Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

يشكر المؤلفون توم [كودجر], مايكل [لندري], و [كريستوفر] [ج.]. [برّتّ] لمساندة مع حبة تأليف. A.J.E. يعترف مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية منح RGPIN/05843-2014 و EQPEQ/472339-2015، منحة المعاهد الكندية للبحوث الصحية رقم 143327، منحة الجمعية الكندية للسرطان رقم 703930، والمؤسسة الكندية للابتكار #32749 المشروع. ر. كريشنان يعترف بمنحة المعاهد الوطنية للصحة رقم R21HL123522 و R01HL136209. وقد تلقى من مؤسسة البحوث الشهية في كيبيك الدعم من مؤسسة البحوث الشهية، ومؤسسة البحوث الطبيعية والتكنولوجيات في كيبيك. يشكر المؤلفون يوهانان إيديكولا على مساعدته في الفيديو والمخطوطة وزيشين هي للمساعدة في إعداد الفيديو.

ملاحظة: سيقوم البروتوكول التالي بتوجيه الباحثين في تصنيع واستخدام طبق TFM متعدد الآبار الموضح في الشكل 1.
1. إعداد ركائز سيليكون PDMS
<ol><li>إعداد خليط مطاط السيليكون PDMS على أساس خليط مركب من اثنين من مجموعات المتاحة تجاريا.<ol>
<li>إضافة الجزء ألف والجزء باء من مجموع...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

لنجاح هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان أن يكون عينة المغلفة بشكل موحد مع سمك ثابت من حوالي 100 ميكرومتر. وينبغي اختيار المعوّل بعناية لدراسة الأهمية المادية للنظام البيولوجي الذي يهمه الأمر. عند تصنيع طبقة أعلى، ينبغي تحسين تركيز جزيئات الفلورسنت fiducial لتحليل دقيق للإزاحة والإجهاد الجر. تحلي...

إنقباض Acto-myosin هو عنصر أساسي في ميكانيكا الخلايا النشطة، مما يؤثر على سلوكيات الخلايا من الحركة والانتشار إلى تمايز الخلايا الجذعية. في الأنسجة، الانقباض يدفع النشاط من الفصل القطبي في تكوين الأجنة، إلى انقباض مجرى الهواء والنشاط القلبي. بشكل حاسم، لتوليد التوتر، يجب أن تلتزم الخلايا أولا ً ببيئتها خارج الخلية. في القيام بذلك، وهذا الانقباض يولد قوى الجر على محيطهم. وقد ظهرت مجهرية قوة الجر (TFM) في العديد من الأشكال كوسيلة لتحديد كمية هذه القوى من خلايا متنوعة في ظل ظروف مختلفة.
وقد شهد مجال TFM اتساعا ً استثنائياً للابتكار والتطبيق، وقد مهدت النتائج الطريق لآفاق جديدة في علم الأحياء، والتي تتضمن الميكانيكا والقوى المادية. بدءا من ركائز سيليكونالتجاعيد 1، وقد طبق الباحثون تقنيات مختلفة لقياس قوى الجر الخلية. وقد تحسنت هذه النهج باستمرار ووصلت الآن إلى مستوى من القرار بشأن ترتيب عدة ميكرون2. ومع ذلك، ظهرت مشكلة رئيسية واحدة، وهي صعوبة في خلق ركائز من معامل منخفض بشكل مناسب باستخدام السيليكون المتاحة. للتحايل على هذه المشكلة، تم اعتماد polyacrylamide كبديل بسبب سهولة إنشاء ركائز على ترتيب 1-20 كيلوباسكال3. نفذنا مؤخرا السيليكون متوافقةجدا في TFM 4، مما يسمح لنا لتلفيق نفس مجموعة من معامل كما polyacrylamide، ولكن مع مزايا السيليكون خاملة وقوية.
وقد مكنت نُهج TFM من الاكتشافات الميكانو البيولوجية القيمة، ومع ذلك، فإن القصور المستمر هو تعقيدها، وغالباً ما تقصر استخدامها على الباحثين في تخصصات الهندسة أو العلوم الفيزيائية. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى المعايرة التفصيلية والحسابات الصعبة المطلوبة لتحديد مقدار الانقباض. وثمة تحد هام آخر يتمثل في أن أساليب TFM منخفضة الإنتاجية إلى حد كبير، وبالتالي فهي غير مناسبة لدراسة العديد من الظروف أو السكان المختلفة في وقت واحد5. وقد شكل ذلك اختناقا، مما أعاق نقل TFM من إعداد الفيزياء الأحيائية المتخصصة إلى تطبيقات بيولوجية ودوائية أوسع نطاقا.
لقد قمنا مؤخرًا بتطوير لوحة TFM متعددة الآبار، والتي تسمح للباحثين بموازاة قياسات TFM الخاصة بهم من أجل تحديد كمية أسرع لمقاييس الانقباض، مع استكشاف تأثير المركبات المختلفة وأيضًا باستخدام الكواشف الأقل4 . ولهذه المنهجية فائدة واسعة في مختلف الدراسات الآلية، من تقييم آثار المركبات على النشاط الخلوي، إلى التحديد الكمي للتغيرات العقدية في التمايز أو المرض.
أحد مجالات البحوث الطبية الحيوية التي سوف تستفيد كثيرا من TFM هو دراسة كيفية تأثير العظة المادية على الأنماط الظاهرية الخبيثة للخلايا السرطانية. يتميز الانبثاث، المسؤول عن 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان، بالخلايا السرطانية التي تغادر موقع الورم الأصلي واستعمار موقع ثانوي. للخلايا للهجرة من خلال الأنسجة وتمرير داخل وخارج نظام الأوعية الدموية، يجب أن تغير جذري أشكالها للضغط من خلال هذه الحواجز المادية في حين توليد قوى كبيرة لسحب طريقها على طول مصفوفة خارج الخلية أو التحرك بين غيرها من الخلايا. يتم نقل هذه القوى إلى الركيزة من خلالتفاعلات التصاق بؤري 2،3،ويمكن قياسها كميا باستخدام TFM. وفي حين أن السرطانات متنوعة من الناحية البيوكيميائية بشكل استثنائي، مع اتساع نطاق الطفرات المعروفة وتغيرات البروتين، فقد لوحظت بعض التغيرات الفيزيائية الشائعة؛ في مجموعة متنوعة من السرطانات، بما في ذلك سرطان الثدي والبروستاتا والرئة، وقد ثبت الخلايا النقيلية لممارسة 2-3 مرات قوى الجر من الخلايا غير النقيلية6،7،8. وتشير هذه النتائج إلى أنه قد يكون هناك ارتباط قوي بين التقدم النقيلي وقوى الجر التي تمارسها الخلايا. ومع ذلك، من الصعب دراسة التغييرات التفصيلية التي تعتمد على الوقت في الانقباض.
الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) هو عملية حيث الخلايا تقليل الالتصاق الخلايا المجانبة- وضيق تقاطع بوساطة الخلية، وتصبح أكثر هجرة والغازية. بالإضافة إلى الوظائف الفسيولوجية التي تشمل التئام الجروح والعمليات التنموية، EMT هو أيضا عملية استغلالها خلال الانبثاث، مما يجعلها نموذجا مفيدا لدراسة هذه العملية. باستخدام TGF-β، يمكننا حث EMT في الخلايا الظهارية الثديية murine (NMuMG)9 لتحديد التغيرات المادية مباشرة خلال هذا التحول، وتميز الوقت والآثار المعتمدة على الجرعة من TGF-β على EMT وتقلص الخلايا. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح فائدة هذا النهج عن طريق قياس التغيرات في الانقباض أثناء EMT المستحثة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

إن الانقباض الخلوي ضروري في جوانب متنوعة من البيولوجيا، وعمليات القيادة التي تتراوح بين الحركة والانقسام، وتقلص الأنسجة والاستقرار الميكانيكي، وتمثل عنصرا أساسيا في الحياة الحيوانية متعددة الخلايا. في الخلايا الملتصقة ، ينظر إلى تقلص الacto-myosin في قوى الجر التي تمارس الخلايا على الركيزة الخاصة بهم. يظهر خلل تنظيم الانقباض الخلوي في عدد لا يحصى من الأمراض، مما يجعل الانقباض هدفا واعدا في نُهج التشخيص المتنوعة باستخدام الفيزياء الحيوية كمقياس. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستند الاستراتيجيات العلاجية الجديدة على تصحيح الخلل الواضح في انقباض الخلايا. غير أن هذه التطبيقات تتطلب تحديدا ً كمياً مباشراً لهذه القوات.
لقد قمنا بتطوير مجهرية قوة الجر القائمة على الاستومر سيليكون (TFM) في شكل مواز متعدد الآبار. إن استخدامنا لمطاط السيليكون، وعلى وجه التحديد بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)، بدلاً من مادة هيدروجيل بوليأكريلاميد (PAA) المستخدمة عادة ً، يمكننا من تقديم ركائز قوية وخاملة مع حياة الجرف غير المحدودة التي لا تتطلب أي ظروف تخزين متخصصة. وعلى عكس النهج المستندة إلى نظام إدارة الأداء المستندة إلى أعمدة والتي لها معامل في نطاق GPa، فإن نظام إدارة الأداء المستخدم هنا متوافق جداً، حيث يتراوح بين 0.4 كيلوباسكال تقريباً و100 كيلوباسكال. نحن ننشئ منصة عالية الإنتاجية لTFM عن طريق تقسيم هذه الركائز متجانسة كبيرة مكانيا في الآبار المستقلة كيميائيا، وخلق منصة متعددة الآبار لفحص قوة الجر التي تتوافق مع النظم القائمة متعددة الآبار.
في هذه المخطوطة، نستخدم نظام قوة الجر متعدد الآبار لفحص الفترة الظهارية إلى الانتقال Mesenchymal (EMT)؛ نحن نحث EMT في خلايا NMuMG عن طريق تعريضها لTGF-β، وتحديد التغيرات البيوفيزيائية خلال EMT. نحن نقيس الانقباض كدالة للتركيز ومدة التعرض TGF-β. النتائج التي توصلنا إليها هنا تبين فائدة TFM موازية في سياق الفيزياء الحيوية المرض.

قبل إضافة TGF-β، طبقة أحادية من الخلايا confluent لديه الحصى مثل الشكل ومعبأة بإحكام. عند العلاج TGF-β، تصبح الخلايا أكثر ممدود في مورفولوجيا، وتوسيع منطقة الخلية والحصول على النمط الظاهري mesenchymal أكثر. باستخدام جهاز متعدد الآبار ملفقة مع elastomers PDMS لينة، تمت دراسة الخصائص الفيزيا?...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

نحن نقدم عالية الإنتاجية الجر قوة الجر تسرب ملفقة مع مطاط السيليكون (PDMS). هذا الفحص الجديد هو مناسبة لدراسة التغيرات المادية في انقباض الخلايا خلال مختلف العمليات البيولوجية والطبية الحيوية والأمراض. نحن نبين فائدة هذه الطريقة عن طريق قياس زيادة تعتمد على TGF-β في الانقباض خلال الانتقال الظهاري إلى mesenchymal.

عالية الإنتاجية الجر قوة الفحص المجهري باستخدام PDMS يكشف عن الآثار التي تعتمد على الجرعة من تحويل عامل النمو-β على الانتقال الظهاري إلى Mesenchymal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

مختبري مهتم بعلم الأحياء الميكانيكية، الذي يدرس كيف تمارس الخلايا وتتأثر بالقوى الميكانيكية. إحدى الطرق التي يمكننا بها قياس علم الأحياء الميكانيكية هي قياس قابلية الخلية. في الخلايا الملتمَكة، يظهر التقلص في قوى الجر التي تمارس على ركيزة الخلية. نحن نقوم بتحديد هذه القوى باستخدام منهجية يشار إليها عموما باسم المجهر قوة الجر أو TFM. ويتم تنفيذ TFM في مجموعة متنوعة واسعة من الطرق المختلفة ، ولكن الجانب الشائع هو أنه أسلوب مختبر متسلسل وبطيء يتم عادة في طبق واحد مثل هذا هنا. وهذا يقيدنا بتقييم مجموعة سكانية واحدة أو حالة واحدة في كل مرة. في جميع أنحاء في ثقافة الخلية تحسنت منذ بعض الوقت ولكن خلق أطباق متعددة وفكرنا، لن يكون كبيرا أننا يمكن أن لـ TFM مع نفس الإنتاجية المتزايدة ونفس الكفاءة من الوقت والكواشف؟ وهذا كان حلنا. لذلك أنشأنا 96 جيدا الجر قوة الطبق. ويبدو مشابها جدا لطبق ثقافة الأنسجة 96 التقليدية بشكل جيد، ولكن مع هذا الطبق لا يمكننا فقط دراسة 96 ظروف مختلفة ثقافة الخلية، ولكن أيضا تحديد قابلية الخلية. هذا يقدم حلاً أعلى بكثير من الإنتاجية من نهج طبق واحد، مما يسمح لنا بفحص ظروف الخلايا المتنوعة والاستجابات المتعاقدة. أثناء الانبثاث السرطاني، تنتقل الخلايا السرطانية من موقعها الأساسي إلى المواقع الثانوية، مما ينشر المرض في جسمنا. هذا السلوك النقيلي للخلايا السرطانية يمثل 90٪ من الموت المرتبطة بالسرطان. واحدة من الآليات المقترحة للخلايا السرطانية الظهارية للحصول على نوع ظاهري أكثر هجرة والغازية هو التحول الظهارية-mesenchymal, EMT. خلال EMT، يصبحون أكثر هجرة و توغل، وتغيير سلوكهم الجسدي. لفهم أفضل هذه التغيرات في السلوك البدني، ونحن الاستفادة لدينا الركيزة السيليكون لينة لقياس التغيرات في انكماش خلايا الغدة الثديية الماوس مع التعريفي EMT بواسطة TGF-In هذه الدراسة، وحققنا كيف تركيزات مختلفة ووقت الحضانة من TGF-تأثير على سلوك الخلايا البدنية. Polydimethylsiloxane هو المطاط متوافقة جدا مع أدنى معامل يونغ من حوالي 0.6 كيلوباسكال. صلابة هذه المواد يمكن أيضا أن تكون قابلة للتواؤم باستخدام تركيزات مختلفة من وكيل crosslink بما في ذلك SYLGARD 184.To قياس الخصائص الميكانيكية ل PDMS نستخدم rh. بعد خلط الجزء A والجزء B من PDMS، في نسبة وزن واحد إلى واحد وإضافة عامل المعالجة مع نسبة الوزن المحددة، تحميل دفعة أعدت على لوحة rheometer. تأكد من تحميل ما يكفي من العينة لتغطية منطقة المغزل تماما. من المهم التأكد من أن المغزل يلمس العينة تمامًا دون ترك مساحة حرة عند حافتها. وينبغي أن أي عينة إضافية قلصت بعناية ومسحت من لوحة. قياس معامل التخزين النهائي والتبعية الزمنية لللزوجة لكل عينة من خلال القيام بالوقت والتردد الاجتياحات في سلالة القص متذبذب من 0.5٪Newsha]هذا الرسم البياني هو مثال واحد من اختبار سيك، بعد أن فعلت لقياس السلوك الريولوجي من polydimethylsiloxane مع سلالة القص المتذبذبة تطبيقية من 0.5٪ ودرجة الحرارة من 100

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

الجر قوة المجهر لدراسة B تنشيط الخلايا الليمفاوية

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...