우리의 방법을 사용하면 기존의 방법보다 40 배 더 큰 이미지 영역으로 단일 분자를 시각화 할 수 있으며 배경 신호가 크게 감소했습니다. 다른 기술과 는 달리 우리의 접근 방식은 단일 객관적인 렌즈를 사용하고 특수 샘플 챔버가 필요하지 않으며 상용 현미경 시스템과 쉽게 호환됩니다. 필요한 구성 요소를 수집한 후 시스템 빌드를 시작합니다.
여기에, 몇 가지 요소는 벤치에 이미 위치에 있습니다. 알루미늄 블록에 장착된 것은 피에조 스테이지와 샘플 홀더가 있는 현미경 본체입니다. 또한 벤치에는 빔을 결합하는 세 가지 레이저와 광학 요소가 있습니다.
결합된 빔은 가능한 한 효율적으로 단일 모드 섬유에 결합됩니다. 마지막 예비 단계로, 케이지 시스템에 충돌광원을 조립합니다. 단일 모드 섬유, 섬유 어댑터, 색채 렌즈 및 홍채에 연결된 임시 일관된 광원이 있습니다.
검색 경로로 작업을 시작합니다. 첫째, 현미경 신체의 객관적인 포트에 충돌광원을 배치합니다. 출력 빔이 대략 수평이고 벤치의 구멍과 정렬되도록 목표 아래에 미러를 조정합니다.
빔 경로에 이색 거울을 삽입하고 빔을 90도 반사합니다. 미러를 추가하여 전송된 빔의 경로를 sCMOS 카메라에 조정할 수 있습니다. 미러를 사용하여 빔이 칩 의 중앙에 닿는지 확인합니다.
다음으로 카메라의 초점 길이에 대해 300 밀리리터 초점 길이 튜브 렌즈를 삽입합니다. 현미경 본체에서 충돌광원을 제거합니다. 그런 다음 튜브 렌즈의 위치를 조정하여 초점 평면을 설정합니다.
카메라가 천장의 패턴을 명확하게 해결할 때 조정을 중지합니다. 검출 경로는 이 회로도에 묘사됩니다. 멀티 컬러 형광 이미징을 위해 튜브 렌즈 앞에 멀티 밴드 패스 필터를 추가합니다.
현미경 본체로 돌아갑니다. 거기, 목표 홀더에 정렬 된 광원을 다시 설치합니다. 이색 거울 후, 반사 된 빔의 경로에 접이식 거울을 배치하여 90도 로 리디렉션합니다.
현미경 본체에서 충돌광원을 제거하고 근처에 배치합니다. 다음으로, 거울에서 초점 길이에 약 400밀리미터 초점 길이 렌즈를 삽입합니다. 현미경 본체에서 객관적인 렌즈를 설치합니다.
그런 다음 광학 축을 따라 미러의 위치를 조정합니다. 목표 위의 천장을 관찰하고 완벽한 Airy 디스크 패턴이 형성되면 중지합니다. 이제 목표를 제거하고 열린 홍채로 정렬된 광원을 다시 설치합니다.
빔 경로를 따라 빔이 미러에서 약 400밀리미터 떨어진 곳에서 가장 작은 위치를 결정합니다. 점이 확인되면, 거기에 거울, 컨쥬게이트 이미지 평면을 마운트합니다. 이 시점에서 설정된 상태는 이 회로도에 나타납니다.
방금 추가된 미러는 M5로 표시됩니다. 빔을 90도 반사하기 위해 다른 거울을 삽입하고 그 너머에 150mm 초점 길이 렌즈를 장착합니다. 렌즈는 컨쥬게이트 된 이미지 평면에서 150 밀리미터여야합니다. 다음으로, 일시적으로 여기 빔 경로에서 첫 번째 렌즈를 빼앗는다.
이 구성으로 두 번째 렌즈의 초점 위치를 찾습니다. 이 초점에 단일 축 갈보 미러를 공액 된 다시 초점 평면으로 놓습니다. 갈보 미러에 0볼트를 공급하고 홀더를 회전하여 빔을 90도 반사합니다.
빔 경로를 따라 빔을 90도 반사하는 접이식 미러를 놓습니다. 렌즈를 공주 된 다시 초점 평면에서 빔 경로를 따라 100 밀리미터를 놓습니다. 다시 한번, 현미경 마운트에서 정렬 된 광원을 제거합니다.
아이리스와 함께 섬유 어댑터와 단일 모드 섬유를 갖춘 100mm 콜리메이션 렌즈를 추가합니다. 그런 다음 홍채, 섬유 및 렌즈를 사용하여 이미징 시스템을 통해 충돌빔을 보냅니다. 다음으로, 빔 경로에 마지막 콜리메이션 렌즈 바로 앞에 초점 길이 400밀리미터의 원통형 렌즈를 삽입합니다.
빔에 초점을 맞추는 데 사용합니다. 50mm 원통형 렌즈를 최초 앞으로 450밀리미터 에 삽입합니다. 이것은 검출 및 여기 경로 모두와 최종 설정의 회로도 표현이다.
세 레이저의 출력은 단일 모드 섬유에 의해 경로에 결합된다. 테스트를 위해 3D 하이드로겔 샘플을 준비하십시오. 이 하나는 하이드로겔과 혼합 20 나노 미터 진홍색 구슬로 구성되어 있습니다.
설정시 하이드로겔 샘플을 샘플 홀더에 배치합니다. 638 나노미터 레이저를 시료 흥분의 경우 1밀리와트 미만으로 전력을 조절합니다. 내부 트리거 모드에서 카메라 제어 소프트웨어를 설정하고 비디오를 캡처합니다.
이 시점에서 갈보 모터는 0 볼트가 적용됩니다. 이미지가 렌즈의 중앙에 있도록 카메라를 배치합니다. 다음으로, 컨쥬게이트 이미지 평면인 미러를 조정합니다.
고도로 기울어진 조명을 얻기 위해 거울에 수평 노브를 회전합니다. 20나노미터 구슬을 사용하여 3D 하이드로겔의 샘플 형광 이미지에서와 같이 타일 이미지를 기록합니다. 스케일 바는 20 마이크로미터입니다.
갈보 미러를 청소하기 위해 하드웨어와 소프트웨어를 설정 한 후 진행합니다. 이것은 설치를위한 갈보 미러 스윕 소프트웨어입니다. Vmin을 마이너스 500 밀리볼트로 설정하여 전체 시야 이미징을 준비합니다.
그런 다음 Vmax를 500 밀리볼트로 설정합니다. 다음으로 카메라 수집 소프트웨어로 전환합니다. 트리거 모드에서 외부를 선택합니다.
LightScan PLUS 드롭다운 메뉴에서 다음 아래로 선택하려면 스캔 속도 제어를 클릭합니다. 이제 특정 제어 매개 변수를 설정할 수 있습니다. 창 높이 아래 180개의 행을 입력합니다.
노출 하에서 28 밀리초가 입력됩니다. 완료되면 미러 컨트롤 소프트웨어로 돌아갑니다. 3D 스택 ON의 미러 컨트롤 소프트웨어 스위치에서. 스택 수와 단계 크기를 지정합니다.
동영상 녹화를 시작하려면 동영상을 클릭합니다. 이것은 단 하나 가닥 표지된 DNA의 Epi 화상 진찰의 보기입니다. 대조적으로, 고도로 기울어진 스윕 타일 기술은이 이미지를 생산했다.
HIST 이미지는 Epi 이미지에 비해 배경이 적습니다. DNA는 3D 하이드로겔에 있고, 외신 파장은 638 나노미터이다. 다음은 표기된 진핵 번역 신장 계수 2의 에피 이미지입니다.
HIST 이미지는 신호 대 배경 비율을 향상시켰습니다. 또한 더 균일 한 조명이 있습니다. 둘 다 7.5 밀리와트의 동일한 조명 능력을 가지고 있습니다.
이미징 속도는 모두 초당 2.5 프레임이었습니다. 지속적으로 높은 경사 각도를 유지하고 카메라 판독과 스위핑 미러를 동기화하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이미지 수집 시 신호 대 배경 비율이 높습니다.
우리는 HIST 현미경 검사가 두꺼운 조직 조각에 있는 더 깊은 화상 진찰 심층 및 높은 처리량 유전자 발현 프로파일링에 초해상도 화상 진찰을 포함하여 몇몇 응용에 유익할 것이라는 점을 기대합니다.
