Name: a guide to build a highly inclined swept tile microscope for extended field-of-view single-molecule imaging
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging at JoVE.com

Bu eser savunma ileri araştırma projeleri Ajansı (DARPA) (HR00111720066) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) (1805200) tarafından desteklenmiştir. Michael Serge Andor teknolojisinde cömertçe sCMOS kamera ödünç verdiğin için teşekkür ediyoruz.

1. mikroskop, lazerler ve hizalama araçlar kadar ayarlama
<ol><li>Mikroskop oluşturmadan önce optik, optomechanics ve Malzemeler tabloiçinde listelendiği gibi elektronik de dahil olmak üzere gerekli tüm bileşenlerin hazırlayın.</li>
	<li>Mikroskop gövdesi çoğunlukla oluşan iki bölümden hazırlamak: bir RMS dişli bağlantı noktası ve bir piezo-sahne ile bir objektif sahibi monte alüminyum blokta (şekil 1A). Not: Özel yapım mikroskop vücut rahatlık ve esneklik araçları12için kullanılır. Herhangi bir ticari olarak mevcut mikroskop vücut HIST mikroskopi için kullanılabilir.</li>
	<li>Birden fazla lazer satır birleştirerek ve onları bir tekli mod fiber kaplin<ol>
<li>Yükleme 405, 561, 638 nm lazerler optik üzerine tablo ve şekil 1' deBgösterildiği gibi ışınları polarize bir ışın ayırıcı ve bir uzun taramalı dikroik ayna aracılığıyla birleştirmek. Tüm lazer ışınları hizalama araç iğne başarılı emin olun. Güç ayarı için yarım dalga tabak yerleştirin. Not: göz koruması için koruyucu gözlük giymek ve kiriş-bloklar istenmeyen lazer ışınları absorbe için kullanın.</li>
		<li>Bir lif kaplin lens yüklemek (f = 4,5 mm) ve bir lif bağdaştırıcısı bir kafes sistemi ile z ekseni çevirmen.</li>
		<li>Multimod fiber (MMF, Ø 62.5 µm) fiber adaptöre bağlayın. Her lazer kaplin verimliliği % 95'den daha yüksek olana her çifti direksiyon ayna ve z-çevirmen ayarlayın. Çıkış ışını çevre Gauss şeklindeki sahip benek desenleri vardır.</li>
		<li>Multimod fiber götürün ve bir tekli mod fiber (SMF) bağlayın. MMF, benzer ince ayarlarını yapmak ve üç lazer kaplin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işın uyum içinde uyarma ve algılama yolları için kullanılan collimated bir ışık kaynağı bir araya getirin. Bu aygıt geçici tutarlı bir ışık kaynağı oluşmaktadır (561 nm) SMF, fiber adaptörü, achromatic objektif bağlı (f = 60 mm), Iris ve Ø1 "spacer bir kafes sistemi (şekil 1C) tüp. Fiber bağdaştırıcısı ve kolimasyon emin olmak için bir kesme Girişmölçeri kullanarak lens arasındaki mesafeyi ayarlamak.</li>
	<li>Bir ışın hizalama araç (şekil 1D) hazırlayın. Bu yükseklikte 2" yüzeyden hızlı ve hassas ışın hizalamasını sağlayan optik tablo, iğne ile alüminyum mesajların bir çift var.</li>
	<li>Hangi oluşmak-iki Ø1 bir çift iğne deliği sistemi montajı "zemin cam hizalama diskler her tarafında ve iki Ø1" lens tüpler (alttaki yarıklı) şekil 1'Egösterildiği gibi.</li>
</ol>2. algılama yolunu ayarlama
<ol><li>Amaç almak ve collimated ışık kaynağı yükleyin. Çıktı ışın--dan mikroskop kabaca masanın üzerinde dişli delikler ile paralel olarak optik masa yüksekliği ve hizalanmış ayna (M1) düğmeleri altında objektif sahibi ayarlamak. Şekil 2 için optik her bileşen detaylı pozisyonlar için bakın.</li>
	<li>Çok bantlı dikroik ayna (DM) takın ve ışın 90 derece yansıtacak. İris en büyük boyutunu kullanın ve ışını dikroik ayna kırpma olmadan ortasına geçer emin olun.</li>
	<li>Sızdıran ışını dikroik ayna aracılığıyla geçen algılama yol hizalama kılavuzunu kullanın. Bir sCMOS fotoğraf makinesini kiriş yerleştirin ve ışın iki aynalar (M2 ve M3) kullanarak kamera çip ortasına isabet emin olun.</li>
	<li>Bir tüp lens takın (TL; f = 300 mm) yaklaşık 300 mm kamera uzak.</li>
	<li>Collimated ışık kaynağı kaldırmak ve tavanda bir desen açıkça kamera tarafından çözülene kadar tüp objektif ve kamera göreli aralıklarını ayarlayın.</li>
	<li>Çoklu bant geçiren Filtre (BF) tüp objektif önce çok renkli floresan görüntüleme için ekleyin.</li>
</ol>3. uyarma yolunu ayarlama
<ol><li>Collimated ışık kaynağı üzerinde objektif sahibi eski mevkiini geri vermek. Bir kat-ayna (ışın çıkışı yeniden yönlendirmek için M4) 90 derece--dan mikroskop yer. Işın ışın hizalama aracı iğne delikleri aracılığıyla geçene kadar dikroik ayna ve kat-ayna kolları yinelemeli olarak ayarlayın.</li>
	<li>Collimated ışık kaynağı bağlantısını kesin ve ışın doğru mikroskop beden puan tablosu, yükleyin. Bir ışın hizalama araç ve bir çift iğne deliği sistemi kullanarak ışın hizalayın.</li>
	<li>Bir lens L4 Ekle (f = 400 mm; Ø 2"=) optik yol yaklaşık 400 mm objektif sahibi uzak için. Objektif lens yükleyin ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda oluşan kadar optik eksen boyunca L4 konumunu ayarlamak. Not: objektif eklerken, lens aracılığıyla geçen ışın pozisyonu değişmeden tutulmalıdır. Objektifin L4 kolayca/60 mm'den SM2 dişli kafes plaka müstakil bağlı olmasını sağlayan bir SM2 iş parçacığı vardır.</li>
	<li>Objektif sökün ve açık bir iris ile collimated ışık kaynağı yeniden yükleyin. Kartvizit mikroskopla ışın çıktısı aşağı izleme. Işın boyutunu en küçük nerede yerde bir ayna M5 dağ ve yaklaşık 400 mm L4, uzak olan bir konjüge görüntü (CIP) uçağıdır.</li>
	<li>Bir ayna M6 yüklemek ve ışın 90 derece yansıtmaktadır. M5 ve M6 yinelenen ışın hizalama araç ile ayarlayın.</li>
	<li>Bir lens L3 Ekle (f = 150 mm) yaklaşık 150 mm M5 uzak. Bir kesme Girişmölçeri çıktı ışın kolimasyon emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Geçici olarak L4 ve ışın aşağı izleme L3 odak konumunu bulmak için götürmek. Konjuge geri odak düzlemi (cBFP) olan bir tek eksen galvo ayna bu noktada, koydum. 0 volt galvo aynaya tedarik ve böylece 90 derece ışın yansıtır galvo ayna tutucu döndürün.</li>
	<li>Bir kat-ayna M7 yerleştirin. Düzgün L2 yere (f = 100 mm) adım 3.6 olarak aynı şekilde.</li>
	<li>Nesne sahibinden collimated ışık kaynağı kaldırın. Kolimasyon objektif L1 yüklemek (f = 100 mm), fiber bağdaştırıcısı ve Iris. Tekli mod fiber adaptörüne bağlayın ve görüntüleme sistemi ışını gönderin.</li>
	<li>L4 yeniden takın ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda görünene kadar ince ayar sistem.</li>
</ol>4. silindirik mercekler kurma
<ol><li>Silindirik bir lens takın (CL1, f = 400 mm) sonra L1 ve silindirik objektif x ekseni boyunca ışını odaklanır emin olun.</li>
	<li>Başka bir silindirik lens takın (CL2, f = 50 mm) ışın yolu için. Bir kesme Girişmölçeri çıktı ışın collimated emin olmak için kullanın. Not: 450 mm iki silindirik lens arasındaki mesafedir. Çıktı ışın 8 sıkıştırma oranına sahip ve bir uzun oval şekilli havadar disk desen tavanda kurdu.</li>
</ol>5. test kiremit görüntüleme
<ol><li>3D hidrojel örnek hazırlamak. Mix 20 nm % 12'si acrylamide:bisacrylamide (29:1), %0.2 (v/v) TEMED ve % 0.2 (w/v) amonyum persülfat 0,75 x TAE tampon oluşan bir hidrojel çözüm ile koyu kırmızı boncuk. Karışık çözüm 50 µL başka bir yerde11açıklandığı gibi bir akış odanın içine enjekte. 10 dakika sonra 3D hidrojel örnek görüntüleme için hazır.</li>
	<li>Örnek örnek tutucu koymak. 638 nm lazer üzerinde açmak ve ayarlamak için güç < 1 mW için örnek uyarma.</li>
	<li>Kamera kontrol yazılımı çalıştırın. Kamera satın alma-ayar panelinde iç tetik modu seçin ve ücretsiz modunda çalışan video al ' ı tıklatın.</li>
	<li>Böylece 0 volt uygulandığı zaman galvo ayna görüntü kamera Merkezi'nde bulunur biraz kamera konumunu ayarlayın.</li>
	<li>Ayna M5 son derece eğimli bir aydınlatma elde etmek için yatay topuzu döndürün. Not: aydınlatma açısı bir artış ile hidrojel görüntü olarak daha ince ışın alır bu Epi görüntü daha netleşiyor. Ancak, görüntü hemen hemen aynı pozisyonda tutar.</li>
	<li>Karo resmi kaydedin. Etkili aydınlatma Genişlik11hesaplayın. Örneğin, şekil 3 12 µm etkili aydınlatma genişliğini gösterir.</li>
</ol>6. tarih görüntüleme
<ol><li>Klemensleri ile bağlı veri edinme Sedye hazırlayın. Kullanıcı 1 BNC konnektör ile P0.0 bir elektrik tellerden bağlayın. Kullanıcı 1 sCMOS kamera harici tetikleme için dijital bir çıktı olarak kullanın. Bir analog bağlantı galvo ayna şoför AO0 çıktı.</li>
	<li>TTL darbe trenler özel yapım programı (şekil 4A) kullanarak P0.0 oluşturmak ve koymak belgili tanımlık dönem zaman = 400 ms ve t_ON = 2 Bayan kullanıcı 1 BNC terminal oluşturulan darbeleri dijital osiloskop tarafından kontrol ve BNC kablo kameraya bağlayın Dış tetikleyici bağlantı noktası. Not: Bu yazıda kullanılan kontrol yazılımı istek üzerine mevcuttur. Farklı kamera kare hızlarında Imaging zaman dönem zaman buna göre ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Özel yapım programı yoluyla bir galvo ayna süpürmeye başlayın. V-500 mVmin ve Vmax 500 ayarlamak için tam FOV düşsel mV. Bu işlem'in altında 3D hidrojel örnekleri hala yüksek arka plan benzer Epi aydınlatma göstermek olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Kamera satın alma ayarını değiştirme.<ol>
<li>Dış tetik modu ve (ardıl) LightScan artı aþaðý açýlan menüsünde şekil 4Bgösterildiği gibi seçin. Not: bir tetikleyici sinyal açık sürece bu ayarda kamera görüntüleri almaz.</li>
		<li>İnceden inceye gözden geçirmek hız kontrolü için pencere yüksekliği ve çizgi maruz kalma zamanı Denetimi'ni tıklatın ve 180 satır ve 28 ms, sırasıyla olduğu için değerleri ayarlayın. Not: bir kiremit Genişlik (Weff) 180 satırları (12 µm) ve bir entegrasyon zaman her satırda (Tint) 28 ms olduğunda satırları (TD) arasındaki gecikme süresi TD belirlenir Tint/Weff = 2.048 x görüntüleme için 0,156 Bayan = 2.048 piksel, 2.048 x TD + Tint toplam edinme zamanı ~2.9 kareye karşılık gelen 346 ms =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biraz Vmax ve Vdk daha net görüntüler elde etmek için ayarlayın.</li>
	<li>3B yığın görüntüleri 3B yığın ON üzerinde anahtarlama ve yığınlar ve adım boyu sayısını belirten özel yapım programı kullanarak elde edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li><li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+dynamic+structural+biology:+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer.">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression.">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li><li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope.">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li><li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope.">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples.">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047 (2011).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641 (2015).</li><li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet.">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123 (2018).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination.">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li><li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution.">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li><li>Sink&#243;, J., Szab&#243;, G., Erd&#233;lyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques.">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li></ol>

Central Florida Üniversitesi bu yazıda açıklanan iş kapsayan bir patent başvurusu şikayetçi oldu.

Bu protokol için iki önemli adım vardır. İlk adımda 3.3, olay ışın lens merkezinden geçer ve mükemmel havadar yuvarlak yüzey deseni tavanda oluşan sağlanması olan L4 uygun yerleşimdir. M5, L3, GM ve L2 de dahil olmak üzere tüm diğer optik bileşenler, L4 konumunu belirler. İkinci önemli adım eşitleme işlemidir. Odak arka plan dışı reddetmek için etkin piksel olan etkili algılama genişliği döşeme genişliği eşittir ışın süpürme ile eşitlenmelidir. Bu nedenle, bu döşeme kiriş (Adım 5.6) etkili aydınlatma genişliğini ölçmek gereklidir ve set kamera parametrelerini buna göre 6.4 içinde adım.
Çok büyük FOV ile görüntüleme, sunulan yöntem bir taraftan diğer tarafa göre artan bir arka plan gösterir. Bu aydınlatma farklı görüntüleme pozisyonlarda biraz değişmiş açılarla atfedilir. M5 yerine ikinci bir galvo yansıtmayı uygulama bu sorun zaman uyumlu olarak konumu ve tarama açısı11ayarlayarak daha önce gösterildiği şekilde azaltır. Hazır akromatik birini yerine bir telemerkeze tarama lens de yardımcı olacaktır. Ancak, bir bölümünü görüntüleme için < 8,080 µm2, tek galvo ayna süpürme yeterli. HIST mikroskobu görüntüleme derinliği bir sınırı vardır, ancak, ne zaman bir 12 µm döşeme kiriş ve NA 1,45 yağı daldırma objektif lens11ile 15 ~ µm Imaging iyi SBR elde etmek mümkün.
Bu protokol için biz bir ışın 8 döşeme kiriş yapmak için kullanılan sıkıştırma oranını. Daha ince bir aydınlatma HIST mikroskobu yüksek SBR, hangi-ebilmek var olmak için tek molekül doku11Imaging güçlü elde etmek için kullanılabilir. Geçerli ışın sıkıştırma oranı az photobleaching 3D görüntülemede Epi11' e göre gösterdi ise ancak, bu durumda, photobleaching etkisi bir artan uyarma yoğunluk tarafından dikkate alınmalıdır. Işık sayfalık mikroskoplar iki uygun yerleştirilmiş hedefleri ile karşılaştırıldığında, HIST mikroskobu uygulamak basit ve geleneksel örnek hazırlıkları ile uyumlu. Gelişmiş SBR ve büyük HIST mikroskobu ve FOV etkileşimleri ve birden fazla hücreyi tek biomolecules dinamikleri eğitimi için uygundur ve daha fazla kullanılabilir süper kararlılık düşsel ve tek molekül izleme.

Tek molekül Floresans görüntüleme ultrastructures, dynamics ve biomolecules1,2,3sayısını ortaya birçok biyolojik çalışmalarda önemli bir rol oynar. Ancak, bu tek-moleküllerin hücre veya doku içinde çalışmaya zor oldu. Confocal mikroskobu yüksek parça yeteneği4sağlarken, şiddetli photobleaching yüksek uyarma yoğunluğu veya yavaş görüntüleme hızı nedeniyle tek molekül görüntüleme için uygun değildir. Widefield mikroskobu zayıf aydınlatma kullanır ama zavallı bir sinyal arka plan oranı (SBR)5' e uğrar. Işık sayfalık mikroskobu, öte yandan, iyi kesit ve düşük photobleaching6gösterilebilir; Ancak, mevcut sayısal diyafram (NA) büyük ölçüde uygun yerleştirilmiş hedefleri7şartı ile sınırlıdır. Alternatif olarak, özel Lombozlar ve camlama, örnek odaları8,9gerektirir.
Bu nedenlerden dolayı son derece eğimli ve lamine optik levha (HILO) mikroskopi yaygın 3D tek molekül görüntüleme10için kullanılmıştır. Eğimli bir ışını bir arabirim iki medya (cam ve su, örneğin) karşılaştığında, ışın Snell yasasına göre kırılan. Önemlisi, kırılmış kiriş tiner alır ve kalınlığı dz anlatılan nerede R eğimli ışın çapı ve θ iletilen ışın kırılma açısı R/tan(θ) =. Bu basit uygulama bir iyi parça yeteneklilik içinde sonuçlanır. Yine de, bu ilişki ince aydınlatma (yani, yüksek parça yeteneği) küçük bir R ve/veya büyük θ gerektirdiğini gösterir. Örneğin, ne zaman R 20 µm ve θ = 72 derece, bir-elde etmek dz = 6.5 µm. Derin hücrelerin içinde görüntü ve toplam iç yansıma önlemek için kırılma açısı artan pratik bir sınırı olduğundan, aydınlatma çapı ve kiriş kalınlığı güçlü bir bağlantı vardır. Bu nedenle, HILO görüntüleme bir nispeten küçük alan uygulamaları çok hücreli görüntülemede büyük ölçüde sınırlayan görüş (FOV) gösterir.
Son zamanlarda, son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi nerede FOV kiriş kalınlığı çok basit bir şekilde11dan decoupled tarafından bu sorunun üstesinden geldiler. İlk olarak, bir yönde uzamış bir ışın silindirik lensler bir çift ile oluşturulur. Bir taşı adlandırılan bu ışın dz ile ince bir aydınlatma üreten ~ onun FOV 130 x 12 µm2ise 4 µm. Sonra döşeme dönen galvo ayna kullanarak örnek üzerinde süpürüldü. Bu arada, floresan görüntü fotoğraf makinesinde ayarlanabilir confocal yarık algılama hizmet çalışırken bir çekim modunda çalışan tarafından etkili bir şekilde out-of-odak arka plan uygulayan bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kaydedilir. Bu şekilde, bir daha geniş görüş alanı (~ 130 x 130 µm2) ve HILO görüntüleme daha ince bir aydınlatma ile tek molekül görüntülemede HIST mikroskobu sağlar. Biz bu yeni görüntüleme gen ekspresyonu ve hastalıklar için önemli potansiyele sahip hücreleri tek bir soruşturma veya fare beyin dokularında, birkaç probları ile RNA transkript algılamaya tekniği uygulanır. Diğer yaklaşımların aksine HIST sadece ek bir ışığı olmadan bir tek yüksek sayısal diyafram amaç veya uzaktan algılama hedefleri istihdam ve ters mikroskoplar ile tam olarak uyumludur. Bu avantajlar bir büyük FOV ve yüksek karşıtlık ile birlikte HIST yapacak mikroskobu Biyoloji ve tıp önemli bir araç. HIST mikroskop ve nasıl test ve aşağıdaki gibi performans ayarlama araçları ile ilgili ayrıntılı yönergeler sunmak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:680px;" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-060-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">Collimator&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-100-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L1,L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC254-300-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">TL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Broadband Dielectric Mirrors</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">BB1-E02-10</td>
			<td style="width:225px;">M1~M7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Cylindrical Lenses</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LJ1363RM-A</td>
			<td style="width:225px;">CL1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Cylindrical Lenses</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LJ1695RM-A</td>
			<td style="width:225px;">CL2</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:88px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:151px;">58-857</td>
			<td style="width:225px;">For dichroic mirror mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP02</td>
			<td style="width:225px;">For holding other lenses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC508-150-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Achromatic doublet</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">AC508-400-A-ML</td>
			<td style="width:225px;">L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LCP01</td>
			<td style="width:225px;">For holding L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2&#34; Threaded Cage Plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">LCP01T</td>
			<td style="width:225px;">For holding L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2% Bis Solution</td>
			<td style="width:88px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">64085292</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 nm fluorescent beads</td>
			<td style="width:88px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:151px;">F8782</td>
			<td style="width:225px;">For testing imaging</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">KCB1</td>
			<td style="width:225px;">For objective &#38; camera mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30mm Cage System Iris</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP20S</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3-Axis NanoMax Stage</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">MAX311D</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40% Acrylamide Solution</td>
			<td style="width:88px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">64148001</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">405 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-MLD</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50x TAE buffer</td>
			<td style="width:88px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0743</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-DPL</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">638 nm laser</td>
			<td style="width:88px;">Cobolt</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt 06-MLD</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beam alignment tool</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">BNC terminal blocks</td>
			<td style="width:88px;">Natural Instruments</td>
			<td style="width:151px;">BNC-2110</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Cage plate with M9 x 0.5 internal threads</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">CP1TM09</td>
			<td style="width:225px;">For holding aspheric lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cage System Rods</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SR series</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture &#38; smFISH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;">See a reference [11]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double side tape&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Scotch</td>
			<td style="width:151px;">515182</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Devcon</td>
			<td style="width:151px;">14250</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galvo mirror</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">GVS211</td>
			<td style="width:225px;">GM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">GPS011</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Half wave plate</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">WPH10M-405/561/633</td>
			<td style="width:225px;">Power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">long-pass dichroic mirror</td>
			<td style="width:88px;">Chroma</td>
			<td style="width:151px;">T550lpxr</td>
			<td style="width:225px;">For combining lasers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:88px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:151px;">12549-3</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Mikroskopische Deckglaser</td>
			<td style="width:88px;">Hecht Assistent</td>
			<td style="width:151px;">990/5024</td>
			<td style="width:225px;">Flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Mounted Frosted Glass Alignment Disk</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">DG10-1500-H1-MD</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mounted rochester aspheric lens</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">A230TM-A</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Multi-band dichroic mirror</td>
			<td style="width:88px;">Semrock</td>
			<td style="width:151px;">Di03-R405/488/561/635-t3</td>
			<td style="width:225px;">DM; 3 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Multi-band filter</td>
			<td style="width:88px;">Semrock</td>
			<td style="width:151px;">FF01-446/523/600/677-25</td>
			<td style="width:225px;">BF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode fiber</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">M31L02</td>
			<td style="width:225px;">MMF</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyl ethylenediamine</td>
			<td style="width:88px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">T7024-25ML</td>
			<td style="width:225px;">hydrogel component</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">NI-DAQ board</td>
			<td style="width:88px;">Natural Instruments</td>
			<td style="width:151px;">PCI-6733</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#216;1&#34; Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">KM100</td>
			<td style="width:225px;">For holding mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective lens</td>
			<td style="width:88px;">Olympus</td>
			<td style="width:151px;">PLANAPO N 60X</td>
			<td style="width:225px;">60X 1.45NA oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pedestal Base Clamping Forks</td>
			<td style="width:88px;">Newport</td>
			<td style="width:151px;">9916</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pedestal Pillar Posts</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">RS1P8E</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Piezo controller</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">BPC303</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized beam splitter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">PBS251</td>
			<td style="width:225px;">For combining lasers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RMS-SM1 adapter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1A3TS</td>
			<td style="width:225px;">For objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rod holder</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotation cage mount&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">RSP1/CRM1/CRM1P</td>
			<td style="width:225px;">For HWP &#38; cylindrical lens mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:88px;">Andor</td>
			<td style="width:151px;">Zyla-4.2P-CL10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SI100</td>
			<td style="width:225px;">Beam collimation test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">P5-405BPM-FC-2</td>
			<td style="width:225px;">SMF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SM1 Lens Tubes</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1S25</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SM1 Slotted Lens Tube</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1L30C</td>
			<td style="width:225px;">For double pinhole system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stage mount</td>
			<td style="width:88px;">custom made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">threaded fiber adapter</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1FC</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Z-Axis Translation Mount</td>
			<td style="width:88px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:151px;">SM1Z</td>
			<td style="width:225px;">Fiber coupling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to build a highly inclined swept tile microscope for extended field-of-view single-molecule imaging

Tek molekül görüntüleme anlayışımız biyolojik çalışmalarda moleküler mekanizmaları büyük ölçüde ilerlemiştir. Ancak, kalın hücre ve dokulara büyük görünüm alanı, yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için zor olmuştur. Burada, bu sorunun üstesinden gelir son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi tanıtmak. Silindirik lensler bir çift hızlı galvo ayna aracılığıyla geniş bir görüntüleme alanı üzerinden taranmış bir uzun uyarma ışını oluşturmak için uygulanmıştır. 4f yapılandırması optik bileşenleri konumlandırmak için kullanıldı. Bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni kamera Floresans sinyal algılandı ve odak arka plan ışın süpürme ile senkronize dinamik bir confocal yarık ile engellendi. Biz bir adım-adım öğretim tüm temel bileşenleri HIST mikroskopla bina mevcut.

Örnek olarak, 638 bir uyarma dalga boyu ile Atto647N ile Etiketlenmiş tek iplikçikli DNA görüntüsü bir 3D hidrojel nm. DNA hidrojel ağ üzerinden bir acrydite yan jel polimerizasyon sırasında demirli. Görüntüleri, şekil 5biriçinde gösterildiği gibi yüzey üzerinde 5 mikron alındı. HIST görüntü içinden arka plan oranı sinyal molekülünü noktalar HIST görüntünün çoğu ise 1.9 ± 0.7 zar zor Epi tarafından tespit edilemedi olmak hesaplanmıştır Epi görüntü kıyasla çok daha az arka plan gösterdi.
Tek molekül RNA Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) içinde 4 ile gerçekleştirilen balık sondalar. Şekil 5 b smFISH görüntülerini AlexaFluor 647 A549 hücreleri üzerinde yapılan görüntüleme bir arabellek ile etiketli EEF2 (ökaryotik çeviri uzama faktör 2) görüntüler (önceki çalışmalarımız ile ilgili örnek hazırlama11bakın). Maksimum yoğunluk projeksiyon 20 z-5 µm kalınlık için karşılık gelen sıra yığınının üstündeki gerçekleştirildi. HIST görüntü sadece daha gelişmiş SBR ama Epi görüntüye göre de daha fazla Tekdüzen aydınlatma gösterdi. HIST entegrasyonu görüntüleme için zaman satır başına 32 ms, ikisi de 7.5 aynı aydınlatma gücü vardı Epi görüntüleme için çekim hızı 400 ms iken, mW ölçülen hedefi daha önce. Epi ve HIST görüntüleme hızı saniyede 2.5 kare çekim vardı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg"> Resim 1 . Mikroskop gövdesi, lazerler ve hizalama araçlar. (A)amaç ve örnek sahibi. Lazer sistemleri (B) fotoğraf. LP, uzun taramalı dikroik ayna; Λ/2, yarı-dalga plakaları; PBS, polarize beamsplitter. (C) Collimated ışık kaynağı. (D) kiriş hizalama araç iki ekleyebilme iğne delikleri ile. (E) çift iğne deliği sistem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg"> Resim 2 . Son derece eğimli ok açılı tipler kiremit (HIST) mikroskopi için ayrıntılı kurulum. Fotoğraf(a)ve şematik (B) HIST mikroskop sistemi. BF, çoklu bant geçiren Filtre; CL1-2, silindirik mercekler; DM, dikroik ayna; GM, galvo ayna; BF, bant geçiren Filtre; M1-7, aynalar; L1-4, lensler; SMF, tekli mod fiber; TL, tüp objektif. CIP, konjuge görüntü uçak; cBFP, Birleşik geri odak düzlemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg"> Şekil 3 . Döşeme bir sıkıştırma oranı ile aydınlatma 8. (A)floresan görüntü 3D hidrojel 20 nm boncuk. Ölçek çubuğu, 20 µm. (B) standart sapma projeksiyon A 10 veri noktalarıyla düzeltti, y yönünü boyunca. Kırmızı ok bir etkili aydınlatma genişliğini 12 µm. gösterir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg"> Şekil 4 . Ön panel denetimi ve görüntüleme yazılımı. (A) A ısmarlama LabVIEW program zaman uyumlu olarak denetler galvo ayna, sCMOS kamera başlangıç edinimi ve piezo sahne hareketi tarama. (B) fotoğraf makinesi satın alma ayarı kontrol paneli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg"> Şekil 5. (A)DNA'epi ve HIST aydınlatmalı 3D hidrojel Atto647N resimleri etiketli. (B) smFISH 4 kullanarak EEF2 görüntülerini balık Epi ve HIST mikroskobu tarafından A549 hücreleri üzerinde sondalar. DAPI leke mavi renkle gösterilir. Ölçek çubukları, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging at JoVE.com

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Ayrıntılı bir talimat nasıl son derece eğimli kurmak için kiremit (HIST) mikroskop ve onun kullanım için tek molekül düşsel süpürüldü açıklanmıştır.

Son derece eğimli oluşturmak için bir kılavuz döşeme mikroskop genişletilmiş görünümü alan tek molekül görüntüleme için süpürüldü.

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Metodumuz, geleneksel yöntemlere göre 40 kat daha büyük görüntü alanına sahip tek molekülleri görselleştirmemizi sağlar ve büyük ölçüde azaltılmış bir arka plan sinyaline sahiptir. Diğer tekniklerden farklı olarak yaklaşımımız tek objektif bir lens kullanır, özel bir numune odası gerektirmez ve ticari mikroskop sistemleri ile kolayca uyumludur. Gerekli bileşenleri topladıktan sonra sistemi oluşturmaya başlar.Burada, birkaç unsur zaten bankta pozisyonda bulunmaktadır. Alüminyum blok üzerine monte piezo sahne ve örnek tutucu ile bir mikroskop gövdesi. Ayrıca bankta üç lazerler ve optik elemanları kirişler birleştirmek için vardır.Birleştirilmiş kirişler mümkün olduğunca verimli bir şekilde tek bir mod fiber ile birleştirilir. Son bir ön adım olarak, bir kafes sistemi içinde bir collimated ışık kaynağı monte. Bu tek bir mod fiber bağlı geçici bir tutarlı ışık kaynağı vardır, bir lif adaptörü, akromatik lens ve iris.Algılama yolu ile çalışmaya başlayın. İlk olarak, mikroskop gövdesinin nesnel bağlantı noktasına harmanlanmış ışık kaynağını yerleştirin. Çıkış Demeti kabaca yatay ve tezgah delikleri ile hizalanmış böylece hedeflerin altında ayna ayarlayın.Işın yoluna bir dikroik ayna yerleştirin ve ışını 90 derece yansıtın. İletilen ışının yolunun bir sCMOS kameraya ayarlanabilmesi için aynalar ekleyin. Kirişin çipin ortasına isabet etmesini sağlamak için aynaları kullanın.Ardından, kameradan odak uzaklığı hakkında 300 mililitrelik odak uzaklığı tüpü ekleyin. Mikroskop gövdesinden collimated ışık kaynağı çıkarın. Daha sonra odak düzlemini ayarlamak için tüp merceğin konumunu ayarlayın.Kamera tavandaki deseni net bir şekilde çözdüğünde ayarlamaları durdurun. Algılama yolu bu şematik te betimlenmiştir. Çok renkli floresan görüntüleme için tüp lensin önüne çok bantlı geçiş filtresi eklenmesine dikkat edin.Mikroskop gövdesine geri dön. Orada, objektif tutucuda harmanlanmış ışık kaynağını yeniden yükleyin. Dikroik ayna sonra, 90 derece yönlendirmek için yansıyan Kiriş yoluna bir kat-ayna yerleştirin.Harmanlanmış ışık kaynağını mikroskop gövdesinden çıkarın ve yakınına yerleştirin. Daha sonra, aynadan yaklaşık bir odak uzaklığı 400 milimetrelik odak uzaklığı lens takın. Mikroskop gövdesinde objektif lensi töbebleyin.Daha sonra aynanın optik eksen boyunca konumunu ayarlayın. Hedefin üzerindeki tavanı gözlemleyin ve orada mükemmel bir Havadar disk deseni oluştuğunda durun. Şimdi hedefi kaldırın ve açık bir iris ile collimated ışık kaynağı yeniden yükleyin.Işın yolu boyunca, aynadan yaklaşık 400 milimetre uzaklıkta ki ışının en küçük olduğu yeri belirleyin. Nokta tanımlandıktan sonra, oraya bir ayna, konjuge bir görüntü düzlemi monte edin. Bu noktada kurulan durumu bu şematik görünür.Sadece eklenen ayna M5 etiketli. Işını 90 derece yansıtacak başka bir ayna yerleştirin ve 150 milimetrelik odak uzaklığı merceği yerleştirin. Lens, konjuge görüntü düzleminden 150 milimetre uzakta olmalıdır. Sonra, geçici olarak uyarma ışın yolu ilk lens götürmek.Bu yapılandırma ile ikinci lensin odak konumunu bulun. Bu odak noktasına konjuge arka odak düzlemi olarak tek eksenli galvo aynası yerleştirin. Galvo aynasına sıfır volt tedarik edin ve tutucuyu ışını 90 derece yansıtacak şekilde döndürün.Işın yolu boyunca sonraki, 90 derece de Kiriş yansıtan bir kat-ayna yerleştirin. Lensi konjuge arka odak düzleminden ışın yolu boyunca 100 milimetre yerleştirin. Bir kez daha, mikroskop yuvasından kolimlenmiş ışık kaynağını çıkarın.Bir iris ile birlikte bir lif adaptörü ve tek modlu fiber ile başka bir 100 milimetrelik kolimasyon lens ekleyin. Sonra görüntüleme sistemi üzerinden bir collimated ışın göndermek için iris, fiber ve lens kullanın. Daha sonra, ışın yolundaki son harmanlama merceğinden hemen önce odak uzaklığı 400 milimetrelik silindirik bir lens yerleştirin.Işına odaklanmak için kullan. 50 milimetrelik silindirik lensi ilkinin önüne 450 milimetre önleyin. Bu, hem algılama hem de uyarma yolları ile son kurulumun şematik bir gösterimidir.Üç lazerin çıkışı tek modluk lif ile yola birleştiğinde. Test için bir 3D hidrojel numunesi hazırlayın. Bu hidrojel ile karışık 20 nanometre kıpkırmızı boncukoluşur.Kurulum yerinde numune tutucuda hidrojel numunesi. Örnek uyarma için 638 nanometre lazer açın ve daha az bir miliwatt gücünü ayarlayın. Kamera kontrol yazılımını dahili tetik modunda ayarlayın ve video çekin.Bu noktada galvo motorunda sıfır volt uygulanır. Kamerayı, görüntünün merceğin merkezinde olacak şekilde yerleştirin. Ardından, eşlekapgörüntü düzlemi olan aynayı ayarlayın.Yüksek eğimli bir aydınlatma elde etmek için aynadaki yatay ahzıdöndürün. 20 nanometre boncuklu 3D hidrojel örnek floresan görüntüsünde olduğu gibi kiremit görüntüsünü kaydedin. Ölçek çubuğu 20 mikrometredir.Galvo aynasüpürmek için donanım ve yazılım kurduktan sonra devam edin. Bu kurulum için galvo ayna süpürme yazılımıdır. Vmin'i eksi 500 milivolta ayarlayarak tam görüş alanı görüntülemesi ayarlayın.O zaman Vmax'ı 500 milivolta ayarla. Ardından, kamera satın alma yazılımına geçin. Tetikleme Modunda Harici'yi seçin.LightScan PLUS açılır menüsünün altında Aşağı İleri'yi seçin, Scan Hız Kontrolü'nü tıklatın. Artık belirli kontrol parametreleri ayarlanabilir. Pencere Yüksekliği altında 180 satır girin.Pozlama altında 28 milisaniye girin. Bittiğinde, ayna kontrol yazılımına geri dönün. 3D yığınları üzerinde ayna kontrol yazılımı anahtarı on. Yığın sayısını ve adım boyutunu belirtin.Görüntüleri kaydetmeye başlamak için video çek'i tıklatın. Bu, tek iplikçikli etiketli DNA'nın Epi görüntülemesinin bir örneğidir. Buna karşılık, yüksek eğimli süpürülen kiremit tekniği bu görüntüyü üretti.HIST görüntüsü, Epi görüntüsüne göre daha az arka plan gösterir. DNA 3Boyutlu hidrojelde ve uyarma dalga boyu 638 nanometre. Burada etiketli ökaryotik çeviri uzama faktörü 2 bir Epi görüntüdür.HIST görüntüsü, sinyal-arka plan oranını iyileştirmiştir. Ayrıca daha düzgün aydınlatma vardır. Her ikisi de 7,5 miliwatt'lık aynı aydınlatma gücüne sahiptir.Görüntüleme hızları saniyede 2,5 kare idi. Sürekli olarak yüksek eğim açısını korumak ve süpürme aynasını kamera okumasıyla senkronize etmek önemlidir. Bu, görüntü edinimi sırasında yüksek sinyal-arka plan oranını garanti eder.HIST mikroskobunun daha derin görüntüleme derinliklerinde süper çözünürlüklü görüntüleme ve kalın doku dilimlerinde yüksek iş yapma gen ekspresyonu gibi çeşitli uygulamalara fayda sağlamasını bekliyoruz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...