Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Forfatterne takker Tom Kodger, Michael Landry og Christopher J. Barrett for hjælp med perle syntese. A.J.E. anerkender naturvidenskab og ingeniør forskning Rådet tilskud RGPIN/05843-2014 og EQPEQ/472339-2015, canadiske institutter for sundhed forskning Grant No. 143327, canadiske Cancer Society Grant No. 703930, og Canadian Foundation for innovation Projekt #32749. R. Krishnan anerkender nationale institutter for sundhedstilskud nr. R21HL123522 og R01HL136209. H.Y. blev støttet af fonds de Recherche santé Québec og fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Forfatterne takker Johanan Idicula for at hjælpe med video og manuskript og Zixin he for at hjælpe med at forberede videoen.

Bemærk: følgende protokol vil vejlede forskerne i opdigte og ved hjælp af multi-Well TFM skålen vist i figur 1.
1. fremstilling af PDMS silikone substrater
<ol><li>Fremstilling af PDMS silikone gummiblanding baseret på en sammensat blanding af to kommercielt tilgængelige kits.<ol>
<li>Tilføj del A og del B af PDMS Kit (f. eks. GEL-8100, se tabellen over materialer) i et 1:1 vægt forhold i 50 ml røret. Bemærk: blandingen blandes på ...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

For at denne metode skal lykkes, er det afgørende at have en ensartet belagt prøve med en konstant tykkelse på ca. 100 μm. Modulus bør nøje vælges for at undersøge den fysiske betydning af det biologiske system af interesse. Ved fremstilling af et toplag, bør koncentrationen af de fiducial fluorescerende partikler optimeres for nøjagtig analyse af forskydning og trækkraft stress. Analyse af isolerede enkeltceller kræver et tættere fiduciært lag end måling af konfluent-monolayers. Derudover skal overfladen ...

Acto-myosin kontraktilitet er et væsentligt element i aktiv celle mekanik, påvirker celle adfærd fra motilitet og spredning til stamcelle differentiering. I væv, kontraktilitet drevaktivitet fra Polar adskillelse i embryo Genesis, til luftvejs indsnævring og hjerteaktivitet. Kritisk, at generere spændinger, celler skal først overholde deres ekstracellulære miljø. Derved genererer denne kontraktilitet trækkraft kræfter på deres omgivelser. Trækkraft mikroskopi (TFM) er dukket op i en lang række former som en måde at kvantificere disse kræfter fra forskellige celler under forskellige forhold.
TFM-området har oplevet en exceptionel bredde af innovation og anvendelse, og resultaterne har banet vejen for nye perspektiver inden for biologi, som inkorporerer mekanik og fysiske kræfter. Begyndende med rynkning silikone substrater1, forskere har anvendt forskellige teknikker til at målecelle trækkraft kræfter. Disse tilgange er blevet løbende forbedret og har nu nået et niveau af beslutning om rækkefølgen af flere mikron2. Der er imidlertid opstået et hovedproblem, som er vanskeligheden ved at skabe substrater af passende lav moduli ved hjælp af de tilgængelige silikegler. For at omgå dette problem, blev polyacrylamid vedtaget som en erstatning på grund af den lethed at skabe substrater på rækkefølgen af 1-20 kPa3. Vi har for nylig implementeret meget kompatible silikegler i TFM4, hvilket giver os mulighed for at fabrikere det samme sortiment af moduli som polyacrylamid, men med fordelene ved inert og robust silikone.
TFM tilgange har gjort det muligt værdifulde mechano-biologiske opdagelser, men, en vedvarende mangel er deres kompleksitet, ofte begrænser deres anvendelse til forskere i ingeniørvidenskab eller fysiske videnskaber discipliner. Dette skyldes for en stor del de detaljerede kalibreringer og udfordrende beregninger, der er nødvendige for at kvantificere kontraktilitet. En anden væsentlig udfordring er, at TFM metoder er stort set lav-gennemløb og derfor dårligt egnet til at studere mange forskellige betingelser eller populationer samtidigt5. Dette har vist en flaskehals, som har hæmmet overdragelsen af TFM fra en specialist Biofysik til bredere biologiske og farmakologiske anvendelser.
Vi har for nylig udviklet en multi-Well format TFM plade, som giver forskerne mulighed for at parallelér deres TFM målinger for hurtigere kvantificering af kontraktilitet Metrics, mens udforske virkningen af forskellige forbindelser og også ved hjælp af mindre reagenser4 . Denne metode har bred nytte i forskellige mechanobiologi undersøgelser, fra at evaluere virkningerne af forbindelser på cellulære aktivitet, at kvantificere de kontraktile ændringer i differentiering eller sygdom.
Et område af biomedicinsk forskning, der vil drage stor fordel af TFM er studiet af, hvordan fysiske stikord påvirker de maligne fænotyper af kræftceller. Metastase, ansvarlig for 90% af Cancer-relaterede dødsfald, er karakteriseret ved kræftceller forlader deres oprindelige tumor site og koloniserer et sekundært sted. For celler til at migrere gennem vævet og passere ind og ud af det vaskulære system, skal de radikalt ændre deres former til at klemme gennem disse fysiske barrierer, samtidig med at generere betydelige kræfter til at trække sig vej langs ekstracellulære matrix eller flytte mellem andre Celler. Disse kræfter overføres til substratet gennem fokale vedhæftnings interaktioner2,3og kan kvantificeres ved hjælp af TFM. Mens kræft er biologisk kemisk usædvanligt forskelligartet, med en ekspanderende repertoire af kendte mutationer og protein ændringer, nogle almindelige fysiske ændringer er blevet observeret; i en række forskellige kræftformer, herunder bryst-, prostata-og lungekræft, har metastatiske celler vist sig at udøve 2-3 gange Trækkraft kræfterne i ikke-metastatiske celler6,7,8. Disse resultater tyder på, at der kan være en stærk sammenhæng mellem metastatisk progression og trækkraft kræfterne udøvet af celler; Det er imidlertid vanskeligt at undersøge de detaljerede tidsafhængige ændringer i kontraktilitet.
Epitel-til-mesenchymal Transition (EMT) er en proces, hvorved cellerne reducerer vedhæftnings-og tight-Junction medieret celle-celle adhæsion, bliver mere vandrende og invasiv. Ud over fysiologiske funktioner, der omfatter sårheling og udviklingsmæssige processer, EMT er også en proces udnyttes under metastase, hvilket gør det til et nyttigt model system til at studere denne proces. Ved hjælp af TGF-β, vi kan fremkalde EMT i murine bryst epitelceller (nmumg)9 at direkte kvantificere de fysiske ændringer under denne transformation, og karakteriserer den tid og dosis-afhængige effekter af TGF-β på EMT og celle kontraktilitet. I denne artikel viser vi nytten af denne tilgang ved at måle ændringerne i kontraktilitet under en induceret EMT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

Cellulære kontraktilitet er afgørende i forskellige aspekter af biologi, kørsel processer, der spænder fra motilitet og division, til væv sammentrækning og mekanisk stabilitet, og repræsenterer et centralt element i multi-cellulære dyrs liv. I vedklædige celler ses acto-myosin-sammentrækning i trækkraft, som cellerne udøver på deres substrat. Dysregulering af cellulære kontraktilitet vises i et utal af patologier, hvilket gør kontraktilitet et lovende mål i forskellige diagnostiske tilgange ved hjælp af Biofysik som en metrisk. Desuden kan nye terapeutiske strategier være baseret på at korrigere den tilsyneladende fejl i celle kontraktilitet. Disse anvendelser kræver imidlertid en direkte kvantificering af disse kræfter.
Vi har udviklet silikoneelastomer-baseret Traction Force mikroskopi (TFM) i et paralleliseret multi-Well-format. Vores brug af en silikone gummi, specifikt Polydimethylsiloxan (PDMS), snarere end den almindeligt anvendte hydrogel polyacrylamid (PAA) gør os i stand til at gøre robuste og inaktive substrater med ubestemt hylde-liv kræver ingen særlige opbevaringsforhold. I modsætning til søjle-PDMS-baserede tilgange, der har en modulus i GPa-området, er de PDMS, der anvendes her, meget overensstemmende, lige fra ca. 0,4 kPa til 100 kPa. Vi skaber en platform til højt gennemløb for TFM ved at opdele disse store monolitiske substrater rumligt i biokemisk uafhængige brønde, hvilket skaber en multi-Well platform for Traction Force screening, der er kompatibel med eksisterende multi-Well-systemer.
I dette manuskript bruger vi dette multi-Well Traction Force system til at undersøge epitelial til Mesenchymal Transition (EMT); Vi inducerer EMT i NMuMG celler ved at udsætte dem for TGF-β, og at kvantificere de biofysiske ændringer under EMT. Vi måler kontraktilitet som en funktion af koncentrationen og varigheden af TGF-β eksponering. Vores resultater her demonstrere nytten af angreb TFM i forbindelse med sygdom biophysics.

Før tilsætning af TGF-β, en flydende enkeltlags af celler har en brosten som form og er tæt pakket. Ved TGF-β behandling, celler bliver mere aflange i morfologi, forstørre celleområdet og erhverve en mere mesenchymal fænotype. Ved hjælp af multi-Well enhed fremstillet med bløde PDMS elastomerer, de fysiske egenskaber af celler i alt 17 forskellige betingelser blev undersøgt. Cellerne blev behandlet med fire forskellige TGF-β-koncentrationer (0,5, 1, 2 og 4 ng/mL) og fire forsk...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Vi præsenterer en høj gennemløb Traction Force assay fremstillet med silikone gummi (PDMS). Denne nye analyse er egnet til at studere fysiske ændringer i cellernes kontraktilitet under forskellige biologiske og biomedicinske processer og sygdomme. Vi demonstrerer denne metodes anvendelighed ved at måle en TGF-β afhængig stigning i kontraktilitet under epithelial-til-mesenchymal overgangen.

Høj kapacitet trækkraft mikroskopi ved hjælp af PDMS afslører dosis-afhængige effekter af omdanne vækstfaktor-β på epitelial-til-Mesenchymal overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mit laboratorium er interesseret i mekanobiologi, som undersøger, hvordan celler udøver og er påvirket af mekaniske kræfter. En måde, hvorpå vi kan kvantificere mekanobiologi, måler cellekontraktilitet. I klæbende celler manifesterer kontraktilitet sig i trækkraftkræfter, der udøves på celleunderlaget. Vi kvantificerer disse kræfter ved hjælp af en metode, der generelt omtales som trækkraftmikroskopi eller TFM. Og TFM's implementeret i en bred vifte af forskellige metoder, men et fælles aspekt er, at det er en temmelig seriel og langsom lab teknik udført typisk i en enkelt skål som denne her. Dette begrænser os til at evaluere en population eller tilstand ad gangen. Hele i celle kultur blev forbedret for nogen tid siden, men at skabe multiwell retter, og vi troede, ville det ikke være fantastisk det, vi kunne TFM med samme øgede gennemløb og den samme effektivitet af tid og reagenser? Og det var vores løsning. Så vi skabte en 96 godt trækkraft kraft fad. Og det ser meget ligner en konventionel 96 godt væv kultur parabol, men med denne parabol kan vi ikke kun undersøge 96 forskellige cellekultur betingelser, men også kvantificere deres celle kontraktilitet. Dette præsenterer en langt højere gennemløbsløsning end enkelt skål tilgange, giver os mulighed for at undersøge forskellige celle betingelser og kontraktile svar. Under kræft metastase, kræftceller rejser fra deres primære site til sekundære steder, sprede sygdommen i vores krop. Denne metastatiske adfærd kræftceller tegner sig for 90% af kræft-relaterede dødsfald. En af de foreslåede mekanismer for epitelkræftceller til at erhverve en mere vandrende og invasiv fænotype er epitel-mesenchymal overgang, EMT. Under EMT, bliver de mere vandrende og invasive, ændre deres fysiske adfærd. For bedre at forstå disse ændringer i fysisk adfærd, vi udnytter vores bløde silicium substrat til at måle ændringer i kontraktilitet af mus mælkekirtelceller med EMT induktion af TGF-I denne undersøgelse, vi undersøgte, hvordan forskellige koncentrationer og inkubationstid af TGF-påvirke cells'fysiske adfærd. Polydimethylsiloxan er en meget kompatibel gummi med den laveste Young's modulus på omkring 0,6 kilopascal. Stivheden af dette materiale også kan være i stand til at bruge forskellige koncentrationer af crosslink agent, herunder SYLGARD 184.To måle mekaniske egenskaber af PDMS vi bruger et reometer. Efter blanding af del A og del B af PDMS, i en en til en vægt forhold og tilføje hærdningsmidlet med den angivne vægtprocent, belastning den forberedte batch på reometerpladen. Sørg for at læsse nok af prøven til at dække spindelområdet helt. Det er vigtigt at sikre, at spindelen rører prøven helt uden ledig plads tilbage på kanten. Enhver ekstra prøve skal trimmes omhyggeligt og tørres af pladen. Mål den endelige opbevaring modulus og tid afhængighed af hver prøve viskoelastisk ved at gøre tid og frekvens fejer på en oscillatorerende forskydning stamme på 0,5%Newsha]Denne graf er et eksempel på time seq test, der har gjort for at måle reologisk adfærd polydimethylsiloxan med anvendt oscillatoriske forskydning stamme på 0,5% og temperatur på 100

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Strækker micropatterned Celler på en PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En High-throughput Cell Microarray Platform for korrelative Analyse af Cell Differentiering og Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Trækkraft mikroskopi integreret med Microfluidics til kemo-aktisk kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Trækkraft kraft mikroskopi til undersøgelse B Lymfocyt Aktivering

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...