Name: human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium at JoVE.com

यह काम NIH अनुदान P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI), और K01 DK113043 (JGI) द्वारा समर्थित किया गया था । हम जेंस Kaper (मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) ई. कोलाई तनाव एच एस और EHEC प्रदान करने के लिए धंयवाद । हम भी हापकिंस Conte पाचन रोग बुनियादी और Translational अनुसंधान कोर केंद्र (P30 DK089502) और जॉंस हॉपकिंस मास स्पेक्ट्रोमेट्री और Proteomics कोर के एकीकृत फिजियोलॉजी और इमेजिंग कोर स्वीकार करते हैं ।

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	<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13, 633-642 (2016).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+stimulates+a+complex+physiological+response+in+the+immature+human+intestinal+epithelium.">Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium.</a> eLife. 6, e29132 (2017).</li><li>Williamson, I. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagens+facilitate+epithelial+migration+in+restitution+of+native+guinea+pig+intestinal+epithelium.">Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium.</a> Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Organ-on-a-Chip+Models+of+Human+Intestine.">Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

एंटेरॉइड के सफल गठन के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों/कोलोनॉइड monolayers शामिल 1) स्वस्थ, शुरू सामग्री के रूप में 3 डी संस्कृतियों proliferating; 2) कोटिंग कोशिका संस्कृति मानव कोलेजन IV के साथ सतह डालने monolayer बोने से पहले; 3 3 डी संस्कृतियों के विखंडन या तो यंत्रवत् या enzymatically, लेकिन एक कोशिका स्तर पर नहीं ।
3 डी enteroids के अलगाव के दौरान/colonoids, इष्टतम मिलाते हुए गति एक दिया शेखर मॉडल के घूर्णी व्यास के आधार पर भिंन हो सकते हैं । मंशा केवल एक कुशल मिश्रण के लिए थाली आंदोलन नहीं है, लेकिन यह भी प्लेट कवर पर या आसंन कुओं में सेल निलंबन splashing से बचने के लिए । < 30 मिनट की ऊष्मायन अवधि अवशिष्ट BMM कोशिकाओं है, जो अनुलग्नक और वर्दी सेल monolayers के गठन जब आवेषण पर चढ़ाया बाधा कर सकते है पकड़ उपज सकता है । व्यापक ऊष्मायन (≥ 1 ज) काफी कमी सेल व्यवहार्यता उपज जाएगा ।
3d एन्टरइड्स/कोलोनॉइड को अलग-अलग करने के लिए आवश्यक संपेषण की सीमा पिस्टन कठोरता और उपयोगकर्ता निपुणता के साथ भिन्न हो सकते हैं । एक चरण-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप पर अच्छी तरह से सामग्री की आवधिक परीक्षा टुकड़ा प्रति लगभग 30 कोशिकाओं के एक लक्ष्य के साथ, tration के दौरान एक टुकड़ा एकरूपता निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है । के एवज में, या trituration के अलावा, निलंबन के साथ संक्षेप में पचा जा सकता है ट्रिप्सिन छोटे समान टुकड़े प्राप्त करने के लिए । Trypsin डाइजेस्ट वांछनीय हो सकता है अगर monolayers एक अंयथा एकल उपकला परत के बीच 3 डी की तरह संरचनाओं के एक बड़े अनुपात होते हैं । हालांकि, एकल कोशिकाओं के लिए वियोजन वांछनीय नहीं है क्योंकि यह काफी कोशिका व्यवहार्यता कम हो जाती है । एक ३५ μL BMM छोटी बूंद में सुसंस्कृत enteroids/कॉलोनाइड्स के एक अच्छी तरह से आम तौर पर 2-3 आवेषण आबाद करने के लिए पर्याप्त होगा, लेकिन इस कारक संख्या और enteroids के औसत आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं/
कोलोनॉइड monolayers के रूप में वे अंतर के रूप में एक व्यापक माध्यम की मात्रा को अवशोषित कर सकते हैं । यह अपर डालने चैंबर (150-200 μL) के लिए अतिरिक्त डीएम को लागू करने से दरकिनार किया जा सकता है, हालांकि ऊपरी चैंबर के आंशिक सुखाने प्रतिकूल monolayer व्यवहार्यता या बहाव assays में समारोह को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है । भेदभाव के लगभग 4-5 दिनों के बाद, कोलोनॉइड monolayers कोशिकाद्रव्य बलगम है कि डीएम की सावधानी आकांक्षा के बाद सेल की सतह पर मोटी/
बाहरी बलगम परत के साथ EHEC बातचीत के लिए, हम नियमित रूप से प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट बैक्टीरियल टाइटर और ऊष्मायन अवधि का उपयोग करें । हालांकि, अद्वितीय जीवाणु उपभेदों शुरू में कई सांद्रता और ऊष्मायन अवधि के लिए वांछित प्रभाव के लिए उपयुक्त मापदंडों का निर्धारण किया जाना चाहिए ।
बलगम निर्धारण के दौरान, ऐपिकल माध्यम aspirating की संभावना extracellular असंलग्न बलगम परत के सबसे दूर होगा । इसलिए, यह ध्यान से माध्यम से बाहर डालना महत्वपूर्ण है । यदि मध्यम सतह तनाव से डालने में बनाए रखा है, एक तह प्रयोगशाला ऊतक के कोने का उपयोग करने के लिए सतह तनाव को तोड़ने और दूर माध्यम के सबसे बाती । निर्धारण और धुंधला हो जाने के बाद, बलगम परत अनजाने या उखाड़ फेंकना हो सकता है, जबकि डालने फिल्टर पर एक coverglass बढ़ते । बलगम ऊंचाई को संरक्षित करने के लिए, बढ़ते मीडिया की एक बूंद पर फिल्टर जगह और ध्यान से फिल्टर पर कवरग्लास जगह है । नल या coverglass पर नीचे प्रेस नहीं के रूप में यह काफी बलगम परत समतल कर सकते हैं ।
3 डी संस्कृति में कोशिकाओं से एक polarized monolayer फार्म के लिए, यह आंतों उपकला कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन की basolateral झिल्ली integrins के बीच बातचीत को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक है । Laminin, कोलेजन चतुर्थ, fibronectin, और proteoglycans की एक सरणी आंत्र उपकला ECM गठन । 21 , 22 हम मानव कोशिका की तुलना में-laminin व्युत्पन्न, fibronectin, कोलेजन चतुर्थ, और murine-डालने कोटिंग्स के रूप में bmm प्राप्त की । केवल कोलेजन चतुर्थ स्थिर के गठन का समर्थन किया, लंबी अवधि (अप करने के लिए 4 सप्ताह) संगामी enteroid/कोलोनॉइड monolayers (आंकड़े 1-2). Monolayer की तरह विकास के छोटे पैच अन्य परीक्षण matrices में से प्रत्येक पर प्राप्त किया गया था, लेकिन इन क्षेत्रों कन्फ्लुएंसी करने के लिए प्रगति करने में विफल रहा. मानव कोलेजन चतुर्थ का उपयोग ECM किराए के रूप में लाभ के एक नंबर है । एंगेलबरेथ-होलिम-झुंड (ईएचएस) से प्राप्त बीएमएम-म्यूरिन सार्कोमा कोशिकाएं मानव मूल की नहीं हैं, जबकि मानव कोलेजन चतुर्थ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है और आम तौर पर अधिक लागत प्रभावी है । इसके अतिरिक्त, bmm अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के साथ प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण है, और वृद्धि कारक है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित सार्कोमा द्वारा स्रावित शामिल हो सकते हैं । 23
आंतों उपकला कोशिकाओं और आंतों उपकला क्षतिपूर्ति में अंतर्निहित ecm के बीच बातचीत अभी भी पूरी तरह से समझ में आता है । कोलेजन चतुर्थ का महत्व है, लेकिन नहीं laminin, मानव colonocytes के लिए एक आसंजन संलग्नी के रूप में24 और आंतों तहखाना उपकला कोशिका क्षतिपूर्ति25 के बढ़ाने कोलेजन चतुर्थ के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है कि रोका लगाव . उपकला-β1-integrin व्यक्त ECM बातचीत के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, β1 के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में-एकीकृत काफी colonocytes के आसंजन अवरुद्ध चतुर्थ कोलेजन टाइप करने के लिए । 24 जबकि कोलेजन चतुर्थ आवेषण पर एन्ड्रॉइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर गठन के लिए एक विश्वसनीय ecm प्रदान करता है, समय के साथ ecm के उपकला remodeling अभी तक इस मॉडल में मूल्यांकन नहीं किया गया है, और न ही अधिक जटिल और परिभाषित ecm मिश्रण का प्रभाव है कोलेजन चतुर्थ, laminin, और fibronectin ।
Monolayer प्रारूप (आंकड़े 1-4) में मानव enteroids/जोड़तोड़ और नमूना है कि बोझिल या असंभव के लिए 3 डी मैट्रिक्स-एंबेडेड संस्कृतियों का उपयोग कर प्राप्त होगा सक्षम करें । 3 डी आंत्रशोथ/कॉलोनाइड्स आकार, संरचनात्मक जटिलता और लुमिनल आयतन में भिन्न होते हैं, और इस प्रकार सूक्ष्मजीवों या छोटे अणुओं के माइक्रोइंजेक्शन को सही मात्रा में लगाना कठिन होता है । इसके अतिरिक्त, monolayers (तालिका 1) के विपरीत, 3 डी संस्कृतियों के लिए आयनों, पोषक तत्वों, साइटोकिंस या स्रावित कारकों को मापने के लिए दोनों luminal और basolateral सतहों के लिए सीधी पहुंच को रोकने के शारीरिक या पैथोफाइसिलॉजिक प्रक्रियाओं के साथ जुड़े . कन्फ्लुएंसी (आंकड़े 1-2) एंट्रोइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर के मुख्य गुणों में से एक है जो न केवल पोषक तत्वों, आयनों, और अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स,16 की शारीरिक gradients की स्थापना के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी उचित बाधा पैदा के बीच लुमिनल माइक्रोबायोटा और बाँझ mesenchymal/प्रतिरक्षा कोशिका आबाद serosal वातावरण. इन पहलुओं को भविष्य के अध्ययन है कि mesenchymal, प्रतिरक्षा, या न्यूरोनल सेल प्रकार के साथ एंटैरॉइड/कोलोनॉइड monolayers शामिल करने के लिए और अधिक जटिल शारीरिक मॉडल बनाने पर विचार महत्वपूर्ण हैं ।
सेल संस्कृति डालने के मॉडल की उल्लेखनीय सीमाओं यहां वर्णित द्रव कतरनी तनाव और यांत्रिक खिंचाव के रूप में शारीरिक बलों की कमी/संपीड़न (peristalsis), और एक अवायुजीवी शीर्ष वातावरण सामान्य रूप से आंत्र द्वारा अनुभवी की अनुपस्थिति शामिल vivo में एपिथेलिया । इन तत्वों को और अधिक परिष्कृत microशरीरक्रियात्मक प्लेटफार्मों के साथ संबोधित किया जा करने की क्षमता है,26 लेकिन वे भी अतिरिक्त खर्च, उपकरण, और विशेषज्ञता को लागू करने की आवश्यकता है । दोनों 3 डी और monolayer संस्कृतियों के साथ या योगदान के बिना भी कर रहे है आंत्र माइक्रोबायोम, stromal सेल आबादी, और प्रतिरक्षा प्रणाली जब तक इन घटकों को उद्देश्यपूर्ण रूप से जोड़ रहे हैं ।
कोलेजन चतुर्थ लेपित सेल संस्कृति आवेषण पर एंटॉरॉइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर के भविष्य के अनुप्रयोगों में रोगजनक या कोमेन्सल माइक्रोबियल इंटरेक्शन, ड्रग या पोषक तत्वों से ऊपर उठाना, विषाक्तता, चयापचय, बैरियर फंक्शन, और कार्यात्मक के अन्य अध्ययन शामिल हो सकते हैं अतिरिक्त आंत्र कोशिका प्रकार के साथ सह संस्कृति द्वारा उत्प्रेरक वृद्धि । मूल्यांकन न केवल स्वस्थ दानदाताओं के एपिथेलिया के भीतर बल्कि आनुवंशिक उत्परिवर्तनों या आंतों विकारों के साथ व्यक्तियों से भी बनाया जा सकता है, प्रदान की vivo phenotypes में संरक्षित किया जा करने के लिए स्थापित कर रहे है पूर्व vivo एंटेरॉइड/

आंत्र ऑर्गेनाइड्स, enteroids, और colonoids स्टेम सेल व्यवहार को समझने में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया है, आंत्र विकास, बाधा/परिवहन समारोह, और सेलुलर भेदभाव. 1 तथापि, 3 डी संस्कृति मेजबान उपकला-रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन को सीमित करता है क्योंकि लुमेन बैक्टीरिया या विउलेंस कारकों के लिए सीधे सुलभ नहीं है जब तक बंद संरचनाओं microinjection के अधीन हैं । 2 , 3 इसके अलावा, छोटे अणुओं, प्रोटीन, या बलगम के रूप में स्रावित सामग्री आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए 3 डी संस्कृति से जांचा नहीं जा सकता । उपकला बैरियर समारोह4 और आयन परिवहन5 पर रोगजनक एजेंटों के प्रभाव फ्लोरोसेंट रंजक और समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 3 डी संस्कृति में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन monolayers पारगम्य ऊतक संस्कृति का समर्थन करने के लिए उत्तरदायी हैं अतिरिक्त तकनीकों जैसे कि TER माप और Ussing कक्ष/वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग । 6 , 7
कई प्रकाशनों का वर्णन किया है प्रोटोकॉल के लिए 2 डी या monolayer संस्कृति के enteroids/ उपकला कोशिका लगाव को बढ़ावा देने के लिए पाया सामग्री कोलेजन hydrogels,8,9 ०.१% जिलेटिन,10 पतली परत म्यूरिन सार्कोमा-व्युत्पन्न तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (bmm),11,12, शामिल 13 और मानव कोलेजन चतुर्थ । 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 सीडिंग दृष्टिकोण, trypsin,10,11 का उपयोग कर सेल आसंजन कारकों के6,14,15 और/ dispase,13 या edta । 9 कुछ प्रोटोकॉलों में बीज बोने के लिए अभेद्य ऊतक संवर्धन प्लास्टिवेयर का उपयोग होता है, लेकिन यह बासोलेटरल अभिगम को प्रतिबंधित करता है, इसलिए अधिकांश अनुप्रयोग पारगम्य ऊतक संस्कृति आवेषण पर निर्भर करते हैं । स्थिर संगामी monolayer गठन और रखरखाव के प्रलेखन प्रकाशनों के बीच व्यापक रूप से बदलता है । इसके अतिरिक्त, मानव संस्कृतियों के लिए विकास और भेदभाव मीडिया रचनाओं विभिंन समूहों के बीच अलग है और अधिक शोधकर्ताओं को अपनाने और उनके आवेदन और उपलब्ध संसाधनों के अनुरूप पद्धति को समायोजित के रूप में विकसित करने के लिए जारी है ।
मेजबान में 3 डी आंत्र उपकला संस्कृति की सीमाओं का पता-रोगज़नक़ इंटरेक्शन अध्ययन, हम एक monolayer करने के लिए 3 डी मानव enteroids या colonoids परिवर्तित करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल मौजूद । एक तहखाना की तरह अपरिपक्व राज्य में कन्फ्लुएंसी को प्राप्त करने के बाद, विकास कारकों की वापसी WNT3A, RSPO1 और inhibitors ए-83-01 और SB २०२१९० छोटे आंत्र विलस या सतह कालोनी उपकला का भेदभाव प्रतिनिधि की ओर जाता है । हम आदर्श मैट्रिक्स का वर्णन, मानव कोलेजन प्रकार चतुर्थ, आवेषण कोट और चढ़ाना के लिए एक समान एंटॉइड या colonoid टुकड़े प्राप्त करते हैं । हम प्रदर्शित करते है कि इस प्रोटोकॉल एक उच्च स्तर के साथ एक संगामी monolayer पैदा करता है । कोलोनॉइड monolayers एक मोटी शीर्ष बलगम परत स्रावी, रोगज़नक़ के पूर्व vivo अध्ययन के लिए अनुमति-immunoblotting या immunoblotting के माध्यम से बलगम बातचीत. Immunostaining के लिए कालोनी बलगम परत को संरक्षित करने के लिए एक संशोधित निर्धारण प्रक्रिया भी वर्णित है. इस विधि के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रदान करने के लिए जल्द ही आंत्र मेजबान के संक्रमण पर रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करना है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Tris base, Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>ALK4/5/7 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Fluorescent probe for F-actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic cocktail</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td>Primocin (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27, 50x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Transwell, PET membrane, 0.4 &#956;m pore, 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>GSK3&#946; inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Depolymerizes basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial voltohmmeter electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain HS</td>
			<td>Kaper lab, University of Maryland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorSave mounting medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>345789</td>
			<td>For mounting insert membrane on microscope slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/Noggin-Fc cell line</td>
			<td>van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research</td>
			<td></td>
			<td>For production of Noggin conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td>For production of Rspondin-1 conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Fluorescent nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted cell culture light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WNT3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>For production of Wnt3a conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane matrix for 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini cell scraper</td>
			<td>United BioSystems</td>
			<td>MCS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 antibody, mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11197</td>
			<td>Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 shRNA lentiviral particles</td>
			<td>GE Dharmacon</td>
			<td>RHS4531</td>
			<td>GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>PSU-10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator with microtip</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for mammalian cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td>p38 MAPK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dexoycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express, 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody, rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129002</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, tissue culture grade, sterile filtered</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>RhoA/ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium

मानव 3 आयामी (3 डी) एंटेरॉइड या कोलोनॉइड तहखाना आधार स्टेम सेल से व्युत्पंन संस्कृतियों वर्तमान में आंतों उपकला के सबसे उंनत पूर्व vivo मॉडल हैं । उनके बंद संरचनाओं और महत्वपूर्ण extracellular मैट्रिक्स का समर्थन करने के कारण, 3 डी संस्कृतियों मेजबान रोगज़नक़ अध्ययन के लिए आदर्श नहीं हैं । आंत्रशोथ या कोलोनोइड पारगम्य ऊतक संस्कृति झिल्ली पर उपकला monolayers के रूप में उगाया जा सकता है दोनों luminal और basolateral सेल सतहों और साथ तरल पदार्थ के हेरफेर की अनुमति । यह बढ़ाया luminal सतह पहुंच के लिए कालोनी उपकला पर enteroरक्तस्रावी ई. कोलाई (ehec) की बलगम अपमानजनक क्षमता जैसे बैक्टीरियल-होस्ट उपकला बातचीत मॉडलिंग की सुविधा । कन्फ्लुएंसी और भेदभाव की दिशा में प्रगति की निगरानी करने के लिए 3 डी कल्चर विखंडन, मोनोलेयर सीडिंग, और ट्रांसपीथेलियल इलेक्ट्रिकल प्रतिरोध (TER) मापन के लिए एक विधि बताई गई है । कोलोनॉइड मोनोलेयर विभेद की पैदावार बलगम स्रावित करता है जिसे इमयूनोफ्लुएसेंस या इमॉनोफ्लोटिंग तकनीकों द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । अधिक आम तौर पर, एंटीरॉइड या कोलोनॉइड monolayers एक भौतिक-प्रासंगिक मंच सक्षम करने के लिए विशिष्ट कोशिका आबादी है कि रोगजनक या सहभोजी माइक्रोबायोटा द्वारा लक्षित किया जा सकता है मूल्यांकन ।

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Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

यहां, हम संस्कृति मानव एंटॉइड या कोलोनॉइड monolayers कि अक्षुण्ण समारोह के लिए सेलुलर और जैव रासायनिक स्तर पर मेजबान उपकला माइक्रोबायोटा बातचीत का अध्ययन बरकरार है एक प्रोटोकॉल मौजूद है ।

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

3 डी आंतों ऑर्गेनॉइड संस्कृति मेजबान एपिथेलियल-रोगजनक इंटरेक्शन के अध्ययन को सीमित करता है क्योंकि ल्यूमेन बैक्टीरिया या उग्रता कारकों के लिए सीधे सुलभ नहीं है। इसके अतिरिक्त, छोटे अणुओं, प्रोटीन या बलगम जैसी स्रावित सामग्रियों को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए 3 डी संस्कृति से आसानी से नमूना नहीं लिया जा सकता है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम 3डी मानव आंत्रप्रेन्योर्स या कोलोनॉइड को मोनोलेयर में बदलने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।कोलोनॉयड मोनोलेयर एक मोटी, एपिकल बलगम परत का स्राव करते हैं, जो रोगजनक-बलगम बातचीत के पूर्व वीवो अध्ययन की अनुमति देता है। इस विधि का उद्देश्य संक्रमण पर सबसे पहले आंतों की मेजबानी-रोगजनक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक ट्रैक्टेबल मॉडल प्रदान करना है। कोलोनॉयड मोनोलेयर्स बलगम जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक नए तरीके की अनुमति देंगे, जो मेजबान-रोगजनक बातचीत, माइक्रोबायोम अध्ययन, और भड़काऊ आंत्र रोग में महत्वपूर्ण है।इस विधि को ऊपरी जीआई पथ, श्वसन प्रणाली और महिला प्रजनन प्रणाली जैसे अन्य बलगम-स्रावित अंगों पर लागू किया जा सकता है। दृश्य प्रदर्शन मोनोलेयर विकास के दौरान और इम्यूनोस्टेटिंग के लिए निर्धारण के दौरान बलगम संरक्षण के साथ उपयोगकर्ता की मदद करेगा। प्रक्रिया का प्रदर्शन करोल Dokladny, हमारी प्रयोगशाला से एक स्टाफ वैज्ञानिक होगा ।लेपित सेल संस्कृति को इनक्यूबेट करने के बाद, संस्कृति माध्यम को 24-अच्छी प्लेट से हटा दें और प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर बर्फ-कोल्ड हार्वेस्टिंग समाधान के साथ प्रति अच्छी तरह से बदलें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गोली को उखाड़ फेंकना और तोड़ने के लिए एक मिनी सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। कुएं के किनारों के पास किसी भी सामग्री पर विशेष ध्यान दें।फिर, 30 से ४५ मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर लगभग २०० क्रांतियों प्रति मिनट पर एक कक्षीय शेखर पर थाली आंदोलन । सेल निलंबन को ट्रिट करने के लिए बाँझ फिल्टर युक्तियों के साथ लगे P200 एकल चैनल पिपेट का उपयोग करें। 15 मिलीलीटर शंकुनाल शीशी में सेल निलंबन वितरित करें।यदि कुल निलंबन मात्रा छह मिलीलीटर से अधिक है तो कई शीशियों का उपयोग करें। उसके बाद, शीशी में 10 मिलीमोलर हेपेट्स, एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त उन्नत डीएमईएम/एफ12 माध्यम की बराबर मात्रा जोड़ें। यह वॉश मीडियम है।शीशी को तीन से चार बार मिक्स करने के लिए उलटा करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० बार जी पर सेंट्रलाइज । सेल चढ़ाना से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में लेपित आवेषण संतुलन।प्रत्येक डालने के लिए चढ़ाया जा करने के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में विस्तार माध्यम के एक मिलीलीटर गर्म और दो अवरोधकों जोड़ें । इसके बाद इस मिश्रण को कुओं में डालें। सेल पेलेट युक्त ट्यूब से धोने के माध्यम को एस्पिरेट करें और विस्तार माध्यम के साथ प्रति डालने और पुनर्स्ल्पन कम से कम 100 माइक्रोलीटर उपज के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ प्रति स्थापित करें।फिर, कोलेजन चतुर्थ समाधान को प्रत्येक डालने से हटाएं और प्रति डालने वाले वॉश माध्यम के 150 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक डालने के नीचे अंतरिक्ष में विस्तार माध्यम के पिपेट 600 माइक्रोलीटर। प्रत्येक सम्मिलन में शीशी से सेल निलंबन के पिपेट 100 माइक्रोलीटर।टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट लौटाएं और कम से कम 12 घंटे के लिए अशान्त छोड़ दें। प्लेट को हिलाने या तेजी से झुकाने से बचें। इनक्यूबेटिंग के बाद प्लेट को एक फेज कंट्रास्ट लाइट माइक्रोस्कोप पर 2.5 बार से 10 गुना ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ रखें।अवरोध उपचार को बंद करने के लिए अवरोधकों के बिना संस्कृति माध्यम के साथ ताज़ा करें। हर दो से तीन दिन में मीडियम को रिफ्रेश करते रहें जब तक कि मैं इसे रिफ्रेश कर दें। ठीक इत्तला दे दी संदंश या चिमटी के साथ 24 अच्छी तरह से थाली से सेल संस्कृति आवेषण लिफ्ट ।एपिकल माध्यम को हटाने और डालने के लिए बाहरी तरल चिपकने को मिटाने के लिए प्रयोगशाला ऊतक पेपर पर सावधानी से उलटा करें। एक नई 24-अच्छी प्लेट में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हिमनदों एसिटिक एसिड और पूर्ण इथेनॉल के एक से तीन समाधान में आवेषण विसर्जित करें। फिर, बेंच पर, फिक्सेटिव को हटाने के लिए टिश्यू पेपर पर डालें उलटा करें।मानक इम्यूनोदाता प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं को फिर से हाइड्रेट करने के लिए 10 मिनट के लिए 1X PBS से भरे प्लास्टिक कंटेनर में आवेषण रखें। संरक्षित करने के लिए, डालने झिल्ली की परिधि के चारों ओर काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। संदंश का उपयोग करके, झिल्ली को ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें।फिर, बढ़ते माध्यम जोड़ें और एक कवर ग्लास प्रत्यय। इस प्रयोग में, मानव आंत्रऔर कोलोनॉयड संस्कृतियों को 3 डी संरचनाओं के रूप में उगाया जाता है, फिर मानव-कोलेजन-IV-लेपित सेल संस्कृति आवेषण पर चढ़ाना के लिए अलग और खंडित किया जाता है। मोनोलेयर गठन की प्रगति की निगरानी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से दैनिक आधार पर की जाती है।मानव-कोलेजन-IV-लेपित फिल्टर पर वरीयता प्राप्त कोलोनॉयड टुकड़े सीडिंग के दो से चार दिन बाद एक कई मोनोलेयर द्वीप बनाते हैं। इसी ऑर्थोगोनल अनुमानों के साथ अधिकतम तीव्रता वाले प्रक्षेपण और कॉन्फोकल ऑप्टिकल जेड-सेक्शन दोनों से पता चलता है कि परमाणु और एपिकल एफ-ऐक्टिन स्टेनिंग दोनों की अनुपस्थिति से सेल-मुक्त क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है । एफ-ऐक्टिन इम्यूनोदाते हुए लगभग एक सप्ताह के बाद सीडिंग द्वारा निरंतर एपिकल सतह के साथ एक कॉन्फ्लोटर कोलोनॉयड मोनोलेयर का पता चला।इसी ऑर्थोगोनल अनुमानों के साथ एक प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण और कॉन्फोकल ऑप्टिकल सेक्शन का उच्च आवर्धन दर्शाता है कि कॉन्फ्लोटिक कोलोनॉयड मोनोलेयर्स में कोशिकाएं एफ-ऐक्टिन पेरिजंक्शनल रिंग्स और एक अपरिपक्व एपिकल ब्रश सीमा बनाती हैं। एडू निगमन जेजूनल मोनोलेयर भेदभाव के दौरान प्रसार की एक प्रगतिशील हानि को दर्शाता है। अविभेदित जेजूनल मोनोलेयर में पांच दिनों के भेदभाव के बाद जेजुनल मोनोलेयर की तुलना में व्यापक, छोटी कोशिकाएं और कम परिपक्व एपिकल ऐक्टिवर-आधारित ब्रश सीमा होती है।कोलोनॉइड को खंडित करना महत्वपूर्ण है। यदि टुकड़े बहुत बड़े हैं, तो वे लेपित फ़िल्टर से नहीं जुड़ेंगे, बल्कि इसके बजाय 3 डी कोलोनॉइड में सुधार करेंगे। हमने कोलोनॉयड मोनोलेयर्स पर बलगम जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक संशोधित विधि प्रस्तुत की।रोगजनक और आंतों की एपिकल सतह के बीच बातचीत को देखने के लिए अन्य मेजबान-रोगजनक अध्ययन किए जा सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

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डबल लेबलिंग Immunofluorescence मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति से एंटीबॉडी का उपयोग कर

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

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Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

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मेजबान-माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक आंत आंत अंग संस्कृति प्रणाली

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Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

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मानव न्यूट्रोफिल और स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म के बीच बातचीत की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए मानकीकृत इन विट्रो परख

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का संक्रमण

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...