样的顶端和亚外侧流体中, 通过液相色谱/串联质谱法识别的部分肽列表。

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Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

人类舱内单聚物研究病原体、共脉和宿主肠道上皮细胞之间的相互作用

在这里, 我们提出了一个培养人类肠体或类团类单层具有完整的屏障功能的方案, 以研究宿主上皮微生物在细胞和生化水平上的相互作用。

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

3D肠道器官培养限制了宿主上皮-病原体相互作用的研究，因为流明不能直接被细菌或毒性因素接近。此外，小分子、蛋白质或粘液等分泌物质无法轻易地从 3D 培养物中取样，以便进行下游分析。为了解决这些限制，我们提出了一个修改的协议，用于将 3D 人肠或结肠体转换为单层。结肠单层分泌一层厚厚的、高小的粘液层，允许对病原体-粘液相互作用进行活体研究。该方法旨在为研究感染时最早的肠道宿主-病原体相互作用提供一个可操作的模型。结肠单层将允许一种新的方法来研究粘液生物学，这对于宿主-病原体相互作用，微生物群研究和炎症性肠病非常重要。该方法可应用于其他粘液分泌器官，如上胃肠道、呼吸系统和女性生殖系统。视觉演示将帮助用户在单层生长期间和免疫污染固定期间保存粘液。展示这个程序的将是卡罗尔·多克拉德尼，一个来自我们实验室的工作人员科学家。孵育涂层细胞培养后，从24井板中吸出培养基，每井用一毫升冰冷收获溶液代替。使用微型细胞刮刀将地下室膜基颗粒分离并分解。特别注意井边附近的任何材料。然后，在4摄氏度下以每分钟约200转的速度在轨道摇床上搅拌板，30至45分钟。使用装有无菌滤液尖的 P200 单通道移液器对细胞悬浮液进行三化。在15毫升圆锥体中送电池悬浮液。如果总悬浮量大于六毫升，请使用多个小瓶。之后，在小瓶中加入一个等量的高级DMEM/F12介质，其中含有10毫摩尔海苯、L-alanyl-L-谷氨酰胺二肽和青霉素链霉素。这是洗涤介质。反转小瓶三到四次混合。在4摄氏度下以300倍g离心10分钟。在细胞电镀之前，将涂层刀片在组织培养培养箱中平衡至少 30 分钟。对于每个要镀的刀片，在37摄氏度的水浴中加热一毫升的膨胀介质，并添加两个抑制剂。然后，将混合物加入井中。从含有细胞颗粒的管子中吸出洗涤介质，用足够量的膨胀介质代替，每次插入并重新暂停至少产生 100 微升。然后，从每个刀片中吸出胶原蛋白 IV 溶液，然后用每插入的 150 微升洗涤介质洗涤两次。移液器600微升的膨胀介质进入每个刀片下方的空间。移液 100 微升细胞悬浮液从小瓶进入每个刀片。将板返回组织培养箱，离开不受干扰至少12小时。避免摇晃或急剧倾斜板。孵育后，将板放在相对比光显微镜上，用2.5倍至10倍的客观透镜。使用培养基刷新，无抑制剂，停止抑制治疗。每两到三天继续刷新介质，直到汇合。用细尖钳或钳子从 24 井板中提起细胞培养插入。小心地倒置在实验室纸巾上，取出粘附在刀片的外部液体中。在一个新的24井板中，将刀片浸入一至三个冰酸溶液和绝对乙醇中，在室温下浸泡10分钟。然后，在长凳上，将插入物倒置到纸巾上，取出固定剂。将刀片放在装满 1X PBS 的塑料容器中 10 分钟，以补充细胞水分，然后再继续执行标准的免疫处理协议。要保存，请使用剃刀刀片切割刀片周围的插入膜。使用钳子，将膜转移到玻璃显微镜幻灯片上。然后，添加安装介质并粘贴盖玻璃。在这个实验中，人类肠和结肠培养物作为3D结构生长，然后分离和分段，用于在人类胶原蛋白-IV涂层细胞培养物的电镀上。通过光领域的显微镜和免疫荧光染色，每天监测单层形成的进展。在人类胶原-IV涂层过滤器上播种的殖民地碎片在播种后两到四天形成多个单层岛屿。具有相应正交投影的最大强度投影和共合光学 Z 节均表明，由于不存在核和假 F-actin 染色，可以识别无细胞区域。在播种后大约一周，通过F-actin免疫污化检测到具有连续蛋白表面的汇合结肠单层。具有代表性的最大强度投影和共声光学部分与相应的正交投影的高放大倍率显示，汇合结肠单层中的细胞形成 F-actin 近交环和未成熟的同源刷边框。EdU 的合并表明，在 Jejunal 单层分化期间，扩散逐渐丧失。与五天的分化后，未分化的杰琼单层具有更宽、更短的细胞，并且与杰琼单层相比，较不成熟的基于阿皮基的毛笔刷边框。分割结肠体至关重要。如果碎片太大，它们不会附着在涂层滤光片上，而是会转换为 3D 结肠。我们提出了一种改进的方法，研究结肠单层粘液生物学。可以进行其他宿主-病原体研究，以研究病原体与肠道病原体表面之间的相互作用。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

单细胞测量液泡破裂引起细胞内病原体

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

科研

免疫与感染

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

建立的液体覆盖的文化偏光人类呼吸道上皮的CALU-3细胞研究呼吸系统病原宿主细胞的反应<em在体外</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

仿生材料表征细菌宿主相互作用

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

人胎盘及蜕膜器官培养研究在母胎界面感染

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

利用人类诱导的多能干细胞衍生的肠道有机体研究和改性上皮细胞对沙门氏菌和其他病原体的保护

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

使用来自同一物种的抗体进行双标记免疫荧光研究宿主 - 病原体相互作用

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

流式细胞术分析人髓系U937细胞中SAMHD1限制性

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

分析宿主-微生物群相互作用的肠道肠道器官培养系统

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

标准化 体外 测定，以可视化和量化人中性粒细胞与 金黄色葡萄球菌 生物膜之间的相互作用

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

在气液界面上生长的原代鼻上皮细胞的感染，以表征人类冠状病毒与宿主的相互作用

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...