Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Les auteurs remercient Tom Kodger, Michael Landry et Christopher J. Barrett de leur aide dans la synthèse des perles. A.J.E. reconnaît que le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie accorde des subventions RGPIN/05843-2014 et EQPEQ/472339-2015, la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada no 143327, la subvention de la Société canadienne du cancer no 703930 et la Fondation canadienne pour l'innovation Projet #32749. R. Krishnan reconnaît la subvention no des National Institutes of Health. R21HL123522 et R01HL136209. H.Y. a reçu l'appui du Fonds de recherche Santé Québec et du Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Les auteurs remercient Johanan Idicula pour son aide avec la vidéo et le manuscrit et Zixin He pour l'aide dans la préparation de la vidéo.

REMARQUE : Le protocole suivant guidera les chercheurs dans la fabrication et l'utilisation du plat TFM multi-puits présenté à la figure 1.
1. Préparation de substrats en silicone PDMS
<ol><li>Préparation du mélange de caoutchouc de silicone PDMS basé sur un mélange composite de deux kits disponibles dans le commerce.<ol>
<li>Ajouter la partie A et la partie B du kit PDMS (p. ex., GEL-8100, voir la Table des Matériaux) dans un rapport d...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Pour le succès de cette méthode, il est essentiel d'avoir un échantillon uniformément enduit d'une épaisseur constante d'environ 100 m. Le modulus doit être soigneusement choisi pour examiner la signification physique du système biologique d'intérêt. Lors de la fabrication d'une couche supérieure, la concentration des particules fluorescentes fiduciales doit être optimisée pour une analyse précise du déplacement et du stress de traction. L'analyse des cellules individuelles isolées nécessite une couche fi...

La contractilité acto-myosine est un élément essentiel de la mécanique cellulaire active, ayant un impact sur les comportements cellulaires de la motilité et la prolifération à la différenciation des cellules souches. Dans les tissus, la contractilité entraîne l'activité de la séparation polaire dans l'embryogenèse, à la constriction des voies respiratoires et à l'activité cardiaque. De façon critique, pour générer de la tension, les cellules doivent d'abord adhérer à leur environnement extracellulaire. Ce faisant, cette contractilité génère des forces de traction sur leur environnement. La microscopie de traction force (TFM) a émergé sous une multitude de formes comme un moyen de quantifier ces forces à partir de cellules diverses dans des conditions différentes.
Le domaine de TFM a vu une ampleur exceptionnelle de l'innovation et de l'application, et les résultats ont ouvert la voie à de nouvelles perspectives en biologie, qui intègrent la mécanique et les forces physiques. En commençant par froisser les substrats de silicone1, les chercheurs ont appliqué diverses techniques pour mesurer les forces de traction cellulaire. Ces approches ont été continuellement améliorées et ont maintenant atteint un niveau de résolution de l'ordre de plusieurs microns2. Cependant, un problème principal est apparu, qui est la difficulté à créer des substrats de moduli convenablement faible en utilisant les silicones disponibles. Pour contourner ce problème, le polyacrylamide a été adopté comme un remplacement en raison de la facilité de créer des substrats de l'ordre de 1-20 kPa3. Nous avons récemment mis en œuvre des silicones très conformes dans TFM4, nous permettant de fabriquer la même gamme de moduli que le polyacrylamide, mais avec les avantages de silicone inerte et robuste.
Les approches DE la TFM ont permis de précieuses découvertes mécano-biologiques, cependant, une lacune persistante est leur complexité, limitant souvent leur utilisation aux chercheurs dans les disciplines de l'ingénierie ou des sciences physiques. Cela est dû en grande partie aux étalonnages détaillés et aux calculs difficiles qui sont nécessaires pour quantifier la contractilité. Un autre défi important est que les méthodes de TFM sont en grande partie à faible débit et donc mal adaptées pour étudier de nombreuses conditions ou populations différentes simultanément5. Cela a présenté un goulot d'étranglement, qui a entravé le transfert de TFM d'un établissement biophysique spécialisé dans des applications biologiques et pharmacologiques plus larges.
Nous avons récemment mis au point une plaque TFM multi-bien format, qui permet aux chercheurs de paralléliser leurs mesures TFM pour une quantification plus rapide des mesures de contractilité, tout en explorant l'impact de différents composés et en utilisant moins de réactifs4 . Cette méthodologie a une grande utilité dans diverses études de mécanobiologie, de l'évaluation des effets des composés sur l'activité cellulaire, à la quantification des changements contractuels dans la différenciation ou la maladie.
Un domaine de recherche biomédicale qui bénéficiera grandement de la TFM est l'étude de l'impact des indices physiques sur les phénotypes malins des cellules cancéreuses. La métastasie, responsable de 90% des décès liés au cancer, est caractérisée par des cellules cancéreuses quittant leur site tumoral d'origine et colonisant un site secondaire. Pour que les cellules migrent à travers les tissus et passent dans et hors du système vasculaire, elles doivent changer radicalement leurs formes pour se faufiler à travers ces barrières physiques tout en générant des forces substantielles pour tirer leur chemin le long de la matrice extracellulaire ou se déplacer entre les autres Cellules. Ces forces sont transmises au substrat par des interactions d'adhérence focale2,3, et peuvent être quantifiées à l'aide de TFM. Tandis que les cancers sont biochimiquement exceptionnellement divers, avec un répertoire croissant des mutations connues et des changements de protéine, quelques changements physiques communs ont été observés ; dans une variété de cancers, y compris les cancers du sein, de la prostate et du poumon, les cellules métastatiques ont été montrées pour exercer 2-3 fois les forces de traction des cellules non métastatiques6,7,8. Ces résultats suggèrent qu'il puisse y avoir une forte corrélation entre la progression métastatique et les forces de traction exercées par les cellules ; toutefois, il est difficile d'examiner les changements détaillés liés au temps dans la passéentité.
La transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) est un processus par lequel les cellules réduisent l'adhérence des cellules médiées par les adhérents et la jonction serrée, devenant plus migratrices et envahissantes. En plus des fonctions physiologiques qui incluent la cicatrisation des plaies et les processus de développement, l'EMT est également un processus exploité pendant la métastes, ce qui en fait un système modèle utile pour étudier ce processus. À l'aide de TGF-MD, nous pouvons induire l'EMT dans les cellules épithéliales mammaires maurines (NMuMG)9 pour quantifier directement les changements physiques au cours de cette transformation, et caractériser les effets dépendants du temps et de la dose de TGF-MD sur l'EMT et la contractilité cellulaire. Dans cet article, nous démontrons l'utilité de cette approche en mesurant les changements dans la contractilité pendant un EMT induit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

La contractilité cellulaire est essentielle dans divers aspects de la biologie, les processus de conduite qui vont de la motilité et la division, à la contraction des tissus et la stabilité mécanique, et représente un élément central de la vie animale multicellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contraction de l'acto-myosine est observée dans les forces de traction que les cellules exercent sur leur substrat. La dysrégulation de la contractilité cellulaire apparaît dans une myriade de pathologies, faisant de la contractilité une cible prometteuse dans diverses approches diagnostiques utilisant la biophysique comme mesure. En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être basées sur la correction du dysfonctionnement apparent de la contractilité cellulaire. Ces applications, cependant, nécessitent une quantification directe de ces forces.
Nous avons développé la microscopie à base d'élastomère de silicone (TFM) dans un format multi-puits parallallé. Notre utilisation d'un caoutchouc de silicone, en particulier le polydiméthylsiloxane (PDMS), plutôt que le polyacrylamide hydrogel couramment utilisé (PAA) nous permet de fabriquer des substrats robustes et inertes avec des durées de conservation indéfinies ne nécessitant pas de conditions de stockage spécialisées. Contrairement aux approches basées sur le pilier-PDMS qui ont un modulus dans la gamme GPa, le PDMS utilisé ici est très conforme, allant d'environ 0,4 kPa à 100 kPa. Nous créons une plate-forme à haut débit pour TFM en cloisonnant ces grands substrats monolithiques spatialement en puits biochimiques indépendants, créant une plate-forme multi-puits pour le criblage de force de traction qui est compatible avec les systèmes multi-puits existants.
Dans ce manuscrit, nous utilisons ce système de force de traction multi-puits pour examiner la transition épithéliale à mésenchymale (EMT); nous induisons l'EMT dans les cellules De MNO en les exposant au TGF-MD, et en quantifiant les changements biophysiques pendant l'EMT. Nous mesurons la contractilité en fonction de la concentration et de la durée de l'exposition au TGF-MD. Nos résultats ici démontrent l'utilité du TFM parallallé dans le contexte de la biophysique de maladie.

Avant l'ajout de TGF-MD, une monocouche confluente de cellules a une forme pavée de forme et est serrée. Lors du traitement TGF-MD, les cellules deviennent plus allongées en morphologie, agrandissant la zone cellulaire et acquérant un phénotype plus mésenchymal. Utilisant le dispositif multi-puits fabriqué avec des élastomères doux de PDMS, les propriétés physiques des cellules dans un total 17 conditions différentes ont été étudiées. Les cellules ont été traitées avec ...

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l'utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.

La microscopie de la force de traction à haut débit à l'aide du SMD révèle les effets dépendants de la dose de la transformation du facteur de croissance sur la transition épithéliale à mesenchymale

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mon laboratoire s’intéresse à la mécanobiologie, qui examine comment les cellules exercent et sont influencées par les forces mécaniques. Une façon de quantifier la mécanobiologie est de mesurer la contractilité cellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contractilité se manifeste dans les forces de traction exercées sur le substrat cellulaire. Nous quantifions ces forces à l’aide d’une méthodologie généralement appelée microscopie de force de traction ou TFM. Et TFM est mis en œuvre dans une grande variété de méthodes différentes, mais un aspect commun est qu’il s’agit d’une technique de laboratoire plutôt sérielle et lente fait généralement dans un seul plat comme celui-ci ici. Cela nous limite à évaluer une population ou une condition à la fois. Tout au long de la culture cellulaire a été améliorée il ya quelque temps, mais la création de plats multiwell et nous avons pensé, ne serait-il pas génial qu’il nous pourrions à TFM avec le même débit accru et la même efficacité du temps et des reagents? Et c’était notre solution. Nous avons donc créé un plat de force de traction de 96 puits. Et il ressemble beaucoup à un plat conventionnel de culture de tissu de puits 96, cependant avec ce plat nous pouvons non seulement examiner 96 conditions différentes de culture cellulaire, mais également quantifier leur contractilité cellulaire. Cela présente une solution de débit beaucoup plus élevée que les approches à plat unique, ce qui nous permet d’examiner diverses conditions cellulaires et les réponses contractiles. Pendant la métastase de cancer, les cellules cancéreuses voyagent de leur emplacement primaire aux emplacements secondaires, propageant la maladie dans notre corps. Ce comportement métastatique des cellules cancéreuses explique 90% de la mort liée au cancer. L’un des mécanismes proposés pour les cellules cancéreuses épithéliales pour acquérir un phénotype plus migrateur et invasif est la transition épithéliale-mésenchymale, EMT. Pendant l’EMT, ils deviennent plus migrateurs et envahissants, changeant leur comportement physique. Pour mieux comprendre ces changements dans le comportement physique, nous utilisons notre substrat de silicium mou pour mesurer les changements dans la contractilité des cellules de glande mammaire de souris avec l’induction d’EMT par TGF-Dans cette étude, nous avons étudié comment différentes concentrations et temps d’incubation du comportement physique des cellules TGF-affect. Le polydimethylsiloxane est un caoutchouc très conforme avec le modulus young le plus bas d’environ 0,6 kilopascal. La rigidité de ce matériau peut également être tunable en utilisant différentes concentrations d’agent crosslink, y compris SYLGARD 184.To mesurer les propriétés mécaniques de PDMS nous utilisons un rhéomètre. Après avoir mélangé la partie A et la partie B du PDMS, dans un rapport de poids un à un et en ajoutant l’agent de séchage avec le pourcentage de poids spécifié, chargez le lot préparé sur la plaque du rhéomètre. Assurez-vous de charger suffisamment de l’échantillon pour couvrir complètement la zone du fuseau. Il est important de s’assurer que le fuseau touche complètement l’échantillon sans espace libre laissé à son bord. Tout échantillon supplémentaire doit être soigneusement coupé et effacé de la plaque. Mesurer le module de stockage final et la dépendance au temps de la viscoéasticité de chaque échantillon en faisant des balayages de temps et de fréquence à une souche de cisaillement oscillatoire de 0,5%Newsha]Ce graphique est un exemple de test de seq de temps, ayant fait pour mesurer le comportement rhéologique du polydimethylsiloxane avec la souche de cisaillement oscillatoire appliquée de 0,5% et la température de 100

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

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Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...