16.8K Views
•
08:13 min
•
April 8th, 2019
DOI :
April 8th, 2019
•0:04
Title
0:28
Preliminary Setup
1:11
Setting up the Detection Path
2:14
Setting up the Excitation Path and the Cylindrical Lenses
4:59
Testing Tile Imaging
5:53
Highly Inclined Swept Tile (HIST) Imaging
6:52
Results: Highly Inclined Swept Tile Microscopy of Labeled DNA and RNA
7:38
Conclusion
Transcript
Vores metode giver os mulighed for at visualisere enkelte molekyler med et 40 gange større billedområde end konventionelle metoder, og har et stærkt reduceret baggrundssignal. I modsætning til andre teknikker vores tilgang bruger en enkelt objektiv, kræver ikke en særlig prøve kammer, og det er let kompatibel med kommercielle mikroskop systemer. Efter indsamling af de nødvendige komponenter begynde at opbygge systemet.
Her er flere elementer allerede på plads på bænken. Monteret på en aluminium blok er et mikroskop krop med en Piezo scene og prøve indehaveren. Også på bænken er tre lasere og optiske elementer til at kombinere bjælker.
De kombinerede bjælker er koblet til en enkelt tilstand fiber så effektivt som muligt. Som et sidste indledende skridt skal du samle en kollimeret lyskilde i et bursystem. Dette har en midlertidig sammenhængende lyskilde tilsluttet en enkelt tilstand fiber, en fiber adapter, akromatisk linse og iris.
Begynd at arbejde med registreringsstien. Først skal du placere den kollimerede lyskilde i mikroskopkroppens objektive port. Juster spejlet under målene, så udgangsstrålen er nogenlunde vandret og flugter med bænkens huller.
Sæt et dichroic spejl i bjælken stien og reflektere strålen med 90 grader. Tilføj spejle for at tillade justering af den transmitterede stråles vej til et sCMOS-kamera. Brug spejlene til at sikre, at strålen rammer midten af chippen.
Dernæst indsætte en 300-milliliter brændvidde rør linse om en brændvidde fra kameraet. Fjern den kollimerede lyskilde fra mikroskopkroppen. Juster derefter rørlinsens position for at indstille sit brændplan.
Stop justeringerne, når kameraet klart løser mønsteret i loftet. Registreringsstien er afbildet i dette skema. Bemærk tilføjelsen af et flerbåndspasfilter før rørlinsen til multicolor fluorescens-billeddannelse.
Vend tilbage til mikroskopkroppen. Der skal du geninstallere den kollimerede lyskilde i målindehaveren. Efter det dicriske spejl skal du placere et foldespejl i den reflekterede stråles bane for at omdirigere den med 90 grader.
Fjern den kollimerede lyskilde fra mikroskopkroppen, og placer den i nærheden. Dernæst indsætte en 400-millimeter brændvidde linse på omkring en brændvidde fra spejlet. På mikroskopet kroppen installere objektivet.
Juster derefter spejlingens position langs den optiske akse. Overhold loftet over målet og stop, når en perfekt Airy disk mønster er dannet der. Fjern nu målet og geninstallere den kollimerede lyskilde med en åben iris.
Bestem, hvor langs bjælken stien strålen er mindst på omkring 400 millimeter væk fra spejlet. Når punktet er identificeret, montere et spejl der, en konjugeret billede plan. Tilstanden for opsætningen på dette tidspunkt vises i dette skema.
Spejlet netop tilføjet er mærket M5. Indsæt et andet spejl for at afspejle strålen 90 grader og montere en 150-millimeter brændvidde linse ud over det. Objektivet skal være 150 millimeter fra det konjugerede billedplan. Dernæst midlertidigt tage væk den første linse i excitation stråle sti.
Med denne konfiguration finde brændvidden af den anden linse. Placer en enkelt akse galvo spejl på dette omdrejningspunkt som en konjugeret tilbage brændpunkt plan. Tilførsel nul volt til galvo spejl og rotere sin holder, så det afspejler strålen 90 grader.
Næste langs bjælken sti, placere en fold-spejl, der afspejler strålen ved 90 grader. Placer linsen 100 millimeter langs bjælken stien fra konjugeret tilbage brændplan. Fjern endnu en gang den kollimerede lyskilde fra mikroskopholderen.
Tilføj en anden 100-millimeter kollimation linse med en fiber adapter og enkelt tilstand fiber sammen med en iris. Brug derefter iris, fiber og linse til at sende en collimated stråle gennem billeddannelse system. Dernæst indsætte en cylindrisk linse af brændvidde 400 millimeter lige før den sidste kollimation linse i bjælken sti.
Brug den til at fokusere strålen. Indsæt en 50-millimeter cylindrisk linse 450 millimeter foran den første. Dette er en skematisk repræsentation af den endelige opsætning med både detektions- og excitationsstier.
Produktionen af de tre lasere er koblet ind i stien ved enkelt tilstand fiber. Til test forberede en 3D hydrogel prøve. Denne ene består af 20-nanometer crimson perler blandet med hydrogel.
Ved opsætningen anbringes hydrogelprøven i prøveholderen. For prøve excitation tænde 638-nanometer laser og justere sin magt til mindre end en milliwatt. Konfigurer kamerakontrolsoftwaren i intern udløsertilstand, og optag video.
På dette tidspunkt galvo motor har nul volt anvendes. Placer kameraet, så billedet er i midten af objektivet. Juster derefter spejlet, der er konjugatbilledets plan.
Drej den vandrette knap på spejlet for at opnå en meget skrå belysning. Optag flisebilledet som i prøvefluorescensbilledet af 3D hydrogel med 20 nanometerperler. Skalabjælken er 20 mikrometer.
Fortsæt efter opsætning af hardware og software til at feje galvo spejl. Dette er den galvo spejl feje software til opsætningen. Sørg for fuld billeddannelse i marken ved at indstille Vmin til minus 500 millivolt.
Sæt derefter Vmax til 500 millivolt. Skift derefter til kameraets anskaffelsessoftware. Vælg Ekstern i udløsertilstand.
Klik på Scan hastighedskontrol under rullemenuen LightScan PLUS. Visse kontrolparametre kan nu indstilles. Angiv 180 rækker under Vindueshøjde.
Under Eksponering indtaste 28 millisekunder. Når du er færdig, vende tilbage til spejlet kontrol software. I spejlet kontrol software tænde 3D stakke TIL. Angiv antallet af stakke og trinstørrelsen.
Klik på tag video for at begynde at optage billeder. Dette er et eksempel på Epi imaging af enkeltstrengede mærket DNA. Derimod producerede den meget skrå fejede flise teknik dette billede.
HIST-billedet viser mindre baggrund sammenlignet med Epi-billedet. DNA'et er i en 3D hydrogel, og excitation bølgelængden er 638 nanometer. Her er en Epi billede af mærket eukaryote oversættelse forlængelse faktor 2.
HIST-billedet har forbedret signal-til-baggrund-forholdet. Det har også mere ensartet belysning. Begge har samme belysningseffekt på 7,5 milliwatt.
Billedhastighederne var begge 2,5 billeder i sekundet. Det er vigtigt konstant at holde en høj hældning vinkel, og synkronisere fejende spejl med kameraet udlæsning. Dette garanterer et højt signal-til-baggrund-forhold under billederhvervelse.
Vi forventer, at HIST mikroskopi vil gavne flere applikationer, herunder super-opløsning billeddannelse på dybere billeddiaddybder og høj-throughput genekspression profilering i tykke væv skiver.
En detaljeret instruktion er beskrevet på hvordan man opbygger en meget skrå fejet flise (HIST) mikroskop og dens skik for enkelt-molekyle imaging.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved