Name: a guide to build a highly inclined swept tile microscope for extended field-of-view single-molecule imaging
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Defense Advanced Research prosjekter Agency (DARPA) (HR00111720066) og National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi takker Michael Serge i Andor teknologi for sjenerøst låne sCMOS kameraet.

1. sette opp mikroskop, lasere og justering verktøy
<ol><li>Før du bygger mikroskopet, forberede alle de nødvendige komponentene inkludert optikk, optomechanics og elektronikk som vist i Tabellen for materiale.</li>
	<li>Forberede en mikroskop kropp hovedsakelig består av to deler: en objektiv holder med en RMS-threaded-port og en piezo-trinns montert på en aluminium blokk (figur 1A). Merk: Skreddersydd mikroskop kroppen brukes for praktiske og fleksible instrumentering12. Alle kommersielt tilgjengelig mikroskop kropp kan brukes for HIST mikroskopi.</li>
	<li>Kombinere flere laser linjer og koble dem til et enkelt modus fiber<ol>
<li>Installere 405 561, 638 nm lasere på den optiske tabell og kombinere bjelker gjennom et polariserende strålen splitter og lang-pass dichroic speil som vist i figur 1B. Kontroller at alle laserstråler passerer gjennom knappenålshull på verktøyet justering. Sett inn halvparten bølge plater for makt justering. Merk: Bruk vernebriller for vernebriller og bruker bjelke-blokker til å absorbere uønskede laserstråler.</li>
		<li>Installere en fiber kopling linse (f = 4,5) og en fiber adapter holdt i z oversetter med en bur.</li>
		<li>Koble en multimode fiber (MMF, Ø 62,5 µm) for fiber-kortet. Justere hvert par av styringen speilet og z-oversetter til koblingen effektiviteten av hver laser er høyere enn 95%. Utgang strålen har en nær Gaussian-formet profil med speckle mønstre.</li>
		<li>Ta bort multimode fiber og koble en single-modus fiber (SMF). Lik MMF, finjustere og maksimere kopling effektiviteten av tre lasere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montere collimated lyskilde som skal brukes for strålen justering i eksitasjon og oppdagelsen baner. Denne enheten er sammensatt av en timelig sammenhengende lyskilde (561 nm) koblet til SMF, fiber adapter, achromatic linse (f = 60 mm), iris og Ø1 "rør avstand i et bur system (figur 1C). Justere avstanden mellom fiber kortet og linsen bruker en klippe interferometer for å sikre kollimasjon.</li>
	<li>Forberede en bjelke justering verktøyet (figur 1D). Dette er et par aluminium innlegg med knappenålshull 2" høyde fra overflaten av optisk tabell, som gir raske og presise strålen justering.</li>
	<li>Montere en dobbel pinhole system som består av to Ø1 "jord glass justering disker i hver ende og to Ø1" objektiv rør (nederste er sprekk) som vist i figur 1E.</li>
</ol>2. konfigurere gjenkjenning banen
<ol><li>Ta ut målet og installere collimated lyskilden. Justere knotter av speilet (M1) under objektive holderen slik at output bjelken fra mikroskopet er omtrent parallell til tabellen optisk høyde og justert med gjenget hull på bordet. Se figur 2 for detaljert plasseringen av hver optisk komponent.</li>
	<li>Sett inn et multiband dichroic speil (DM) og reflektere strålen 90 grader. Bruk den maksimale størrelsen på iris og sørg for at strålen går gjennom midten av det dichroic speilet uten klipping.</li>
	<li>Bruke lekk strålen passerer gjennom det dichroic speilet for å styre justeringen av gjenkjenning banen. Plassere en sCMOS kameraet i strålen, og kontroller at strålen treffer midt på kameraet chip ved hjelp av to speil (M2 og M3).</li>
	<li>Sette inn en tube linse (TL, f = 300 mm) ca 300 mm fra kameraet.</li>
	<li>Fjern collimated lyskilden og justere den relative avstanden mellom rør linsen og kameraet til et mønster på taket er tydelig løst av kameraet.</li>
	<li>Sette inn flere band pass filter (BF) før røret linsen for multi-farge fluorescens bildebehandling.</li>
</ol>3. sette opp eksitasjon banen
<ol><li>Installere collimated lyskilden på objektive abonnenten. Plass en fold-speil (M4) å omdirigere strålen utdataene fra mikroskopet 90 grader. Juster knotter av det dichroic speilet og fold-speilet iterativt til strålen passerer knappenålshull i verktøyet strålen justering.</li>
	<li>Løsne collimated lyskilden og installere det på bordet, der strålen peker mot selve mikroskop. Juster strålen ved hjelp av en bjelke justering verktøyet og en dobbel pinhole.</li>
	<li>Sette inn en linse L4 (f = 400 mm; Ø = 2") til den optiske banen ca 400 mm fra objektive abonnenten. Installer linsen og justere plasseringen av L4 langs den optiske aksen til et perfekt luftige disk mønster dannet på taket. Merk: Når du setter inn linsen, strålen posisjonen passerer gjennom linsen bør holdes uendret. Linsen L4 har en SM2-tråd som tillater det å være festet/koblet fra den 60 mm SM2-threaded bur plate lett.</li>
	<li>Skru målsettingen og installere collimated lyskilden har en åpen blender. Spore ned strålen utdataene fra mikroskopet med et visittkort. Montere et speil M5 på der størrelsen på strålen er den minste og ca 400 mm fra L4, som er en konjugert bildet flyet (cIP).</li>
	<li>Installer et speil M6 og reflektere strålen 90 grader. Justere M5 og M6 iterativt med verktøyet strålen justering.</li>
	<li>Sette inn en linse L3 (f = 150 mm) omtrent 150 mm fra M5. Bruk en klippe interferometer for å sikre kollimasjon av utdata bjelken.</li>
	<li>Midlertidig ta bort L4 og spor ned strålen å finne fokal plasseringen L3. Sette en enkelt akse galvo speil på dette punktet, som er en konjugert tilbake fokalplanet (cBFP). Angi 0 volt til galvo speilet og rotere innehaver av galvo speilet slik at den gjenspeiler strålen 90 grader.</li>
	<li>Plass en fold-speilet M7. Skal plassere L2 (f = 100 mm) på samme måte som trinn 3.6.</li>
	<li>Fjern collimated lyskilden fra eieren av objektet. Installere en kollimasjon linse L1 (f = 100 mm), fiber adapter og iris. Koble en single-modus fiber til kortet og sende strålen gjennom tenkelig system.</li>
	<li>Sett inn L4 og finjustere systemet til et perfekt luftige disk mønster vises på taket.</li>
</ol>4. definere sylindriske linser
<ol><li>Sette inn en sylindrisk linse (CL1, f = 400 mm) etter L1 og sørge for at sylindriske objektivet fokuserer strålen langs x-aksen.</li>
	<li>Sett inn en annen sylindriske linse (CL2, f = 50 mm) banen bjelke. Bruk en klippe interferometer for å sikre utgang strålen er collimated. Merk: Avstanden mellom de to sylindriske linsene er 450 mm. Utgang strålen har en komprimering av 8 og en langstrakt oval formet luftige disk mønster dannet på taket.</li>
</ol>5. testing flis bildebehandling
<ol><li>Forberede 3D hydrogel prøven. Mix 20 nm Crimson perler med en hydrogel løsning, som består av 12% acrylamide:bisacrylamide (29:1), 0,2% (v/v) TEMED og 0,2% (w/v) ammonium persulfate 0,75 x TAE buffer. Injisere 50 µL av blandet løsningen i en flyt kammer som beskrevet andre steder11. Etter 10 min er 3D hydrogel prøven klar til avbildning.</li>
	<li>Sette prøven på prøven abonnenten. Aktivere 638 nm laser og justere makt til å < 1 mW for eksempel eksitasjon.</li>
	<li>Kjøre kontroll kameraprogramvaren. I kameraet oppkjøpet-innstillingen panelet velger internt i utløse modus og deretter ta video gratis kjøremodus.</li>
	<li>Finjustere plasseringen av kameraet slik at bildet er plassert i midten av kameraet når 0 volt brukes til galvo speilet.</li>
	<li>Rotere vannrett knotten på speilet M5 å oppnå en svært tilbøyelig belysning. Merk: Med økningen av belysning vinkel, hydrogel bildet blir klarere enn Epi bildet som strålen blir tynnere. Men holder bildet nesten samme posisjon.</li>
	<li>Ta flisen bildet. Beregne effektiv belysning bredde11. Figur 3 viser for eksempel effektiv belysning bredden på 12 µm.</li>
</ol>6. HIST tenkelig
<ol><li>Forberede en data oppkjøpet bord med en terminalblokken. Koble bruker 1 BNC-kontakt med P0.0 gjennom en elektrisk ledning. Bruke bruker 1 som en digital utgang for ekstern utløser sCMOS kamera. Koble en analog utgang AO0 til en galvo speil driver.</li>
	<li>Generere TTL puls tog fra P0.0 med et skreddersydd program (Figur 4A) og sette periode = 400 ms og t_ON = 2 ms. Sjekk de genererte pulser fra brukeren 1 BNC terminalen ved en digital oscilloskop og koble deretter til BNC-kabelen til kameraet ekstern utløser porten. NOTE Programvaren brukes i dette papiret er tilgjengelig på forespørsel. Når imaging på forskjellige kamera bildefrekvens, bør periode justeres tilsvarende.</li>
	<li>Starte feiende et galvo speil via skreddersydd program. Justere Vmin å-500 mV og Vmax til 500 mV for full FOV bildebehandling. Merk at under denne operasjonen, 3D hydrogel prøver fortsatt vise høye ligner på Epi belysning.</li>
	<li>Endre innstillingen for kameraet oppkjøpet.<ol>
<li>Velg eksterne utløse modus og ned (sekvensiell) i LightScan Plus rullegardinmenyen som vist i Figur 4B. Merk: I denne innstillingen, kameraet tar ikke bilder med mindre en utløser signal er aktivert.</li>
		<li>Klikk Skann hastighetskontroll for vinduet høyde og linje tid EKSPONERINGSKONTROLL og sette det verdier å være 180 rader og 28 ms, henholdsvis. Merk: Når en flis bredde (Weff) er 180 rader (12 µm) og en integrasjon per linje (Tint) er 28 ms, tidsforsinkelse mellom linjene (TD) bestemmes som TD = Tint/Weff = 0.156 ms. For imaging 2048 x 2048 piksler, den totale anskaffelseskosten er 2048 x TD + Tint = 346 ms, tilsvarer ~2.9 fps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Finjustere V-max og Vmin å få klarere bilder.</li>
	<li>Få 3D stakk bilder ved hjelp av skreddersydd programmet ved å bytte på 3D-stabel ON og angir antall stakker og trinn størrelsen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li><li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+dynamic+structural+biology:+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer.">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression.">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li><li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope.">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li><li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope.">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples.">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047 (2011).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641 (2015).</li><li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet.">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123 (2018).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination.">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li><li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution.">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li><li>Sink&#243;, J., Szab&#243;, G., Erd&#233;lyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques.">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li></ol>

University of Central Florida har arkivert en patent dekker arbeidet som er beskrevet i denne artikkelen.

Det er to avgjørende skritt i denne protokollen. Den første er riktig plassering av L4 i trinn 3.3, sikre at hendelsen strålen går gjennom midten av linsen og en perfekt luftige disk mønster dannet på taket. Plasseringen av L4 bestemmer plasseringen av alle de andre optisk komponentene, inkludert M5, L3, GM og L2. Det andre kritiske trinnet er synkroniseringsprosessen. For å avslå ute av fokus bakgrunn, synkroniseres aktive piksler som effektive sporingsbredde tilsvarer flis bredde med strålen feiende. Derfor er det nødvendig å mål vidden effektiv belysning av en flis bredde (trinn 5.6) og angi kameraenes parametere tilsvarende i trinn 6.4.
Når imaging med stor FOV, viser metoden presentert en økt bakgrunn på en side i forhold til den andre siden. Dette tilskrives litt annerledes vinkler av belysning forskjellige tenkelig posisjoner. Implementere en andre galvo speilet i stedet for M5 lindrer problemet som demonstrert før av synkront justere plasseringen og skanning vinkel11. I stedet for rett akromatisk doublets, vil en telesentrisk skannelinsen også være nyttig. Men for imaging et < 8,080 µm2, enkelt galvo speil feiende var tilstrekkelig. HIST mikroskopi har en grense på tenkelig dybden, men det er kunne få en god SBR når imaging opptil ~ 15 µm med en 12 µm flis bredde og en NA 1.45 olje nedsenking linsen11.
I denne protokollen brukte vi en bjelke komprimering av 8 for å gjøre en flis bredde. En tynnere belysning kan brukes i HIST mikroskopi for å oppnå høyere SBR, som kan være kraftig for single-molekylet vev imaging11. Men i dette tilfellet bør photobleaching effekt vurderes av en økt eksitasjon intensitet mens gjeldende strålen komprimeringsforholdet viste redusert photobleaching i 3D imaging forhold til Epi11. Sammenlignet med lys arks mikroskop med to ortogonalt plassert mål, er HIST mikroskopi enkel å implementere og kompatibel med konvensjonelle eksempel forberedelser. Den forbedrede SBR og store FOV av HIST mikroskopi er egnet for å studere samhandling og dynamikken i ett biomolecules i flere celler og kan brukes mer i super-oppløsning bildebehandling og enkelt-molekylet sporing.

Single-molekylet fluorescens imaging spiller en viktig rolle i mange biologiske studier som avslører ultrastructures, dynamikk og antallet biomolecules1,2,3. Imidlertid har det vært utfordrende for å studere single-molekyler innenfor eller vev. Mens AC confocal mikroskopi gir høy snitting evne4, er det ikke egnet for enkelt-molekylet bildebehandling på grunn av alvorlig photobleaching av høy eksitasjon intensitet eller tenkelig treghet. Widefield mikroskopi bruker svakere belysning, men lider av en dårlig signal til bakgrunnen forholdet (SBR)5. Lys arks mikroskopi, derimot, kunne vise gode snitting og lav photobleaching6; Imidlertid er tilgjengelige numeriske blenderåpning (NA) sterkt begrenset av kravet til ortogonalt plassert mål7. Alternativt, det krever spesiell belysning og prøve kamre8,9.
For disse grunner, har svært tilbøyelig og laminert optisk ark (HILO) mikroskopi vært mye brukt for 3D single-molekylet imaging10. Når en tilbøyelig stråle møter et grensesnitt av to medier (glass og vann, for eksempel), er strålen brytes ifølge Snells lov. Viktigere, refracted strålen blir tynnere og tykkelse er beskrevet som dz = R/tan(θ) hvor R er diameteren på tilbøyelig strålen og θ er brytning vinkelen på overført strålen. Denne enkel implementering gir en god snitting evne. Likevel, dette forholdet angir at en tynn belysning (dvs. høyt snitt kapasitet) krever en liten R og/eller en stor θ. For eksempel, når R = 20 µm og θ = 72 grader, kan man få dz = 6,5 µm. Det er en praktisk grense for å øke brytning vinkelen for å image dypt inne celler og unngå total intern refleksjon, er det en sterk kopling med belysning diameter og strålen tykkelsen. Derfor viser HILO imaging en relativt liten felt-of-view (FOV) som sterkt begrenser dens søknadene i flercellet bildebehandling.
Nylig har vi løse dette problemet ved svært tilbøyelig feiet flis (HIST) mikroskopi der FOV er skilt fra strålen tykkelsen i en svært enkel måte11. Først genereres en bjelke langstrakte i én retning via et par sylindriske linser. Denne strålen, betegnes som en brikke, produserer en tynn belysning med dz ~ 4 µm mens dens FOV er 130 x 12 µm2. Deretter er flisen blåst over utvalget med et roterende galvo speil. I mellomtiden er fluorescens bildet lagret på en vitenskapelig complementary metal oxide semiconductor (sCMOS)-kamera som filtrerer effektivt ut-av-fokus bakgrunn i en rullende nedleggelse modus som fungerer som tunable AC confocal slit gjenkjenning. På denne måten kan HIST mikroskopi enkelt-molekylet bildebehandling med et større synsfelt (~ 130 x 130 µm2) og en tynnere belysning enn HILO bildebehandling. Vi brukte dette nye imaging teknikk for å oppdage RNA utskrifter med en enkelt sonde i celler eller et par sonder i musen hjernen vev, som har et betydelig potensial for å studere genuttrykk og sykdommer. I motsetning til andre tilnærminger, HIST har bare et enkelt høy numeriske blenderåpning mål uten en ekstra illuminator eller ekstern oppdagelsen mål og er fullt kompatibel med invertert mikroskop. Fordelene med en stor FOV og høy kontrast vil gjøre HIST mikroskopi et fremtredende verktøy i biologi og medisin. Vi presenterer detaljerte instruksjoner om instrumentering av HIST mikroskopet, og hvordan å teste og kalibrere ytelsen som nedenfor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-060-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">Collimator&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-100-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L1,L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-300-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">TL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Broadband Dielectric Mirrors</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">BB1-E02-10</td>
			<td style="width:225px;">M1~M7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Cylindrical Lenses</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LJ1363RM-A</td>
			<td style="width:225px;">CL1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Cylindrical Lenses</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LJ1695RM-A</td>
			<td style="width:225px;">CL2</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:88px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:151px;">58-857</td>
			<td style="width:225px;">For dichroic mirror mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP02</td>
			<td style="width:225px;">For holding other lenses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC508-150-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC508-400-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LCP01</td>
			<td style="width:225px;">For holding L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LCP01T</td>
			<td style="width:225px;">For holding L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2% Bis Solution</td>
			<td style="width:88px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">64085292</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 nm fluorescent beads</td>
			<td style="width:88px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:151px;">F8782</td>
			<td style="width:225px;">For testing imaging</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">KCB1</td>
			<td style="width:225px;">For objective &#38; camera mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30mm Cage System Iris</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP20S</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3-Axis NanoMax Stage</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">MAX311D</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% Acrylamide Solution</td>
			<td style="width:88px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">64148001</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">405 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-MLD</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50x TAE buffer</td>
			<td style="width:88px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0743</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-DPL</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">638 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-MLD</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beam alignment tool</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">BNC terminal blocks</td>
			<td style="width:88px;">Natural Instruments</td>
			<td style="width:151px;">BNC-2110</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Cage plate with M9 x 0.5 internal threads</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP1TM09</td>
			<td style="width:225px;">For holding aspheric lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cage System Rods</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SR series</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture &#38; smFISH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;">See a reference [11]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double side tape&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Scotch</td>
			<td style="width:151px;">515182</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Devcon</td>
			<td style="width:151px;">14250</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galvo mirror</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">GVS211</td>
			<td style="width:225px;">GM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">GPS011</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Half wave plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">WPH10M-405/561/633</td>
			<td style="width:225px;">Power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">long-pass dichroic mirror</td>
			<td style="width:88px;">Chroma</td>
			<td style="width:151px;">T550lpxr</td>
			<td style="width:225px;">For combining lasers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:88px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12549-3</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Mikroskopische Deckglaser</td>
			<td style="width:88px;">Hecht Assistent</td>
			<td style="width:151px;">990/5024</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Mounted Frosted Glass Alignment Disk</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">DG10-1500-H1-MD</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mounted rochester aspheric lens</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">A230TM-A</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Multi-band dichroic mirror</td>
			<td style="width:88px;">Semrock</td>
			<td style="width:151px;">Di03-R405/488/561/635-t3</td>
			<td style="width:225px;">DM; 3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Multi-band filter</td>
			<td style="width:88px;">Semrock</td>
			<td style="width:151px;">FF01-446/523/600/677-25</td>
			<td style="width:225px;">BF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode fiber</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">M31L02</td>
			<td style="width:225px;">MMF</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyl ethylenediamine</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T7024-25ML</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">NI-DAQ board</td>
			<td style="width:88px;">Natural Instruments</td>
			<td style="width:151px;">PCI-6733</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#216;1&#34; Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">KM100</td>
			<td style="width:225px;">For holding mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective lens</td>
			<td style="width:88px;">Olympus</td>
			<td style="width:151px;">PLANAPO N 60X</td>
			<td style="width:225px;">60X 1.45NA oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pedestal Base Clamping Forks</td>
			<td style="width:88px;">Newport</td>
			<td style="width:151px;">9916</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pedestal Pillar Posts</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">RS1P8E</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Piezo controller</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">BPC303</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized beam splitter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">PBS251</td>
			<td style="width:225px;">For combining lasers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RMS-SM1 adapter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1A3TS</td>
			<td style="width:225px;">For objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rod holder</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotation cage mount&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">RSP1/CRM1/CRM1P</td>
			<td style="width:225px;">For HWP &#38; cylindrical lens mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:88px;">Andor</td>
			<td style="width:151px;">Zyla-4.2P-CL10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SI100</td>
			<td style="width:225px;">Beam collimation test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">P5-405BPM-FC-2</td>
			<td style="width:225px;">SMF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SM1 Lens Tubes</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1S25</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SM1 Slotted Lens Tube</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1L30C</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stage mount</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">threaded fiber adapter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1FC</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Z-Axis Translation Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1Z</td>
			<td style="width:225px;">Fiber coupling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to build a highly inclined swept tile microscope for extended field-of-view single-molecule imaging

Single-molekylet bildebehandling har sterkt avanserte vår forståelse av molekylære mekanismer i biologiske studier. Men er det utfordrende å få store felt-of-view, høy kontrast bilder i tykke celler og vev. Her introduserer vi sterkt tilbøyelig feiet flis (HIST) mikroskopi som overvinner dette problemet. Et par sylindriske linser ble gjennomført for å generere en langstrakt eksitasjon strålen som ble skannet over et stort tenkelig område via en rask galvo speil. En 4f konfigurasjon ble brukt til å plassere optisk komponenter. En vitenskapelig complementary metal oxide semiconductor kamera oppdaget fluorescens signalet og blokkert ut-av-fokus bakgrunnen med et dynamisk AC confocal slit synkronisert med strålen feiende. Vi presenterer en trinnvis instruksjon bygge HIST mikroskopet med alle grunnleggende komponenter.

Som et eksempel, enkelt-strandet DNA merket med Atto647N ble avbildet med en eksitasjon bølgelengden til 638 nm i en 3D hydrogel. DNA var forankret til hydrogel via en acrydite moiety under gel polymerisasjon. Bildene ble tatt på 5 µm over overflaten som vist i figur 5en. HIST bildet viste mye mindre bakgrunnen sammenlignet Epi bildet, som signal bakgrunn forhold beregnet til 1,9 ± 0,7 for HIST bildet mens de fleste av de eneste molekyl stedene kunne knapt være oppdaget av Epi.
Single-molekylet RNA fluorescens i situ hybridisering (smFISH) ble utført med 4 fisk sonder. Figur 5 b viser smFISH bilder av EEF2 (eukaryote oversettelse forlengelse faktor 2) merket med AlexaFluor 647 på A549 celler i en tenkelig buffer (se vår tidligere arbeid om eksempel forberedelse11). En maksimale intensitet projeksjon ble utført på 20 z-stabler tilsvarer 5 µm tykkelse. HIST bildet viste ikke bare mye bedre SBR men også mer jevn belysning sammenlignet Epi bilde. For Epi bildebehandling, eksponeringstid var 400 ms mens HIST imaging integrering tid per linje var 32 ms, begge hadde samme belysning kraft 7.5 mW målt før målet. Tenkelig hastigheten på Epi og HIST var 2,5 fps.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg"> Figur 1 . Mikroskopet kropp, lasere og justering verktøy. (A) mål og eksempler. (B) bilde av laser systemer. LP, lang-pass dichroic speil. Λ/2, halv-bølge platene. PBS, polariserende beamsplitter. (C) Collimated lyskilde. (D) stråle justering verktøyet med to insertable pinholes. (E) dobbel pinhole system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg"> Figur 2 . Detaljert oppsett for svært tilbøyelig feiet flis (HIST) mikroskopi. Bilde (A) og skjematisk (B) av HIST mikroskop. BF, flere bånd-pass filter; CL1-2, sylindriske objektiver; DM, dichroic speil. GM, galvo speil. BF, bånd-pass filter; M1-7, speil; L1-4 linser; SMF, single-modus fiber; TL, rør linsen; cIP, konjugert bilde fly; cBFP, bøyd tilbake fokalplanet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg"> Figur 3 . Flis belysning med en komprimering av 8. (A) fluorescens bilde av 20 nm perler i en 3D hydrogel. Skala bar, 20 µm. (B) standardavvik projeksjon y retning A, glattet av 10 datapunkt. Den røde pilen viser en effektiv belysning bredden på 12 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg"> Figur 4 . Kontroll og bildebehandlingsprogrammer foran paneler. (A) A skreddersydd LabView programmet synkront kontrollerer skanningen av galvo speilet, start oppkjøpet av sCMOS kamera og bevegelse av piezo scenen. (B) kamera Kjøp innstillingen Kontrollpanel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg"> Figur 5. (A) bilder av Atto647N-merket DNA i en 3D hydrogel med Epi og HIST belysning. (B) smFISH bilder av EEF2 bruker 4 fisk sonder på A549 celler av Epi og HIST mikroskopi. DAPI flekk vises i blått. Skalere barer, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging at JoVE.com

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

En detaljert instruksjon er beskrevet på hvordan bygge et sterkt tilbøyelig feide flis (HIST) mikroskop og bruksområdene for single-molekylet bildebehandling.

En Guide til å bygge et sterkt tilbøyelig feide flis mikroskop for utvidet felt-of-view Single-molekylet Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Vår metode gjør det mulig for oss å visualisere enkeltmolekyler med et 40 ganger større bildeområde enn konvensjonelle metoder, og har et sterkt redusert bakgrunnssignal. I motsetning til andre teknikker bruker vår tilnærming en enkelt objektiv linse, krever ikke et spesielt prøvekammer, og det er lett kompatibelt med kommersielle mikroskopsystemer. Etter å ha samlet de nødvendige komponentene begynne å bygge systemet.Her er flere elementer allerede på plass på benken. Montert på en aluminiumblokk er et mikroskop kropp med en Piezo scene og prøveholder. Også på benken er tre lasere og optiske elementer for å kombinere bjelkene.De kombinerte bjelkene er koblet til en enkelt modus fiber så effektivt som mulig. Som et siste foreløpig skritt, montere en kollidert lyskilde i et bur system. Dette har en midlertidig sammenhengende lyskilde koblet til en enkelt modus fiber, en fiberadapter, achromatic linse og iris.Begynn å arbeide med gjenkjenningsbanen. Plasser først den kolleerte lyskilden i mikroskopets objektive port. Juster speilet under målene slik at utgangsstrålen er omtrent horisontal og på linje med benkens hull.Sett inn et dichroic speil i strålebanen og reflektere strålen med 90 grader. Legg til speil for å tillate justering av den overførte strålens bane til et sCMOS-kamera. Bruk speilene for å sikre at strålen treffer midten av brikken.Deretter setter du inn en 300-milliliter brennvidde rørlinse om en brennvidde fra kameraet. Fjern den kolleinerte lyskilden fra mikroskopet. Juster deretter plasseringen av rørlinsen for å stille inn fokusplanet.Stopp justeringene når kameraet tydelig løser mønsteret i taket. Gjenkjenningsbanen er avbildet i denne skjematiske. Legg merke til tilsetning av et multi-band pass filter før rørlinsen for flerfarget fluorescensavbildning.Gå tilbake til mikroskopet. Der installerer du den kolleerte lyskilden på plass igjen i målholderen. Etter det dichroic speilet, plasser et brettspeil i banen til den reflekterte strålen for å omdirigere den med 90 grader.Fjern den kolleinerte lyskilden fra mikroskopet og plasser den i nærheten. Deretter setter du inn en 400 millimeter brennvidde linse på omtrent en brennvidde fra speilet. På mikroskopet kroppen installere objektivet.Juster deretter speilets posisjon langs den optiske aksen. Vær oppmerksom på taket over målet og stopp når et perfekt luftaktig diskmønster dannes der. Fjern nå målet og installer den kolleerte lyskilden på nytt med en åpen iris.Bestem hvor bjelken er minst på ca. 400 millimeter fra speilet langs strålebanen. Når punktet er identifisert, montere et speil der, et konjugert bildeplan. Tilstanden til oppsettet på dette tidspunktet vises i denne skjematiske.Speilet som nettopp er lagt til er merket M5. Sett inn et annet speil for å reflektere strålen 90 grader og monter en 150 millimeter brennvidde linse utover den. Linsen skal være 150 millimeter fra det konjugerte bildeplanet. Deretter tar du midlertidig bort det første objektivet i eksitasjonsstrålebanen.Med denne konfigurasjonen finner du brennposisjonen til det andre objektivet. Plasser en enkelt akse galvo speil på dette fokuspunktet som en konjugert tilbake fokalplan. Tilsyne null volt til galvospeilet og roter holderen slik at den reflekterer strålen 90 grader.Deretter langs strålebanen plasserer du et brettspeil som reflekterer strålen ved 90 grader. Plasser linsen 100 millimeter langs strålebanen fra det konjugerte tilbakefokalplanet. Igjen, fjern den kolleinerte lyskilden fra mikroskopfestet.Tilsett en annen 100-millimeter collimation linse med en fiberadapter og enkeltmodus fiber sammen med en iris. Bruk deretter iris, fiber og linse til å sende en kollidert stråle gjennom bildesystemet. Deretter setter du inn en sylindrisk linse av brennvidde 400 millimeter like før den siste kollideringslinsen i strålebanen.Bruk den til å fokusere strålen. Sett inn en 50-millimeter sylindrisk linse 450 millimeter foran den første. Dette er en skjematisk representasjon av det endelige oppsettet med både gjenkjennings- og eksitasjonsbanene.Utgangen av de tre lasere er koblet inn i banen av enkeltmodus fiber. For testing forberede en 3D hydrogel prøve. Denne består av 20 nanometer røde perler blandet med hydrogel.Ved oppsettet plasserer du hydrogelprøven i prøveholderen. For prøve eksitasjon slå på 638-nanometer laser og justere sin makt til mindre enn ett milliwatt. Konfigurer kamerakontrollprogramvaren i intern utløsermodus og ta opp video.På dette punktet galvo motoren har null volt påført. Plasser kameraet slik at bildet står i midten av objektivet. Deretter justerer du speilet som er konjugatbildeplanet.Drei den horisontale knotten på speilet for å oppnå en svært tilbøyelig belysning. Ta opp flisbildet som i prøven fluorescens bilde av 3D hydrogel med 20-nanometer perler. Vektstangen er 20 mikrometer.Fortsett etter at du har satt opp maskinvare og programvare for å feie galvospeilet. Dette er galvo speil feie programvare for oppsettet. Ordne for full field-of-view bildebehandling ved å sette Vmin til minus 500 millivolts.Sett deretter Vmax til 500 millivolt. Deretter bytter du til programvaren for kameraanskaffelse. Velg Ekstern i utløsermodus.Velg Ned neste under rullegardinmenyen LightScan PLUS. Visse kontrollparametere kan nå angis. Skriv inn 180 rader under Vindushøyde.Under Eksponering angi 28 millisekunder. Når du er ferdig, går du tilbake til programvaren for speilkontroll. I speilkontrollprogramvaren slå på 3D-stabler PÅ. Angi antall stabler og trinnstørrelsen.Klikk ta video for å starte opptak av bilder. Dette er et eksempel på Epi imaging av single-strandet merket DNA. Derimot produserte den svært tilbøyelige feide flisteknikken dette bildet.HIST-bildet viser mindre bakgrunn sammenlignet med Epi-bildet. DNA er i en 3D hydrogel, og eksitasjon bølgelengde er 638 nanometer. Her er et Epi bilde av merket eukaryotisk oversettelse forlengelse faktor 2.HIST-bildet har forbedret signal-til-bakgrunn-forhold. Den har også mer ensartet belysning. Begge har samme belysningskraft på 7,5 milliwatt.Bildehastighetene var begge 2,5 bilder per sekund. Det er viktig å hele tiden holde en høy hellingsvinkel, og synkronisere det feiende speilet med kameraets avlesning. Dette garanterer et høyt signal-til-bakgrunn-forhold under bildeanskaffelse.Vi forventer at HIST-mikroskopi vil være til nytte for flere bruksområder, inkludert superoppløsningsbilder på dypere bildedybder og høyt gjennomstrømmingsgenuttrykk profilering i tykke vevskiver.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Fra voxel til Kunnskap: En praktisk guide til Segmentering av Complex Elektronmikros 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

Microfluidic Genipin Nedfall Technique for Extended Culture of Micropatterned Vaskulær Muskuløse Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide til Strukturert Illumination TIRF Mikros i høy hastighet med flere farger

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Gjennomføre flere Imaging modi med en fluorescens mikroskopet

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...