この方法では、従来の方法に比べ40倍の画像領域を持つ単一分子を可視化し、バックグラウンドシグナルを大幅に低減しています。他の手法とは異なり、我々のアプローチは、単一対物レンズを使用し、特別なサンプルチャンバーを必要とせず、それは、商用顕微鏡システムと容易に互換性があります。必要なコンポーネントを収集した後、システムの構築を開始します。
ここでは、いくつかの要素がすでにベンチ上の位置にあります。アルミニウムブロックに取付けられるのは、ピエゾステージとサンプルホルダーを備えた顕微鏡本体です。またベンチには、ビームを組み合わせる3つのレーザーと光学要素があります。
結合されたビームは可能な限り効率的に単一モードの繊維に結合される。最終予備工程として、コリメートされた光源をケージシステムに組み立てます。これは、シングルモードファイバ、ファイバアダプタ、アクロマティックレンズ、アイリスに接続された一時的なコヒーレント光源を備えています。
検出パスで作業を開始します。まず、コリメートされた光源を顕微鏡本体の目的ポートに配置します。出力ビームがほぼ水平になり、ベンチの穴に合うように、目的の下のミラーを調整します。
ビームパスに二色鏡を挿入し、ビームを90度反射します。ミラーを追加して、送信されたビームの sCMOS カメラへのパスを調整できるようにします。ミラーを使用して、ビームがチップの中心に当たるようにします。
次に、カメラからの焦点距離に関する300ミリリットルの焦点距離チューブレンズを挿入します。顕微鏡本体からコリメートされた光源を取り除きます。次に、焦点面を設定するためにチューブレンズの位置を調整します。
カメラが天井のパターンを明確に解決したら、調整を停止します。検出パスは、この回路図に示されています。なお、多色蛍光イメージング用のチューブレンズの前にマルチバンドパスフィルタを追加する。
顕微鏡本体に戻ります。そこで、コリメートされた光源を目的のホルダーに再び取り付けます。二色鏡の後、反射ビームの経路に折り畳み鏡を置き、90度リダイレクトします。
コリメートされた光源を顕微鏡本体から取り出し、近くに置きます。次に、400ミリの焦点距離レンズを鏡から焦点距離程度に挿入します。顕微鏡で体は対物レンズを取り付けます。
次に、光軸に沿ってミラーの位置を調整します。目的の上の天井を観察し、完璧なAiryディスクパターンがそこに形成されたときに停止します。今、目的を削除し、開いた虹彩でコリメートされた光源を再インストールします。
ビーム経路に沿って、ビームがミラーから約400ミリメートル離れたところで最小である場所を決定します。ポイントが特定されたら、そこに鏡を取り付け、共役した画像平面を取り付けます。この時点でのセットアップの状態は、この図に表示されます。
追加したミラーには M5 というラベルが付いています。ビームを90度反射するために別のミラーを挿入し、その向こうに150ミリメートルの焦点距離レンズを取り付けます。レンズは、共役した画像平面から 150 ミリメートルでなければなりません。次に、励起ビームパスの最初のレンズを一時的に取り除きます。
この構成では、第2レンズの焦点位置を見つける。この焦点に単一軸ガルボミラーを共役バックフォーカルプレーンとして配置します。ガルボミラーにゼロボルトを供給し、梁を90度反射するようにホルダーを回転させます。
次に、ビームパスに沿って、ビームを 90 度に反射する折りたたみミラーを配置します。レンズをコンジュゲートバックフォーカルプレーンからのビームパスに沿って100ミリメートル配置します。もう一度、顕微鏡マウントからコリメートされた光源を取り除きます。
虹彩と一緒にファイバーアダプタとシングルモードファイバで別の100ミリメートルコリメーションレンズを追加します。次に、虹彩、繊維、レンズを使用して、撮像システムを介してコリメートされたビームを送ります。次に、ビームパスの最後のコリメーションレンズの直前に焦点距離400ミリメートルの円筒レンズを挿入します。
ビームを集中させるために使用します。50ミリメートル円筒レンズを450ミリメートルの最初の方に挿入します。これは、検出パスと励起パスの両方を持つ最終設定の概略図です。
3つのレーザーの出力はシングルモード繊維によってパスに結合される。試験用 3D ヒドロゲルサンプルを準備します。これは、ヒドロゲルと混合された20ナノメートルの真紅ビーズで構成されています。
セットアップ時に、ヒドロゲルサンプルをサンプルホルダーに入れる。サンプル励起用のレーザーは638ナノメートルのレーザーをオンにし、その電力を1ミリワット以下に調整します。内部トリガーモードでカメラコントロールソフトウェアを設定し、ビデオをキャプチャします。
この時点でガルボモータはゼロボルトが適用されています。カメラをカメラの中央に置きます。次に、コンジュゲートイメージプレーンであるミラーを調整します。
高傾斜照明を実現するために、ミラーの水平ノブを回転させます。20ナノメートルビーズを用いた3Dヒドロゲルのサンプル蛍光画像のようにタイル画像を記録します。スケールバーは20マイクロメートルです。
ガルボミラーをスイープするハードウェアとソフトウェアを設定した後に進みます。これは、セットアップ用のガルボミラースイープソフトウェアです。Vminをマイナス500ミリボルトに設定して、完全な視野イメージングを手配します。
その後、Vmaxを500ミリボルトに設定します。次に、カメラ取得ソフトウェアに切り替えます。トリガーモードで外部を選択します。
[LightScan PLUS] ドロップダウン メニューで[次へ]を選択し、[スキャン速度コントロール]をクリックします。特定の制御パラメータを設定できるようになりました。[ウィンドウの高さ] に 180 行を入力します。
[露出] に 28 ミリ秒と入力します。完了したら、ミラーコントロールソフトウェアに戻ります。ミラーコントロールソフトウェアで3DスタックONのスイッチをオンにします。スタックの数とステップ サイズを指定します。
[ビデオを撮る]をクリックして、画像の録画を開始します。これは、一本鎖標識DNAのエピイメージングの一例である。対照的に、高度に傾斜したスイープタイル技術は、この画像を生成しました。
HIST 画像は、Epi 画像と比較して背景が少ないです。DNAは3Dヒドロゲルにあり、励起波長は638ナノメートルです。ここに標識真核生物翻訳伸長因子2のエピ画像がある。
HIST イメージは、信号と背景の比率を改善しました。また、より均一な照明を持っています。両方とも7.5ミリワットの同じ照明力を有する。
イメージング速度はどちらも毎秒2.5フレームでした。常に高い傾斜角度を維持し、カメラの読み出しとスイープミラーを同期することが重要です。これにより、画像取得時に高い信号対バックグラウンド比が保証されます。
HIST顕微鏡は、より深いイメージング深度での超解像イメージングや、厚い組織スライスでの高スループット遺伝子発現プロファイリングなど、いくつかのアプリケーションに利益をもたらすことを期待しています。
