En Guide till att bygga ett starkt lutande svepte kakel Mikroskop för utökat fält-of-view Single-molekyl Imaging

Vår metod gör att vi kan visualisera enstaka molekyler med en 40 gånger större bildyta än konventionella metoder, och har en kraftigt reducerad bakgrundssignal. Till skillnad från andra tekniker vår strategi använder en enda objektiv, inte kräver en speciell provkammare, och det är lätt kompatibel med kommersiella mikroskop system. Efter att samla de nödvändiga komponenterna börja bygga systemet.

Här är flera element redan på plats på bänken. Monterad på ett aluminiumblock är en mikroskopkropp med en Piezo-scen och provhållare. Också på bänken är tre lasrar och optiska element för att kombinera balkarna.

De kombinerade balkarna kopplas ihop till en enda lägesfiber så effektivt som möjligt. Som ett sista preliminärt steg, montera en kollimerad ljuskälla i ett bursystem. Detta har en tillfällig sammanhängande ljuskälla ansluten till en enda läge fiber, en fiberadapter, akromatisk lins och iris.

Påbörja arbetet med identifieringsvägen. Placera först den kollimerade ljuskällan i mikroskopkroppens objektiva port. Justera spegeln under målen så att utgångsstrålen är ungefär horisontell och i linje med bänkens hål.

Sätt in en dikroisk spegel i strålbanan och reflektera strålen med 90 grader. Lägg till speglar för att tillåta justering av den överförda strålens väg till en sCMOS-kamera. Använd speglarna för att säkerställa att strålen träffar mitten av chipet.

Därefter sätter du in en 300-milliliter brännvidd rör lins om en brännvidd från kameran. Ta bort den kollimerade ljuskällan från mikroskopkroppen. Justera sedan rörets placering för att kunna ställa in sitt fokalplan.

Stoppa justeringarna när kameran tydligt löser mönstret i taket. Detekteringsvägen avbildas i detta schematiska. Observera tillsats av ett flerbandspassfilter före rörlinsen för multicolor fluorescensavbildning.

Återvänd till mikroskopkroppen. Där, installera om den kollimerade ljuskällan i den objektiva innehavaren. Efter den dichroic spegeln, placera en vik-spegel i vägen för den reflekterade strålen att omdirigera den med 90 grader.

Ta bort den kollimerade ljuskällan från mikroskopkroppen och placera den i närheten. Därefter sätter du in en 400-millimeters brännvidd lins på ungefär en brännvidd från spegeln. Vid mikroskopet kroppen installera objektivet.

Justera sedan spegelns position längs den optiska axeln. Observera taket ovanför målsättningen och stanna när ett perfekt Airy diskmönster bildas där. Nu ta bort målet och installera om den kollimerade ljuskällan med en öppen iris.

Bestäm var längs balken väg balken är minst på ca 400 millimeter bort från spegeln. När punkten är identifierad, montera en spegel där, ett konjugerat bildplan. Läget för uppsättningen på denna punkt visas i denna schematiska.

Spegeln just lagt är märkt M5. Sätt in en annan spegel för att återspegla strålen 90 grader och montera en 150-millimeters brännvidd lins bortom den. Linsen ska vara 150 millimeter från det konjugerade bildplanet. Därefter tar tillfälligt bort den första linsen i excitationsstrålens väg.

Med denna konfiguration hitta den fokala positionen för den andra linsen. Placera en enda axel galvo spegel vid denna brännpunkt som en konjugerad tillbaka fokalplan. Tillförsel noll volt till galvo spegeln och rotera dess hållare så att den reflekterar strålen 90 grader.

Nästa längs strålvägen, placera en vik-spegel som reflekterar strålen i 90 grader. Placera linsen 100 millimeter längs strålbanan från det konjugerade tillbaka fokalplanet. Ta återigen bort den kollimerade ljuskällan från mikroskopfästet.

Lägg till ytterligare 100-millimeters kolllimeringslins med en fiberadapter och enstaka lägesfiber tillsammans med en iris. Använd sedan iris, fiber och lins för att skicka en collimated balk genom bildsystemet. Därefter sätter du in en cylindrisk lins med brännvidd 400 millimeter strax före den sista kollimationslinsen i strålbanan.

Använd den för att fokusera strålen. Sätt in en 50-millimeters cylins 450 millimeter framför den första. Detta är en schematisk representation av den slutliga inställningen med både identifierings- och excitationssökvägarna.

Utmatningen av de tre lasrarna kopplas ihop in i banan av singeln funktionslägefibern. För testning förbereda en 3D hydrogel prov. Den här består av 20-nanometer crimson pärlor blandat med hydrogel.

Vid uppställningsplatsen placera hydrogelprovet i provhållaren. För provexcitation slå på 638-nanometer laser och justera dess effekt till mindre än en milliwatt. Ställ in kamerans kontrollprogramvara i internt avtryckarläge och fånga video.

Vid denna punkt galvomotorn har noll volt tillämpas. Placera kameran så att bilden står i objektivets mitt. Justera därefter spegeln som är konjugatbildplanet.

Rotera den horisontella ratten på spegeln för att uppnå en mycket lutande belysning. Spela in kakel bilden som i provet fluorescens bild av 3D hydrogel med 20-nanometer pärlor. Skalstången är 20 mikrometer.

Fortsätt efter att ha satt upp hårdvara och mjukvara för att sopa galvo spegeln. Detta är den galvo spegeln sopa programvara för setup. Ordna för fullständig bildtagning med synfält genom att ange Vmin till minus 500 millivolt.

Ställ sedan Vmax på 500 millivolt. Därefter byter du till programvaran för kameraförvärv. I Utlösarläge välj Externt.

Under rullgardinsmenyn LightScan PLUS välj Ned nästa klickar du på Scan Speed Control. Nu kan vissa styrparametrar ställas in. Under Fönsterhöjd ange 180 rader.

Under Exponering skriver in 28 millisekunder. När det är klart, återgå till spegeln kontroll programvara. I spegeln kontroll programvara switch på 3D-stackar ON. Ange antalet stackar och stegstorleken.

Klicka på ta video för att börja spela in bilder. Detta är ett exempel på Epi imaging av enkelsträngat märkt DNA. Däremot producerade den mycket lutande svepte kakel teknik denna bild.

HIST-bilden visar mindre bakgrund jämfört med Epi-bilden. DNA:t finns i en hydrogel i 3D, och excitationsvåglängden är 638 nanometer. Här är en Epi bild av märkta eukaryota översättning töjning faktor 2.

HIST-bilden har förbättrat signal-till-bakgrundsförhållande. Den har också mer enhetlig belysning. Båda har samma belysningseffekt på 7,5 milliwatt.

Bildhastigheterna var båda 2,5 bilder per sekund. Det är viktigt att ständigt hålla en hög lutning vinkel, och synkronisera svepande spegel med kameran avläsning. Detta garanterar ett högt signal-till-bakgrundsförhållande under bildförvärv.

Vi förväntar oss att HIST mikroskopi kommer att gynna flera tillämpningar inklusive super-upplösning imaging på djupare bildframställning djup och hög genomströmning genuttryck profilering i tjock vävnad skivor.