Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Die Autoren danken Tom Kodger, Michael Landry und Christopher J. Barrett für die Unterstützung bei der Perlensynthese. A.J.E. würdigt Natural Sciences and Engineering Research Council Grants RGPIN/05843-2014 und EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research grant no. 143327, Canadian Cancer Society grant no. 703930, and Canadian Foundation for Innovation Projekt #32749. R. Krishnan erkennt das Stipendium der National Institutes of Health an. R21HL123522 und R01HL136209. Unterstützt wurde H.Y. von Fonds de recherche Santé Québec und Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Die Autoren danken Johanan Idicula für die Unterstützung mit dem Video und Manuskript und Zixin He für die Unterstützung bei der Vorbereitung des Videos.

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird Forscher bei der Herstellung und Verwendung der Multi-Well-TFM-Schale in Abbildung 1führen.
1. Herstellung von PDMS-Silikonsubstraten
<ol><li>Herstellung eines PDMS-Silikonkautschukgemischs auf Basis einer Zusammengesetzten Mischung aus zwei handelsüblichen Kits.<ol>
<li>Fügen Sie Teil A und Teil B des PDMS-Kits (z. B. GEL-8100, siehe Materialtabelle)in einem 1:1-Gewichtsverhältnis in das 50 ml-Rohr ein.<...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Für den Erfolg dieser Methode ist es entscheidend, eine gleichmäßig beschichtete Probe mit einer konstanten Dicke von ca. 100 m zu haben. Der Modul sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die physikalische Bedeutung des biologischen Systems von Interesse zu untersuchen. Bei der Herstellung einer Deckschicht sollte die Konzentration der fiduziden Fluoreszenzpartikel für eine genaue Analyse von Verschiebung und Traktionsspannung optimiert werden. Die Analyse isolierter Einzelzellen erfordert eine dichtere Treuhandsch...

Acto-Myosin-Kontraktilität ist ein wesentliches Element der aktiven Zellmechanik, die das Zellverhalten von Motilität und Proliferation bis zur Stammzelldifferenzierung beeinflusst. In Geweben treibt Kontraktilität die Aktivität von der polaren Trennung in der Embryogenese bis hin zur Atemwegsverengung und Herzaktivität. Entscheidend ist, dass Zellen, um Spannung zu erzeugen, zuerst an ihrer extrazellulären Umgebung haften müssen. Dabei erzeugt diese Kontraktilität Zugkräfte auf ihre Umgebung. Traction Force Microscopy (TFM) ist in einer Vielzahl von Formen entstanden, um diese Kräfte aus verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren.
Der Bereich des TFM hat eine außergewöhnliche Bandbreite an Innovation und Anwendung erlebt, und die Ergebnisse haben den Weg für neue Perspektiven in der Biologie geebnet, die Mechanik und physikalische Kräfte einbeziehen. Beginnend mit faltenden Silikonsubstraten1haben Forscher verschiedene Techniken angewendet, um die Zugkraftkräfte der Zelle zu messen. Diese Ansätze wurden kontinuierlich verbessert und haben nun eine Auflösunginshöhe in der Größenordnung von mehreren Mikrometern2erreicht. Es ist jedoch ein Hauptproblem aufgetreten, das die Schwierigkeit ist, Substrate mit entsprechend niedrigen Modulen mit den verfügbaren Silikonen zu schaffen. Um dieses Problem zu umgehen, wurde Polyacrylamid als Ersatz angenommen, da es einfach ist, Substrate in der Größenordnung von 1-20 kPa3zu erstellen. Wir haben vor kurzem sehr konforme Silikone in TFM4implementiert, so dass wir die gleiche Reihe von Moduli wie Polyacrylamid fertigen können, aber mit den Vorteilen von inertem und robustem Silikon.
TFM-Ansätze haben wertvolle mechanobiologische Entdeckungen ermöglicht, aber ein anhaltendes Manko ist ihre Komplexität, die ihre Verwendung oft auf Forscher in den ingenieurtechnischen oder physikalischen Disziplinen beschränkt. Dies ist zu einem großen Teil auf die detaillierten Kalibrierungen und anspruchsvollen Berechnungen zurückzuführen, die zur Quantifizierung der Kontraktilität erforderlich sind. Eine weitere große Herausforderung ist, dass TFM-Methoden weitgehend niedrigen Durchsatz und daher ungeeignet sind, viele verschiedene Bedingungen oder Populationen gleichzeitig zu studieren5. Dies hat einen Engpass zur Folge, der die Übertragung von TFM von einer spezialisierten Biophysik in breitere biologische und pharmakologische Anwendungen behindert hat.
Wir haben vor kurzem eine Multi-Well-Format TFM-Platte entwickelt, die es Forschern ermöglicht, ihre TFM-Messungen parallelisieren, um die Kontraktilitätsmetriken schneller zu quantifizieren, während die Auswirkungen verschiedener Verbindungen untersucht und auch weniger Reagenzien verwendet werden4 . Diese Methode hat einen breiten Nutzen in verschiedenen mechanobiologischen Studien, von der Bewertung der Auswirkungen von Verbindungen auf die zelluläre Aktivität bis hin zur Quantifizierung der kontraktilen Veränderungen in Differenzierung oder Krankheit.
Ein Bereich der biomedizinischen Forschung, der stark von TFM profitieren wird, ist die Untersuchung, wie physikalische Hinweise die bösartigen Phänotypen von Krebszellen beeinflussen. Metastasen, die für 90% der krebsbedingten Todesfälle verantwortlich sind, sind dadurch gekennzeichnet, dass Krebszellen ihre ursprüngliche Tumorstelle verlassen und eine sekundäre Stelle besiedeln. Damit Zellen durch Gewebe wandern und in das Gefäßsystem ein- und auswandern können, müssen sie ihre Formen radikal ändern, um sich durch diese physikalischen Barrieren zu quetschen, während sie erhebliche Kräfte erzeugen, um sich entlang der extrazellulären Matrix zu bewegen oder sich zwischen anderen Zellen. Diese Kräfte werden durch fokale Adhäsionswechselwirkungen2,3auf das Substrat übertragen und können mit TFM quantifiziert werden. Während Krebserkrankungen biochemisch außergewöhnlich vielfältig sind, mit einem wachsenden Repertoire bekannter Mutationen und Proteinveränderungen, wurden einige häufige physikalische Veränderungen beobachtet; bei einer Vielzahl von Krebsarten, einschließlich Brust-, Prostata- und Lungenkrebs, haben metastasierende Zellen gezeigt, dass sie das 2-3-fache der Zugkraft von nicht-metastasierenden Zellenausüben 6,7,8. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine starke Korrelation zwischen metastasierender Progression und den Zugkräften der Zellen geben kann; Die detaillierten zeitabhängigen Änderungen der Kontraktilität sind jedoch schwer zu prüfen.
Der epitheliale-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein Prozess, bei dem Zellen die adhäsiv- und eng verkäuerte Zellzellhaftung reduzieren und immer wandernder und invasiver werden. Neben physiologischen Funktionen, die Wundheilung und Entwicklungsprozesse umfassen, ist EMT auch ein Prozess, der während der Metastasierung genutzt wird, was es zu einem nützlichen Modellsystem macht, um diesen Prozess zu untersuchen. Mit TGF-B können wir das EMT in murinen Brustepithelzellen (NMuMG)9 induzieren, um die physikalischen Veränderungen während dieser Transformation direkt zu quantifizieren und die zeit- und dosisabhängigen Wirkungen von TGF--B auf EMT und Zellkontraktilität zu charakterisieren. In diesem Artikel zeigen wir den Nutzen dieses Ansatzes, indem wir die Veränderungen der Kontraktilität während einer induzierten EMT messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

Die zelluläre Kontraktilität ist in verschiedenen Aspekten der Biologie von wesentlicher Bedeutung, die Prozesse antreibt, die von Beweglichkeit und Teilung bis hin zu Gewebekontraktion und mechanischer Stabilität reichen, und stellt ein Kernelement des mehrzelligen Tierlebens dar. In anhaftenden Zellen wird die Acto-Myosin-Kontraktion in Zugkräften gesehen, die Zellen auf ihr Substrat ausüben. Dysregulation der zellulären Kontraktilität tritt in einer Vielzahl von Pathologien auf, was Kontraktilität zu einem vielversprechenden Ziel in verschiedenen diagnostischen Ansätzen macht, die Biophysik als Metrik verwenden. Darüber hinaus können neuartige therapeutische Strategien auf der Korrektur der scheinbaren Fehlfunktion der Zellkontraktilität basieren. Diese Anwendungen erfordern jedoch eine direkte Quantifizierung dieser Kräfte.
Wir haben die Silikonelastomer-basierte Traktionskraftmikroskopie (TFM) in einem parallelisierten Multi-Well-Format entwickelt. Unsere Verwendung eines Silikonkautschuks, speziell Polydimethylsiloxan (PDMS), anstelle des gängigen Hydrogelpolyacrylamids (PAA) ermöglicht es uns, robuste und inerte Substrate mit unbestimmten Haltbarkeiten herzustellen, die keine speziellen Lagerbedingungen erfordern. Im Gegensatz zu säulen-PDMS-basierten Ansätzen, die einen Modul im GPa-Bereich haben, ist das hier verwendete PDMS sehr konform und reicht von ca. 0,4 kPa bis 100 kPa. Wir schaffen eine Hochdurchsatzplattform für TFM, indem wir diese großen monolithischen Substrate räumlich in biochemisch unabhängige Brunnen aufteilen und so eine Multi-Well-Plattform für das Traktionskraftscreening schaffen, die mit bestehenden Multi-Well-Systemen kompatibel ist.
In diesem Manuskript verwenden wir dieses Multi-Well-Traktionskraftsystem, um den Epithel zu Mesenchymal Transition (EMT) zu untersuchen; wir EMT in NMuMG-Zellen induzieren, indem wir sie TGF-B aussetzen und die biophysikalischen Veränderungen während der EMT quantifizieren. Wir messen die Kontraktilität in Abhängigkeit von Konzentration und Dauer der TGF--Exposition. Unsere Ergebnisse hier zeigen den Nutzen von parallelisiertem TFM im Kontext der Krankheitsbiophysik.

Vor der Zugabe von TGF-B hat eine konfluente Monoschicht von Zellen eine kopfsteinpflasterartige Form und ist dicht gepackt. Bei der TGF--Behandlung werden die Zellen in der Morphologie länger, vergrößern den Zellbereich und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp. Unter Verwendung des mit weichen PDMS-Elastomeren hergestellten Multi-Well-Geräts wurden die physikalischen Eigenschaften von Zellen in insgesamt 17 verschiedenen Bedingungen untersucht. Die Zellen wurden mit vier verschiede...

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mein Labor interessiert sich für Mechanobiologie, die untersucht, wie Zellen sich ausüben und von mechanischen Kräften beeinflusst werden. Eine Möglichkeit, die Mechanobiologie zu quantifizieren, ist die Messung der Zellkontraktilität. In anhaftenden Zellen manifestiert sich Kontraktilität in Zugkräften, die auf das Zellsubstrat ausgeübt werden. Wir quantifizieren diese Kräfte anhand einer Methode, die allgemein als Traktionskraftmikroskopie oder TFM bezeichnet wird. Und TFM ist in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden implementiert, aber ein gemeinsamer Aspekt ist, dass es eine ziemlich serielle und langsame Labortechnik ist, die typischerweise in einem einzigen Gericht wie diesem hier durchgeführt wird. Dies beschränkt uns auf die Bewertung einer Population oder eines Zustands zu einem Zeitpunkt. Überall in der Zellkultur wurde vor einiger Zeit verbessert, aber die Schaffung von Multiwell-Gerichte und wir dachten, wäre es nicht toll, es könnte wir TFM mit dem gleichen erhöhten Durchsatz und die gleiche Effizienz der Zeit und Reagenzien? Und das war unsere Lösung. Also haben wir eine 96-Well-Traktionskraftschale geschaffen. Und es sieht einem herkömmlichen 96-Well-Gewebe-Kulturgericht sehr ähnlich, aber mit diesem Gericht können wir nicht nur 96 verschiedene Zellkulturbedingungen untersuchen, sondern auch deren Zellkontraktilität quantifizieren. Dies stellt eine viel höhere Durchsatzlösung als Einzelschalenansätze dar, die es uns ermöglichen, verschiedene Zellbedingungen und kontraktile Reaktionen zu untersuchen. Während der Krebsmetastasierung wandern Krebszellen von ihrem primären Standort zu sekundären Standorten und verbreiten die Krankheit in unserem Körper. Dieses metastasierende Verhalten von Krebszellen macht 90% des krebsbedingten Todes aus. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen für Epithelkrebszellen, um einen wandernderen und invasiveren Phänotyp zu erwerben, ist epithelial-mesenchymaler Übergang, EMT. Während der EMT werden sie wandernder und invasiver und verändern ihr körperliches Verhalten. Um diese Veränderungen im physikalischen Verhalten besser zu verstehen, nutzen wir unser weiches Siliziumsubstrat, um Veränderungen in der Kontraktilität von Maus-Brustdrüsenzellen mit EMT-Induktion durch TGF-In dieser Studie zu messen, untersuchten wir, wie unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeit des physikalischen Verhaltens von TGF-beeinflussen. Polydimethylsiloxan ist ein sehr konformer Kautschuk mit dem niedrigsten Young-Modul von etwa 0,6 Kilopascal. Die Steifigkeit dieses Materials kann auch mit verschiedenen Konzentrationen von Vernetzen, einschließlich SYLGARD 184.To messen mechanische Eigenschaften von PDMS wir verwenden ein Rheometer. Nach dem Mischen von Teil A und Teil B des PDMS, in einem Eins-zu-Eins-Gewichtsverhältnis und Zugabe des Aushärtungsmittels mit dem angegebenen Gewichtsprozentsatz, laden Sie die vorbereitete Charge auf die Rheometerplatte. Achten Sie darauf, genügend probenweise zu laden, um den Spindelbereich vollständig abzudecken. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Spindel die Probe vollständig berührt, ohne freien Platz an der Kante. Jede zusätzliche Probe sollte sorgfältig getrimmt und von der Platte abgewischt werden. Messen Sie den Endspeichermodul und die Zeitabhängigkeit der Viskoelastizität jeder Probe, indem Sie Zeit- und Frequenzsweeps bei einem oszillatonigen Scherstamm von 0,5%Newsha durchführen]Diese Grafik ist ein Beispiel für den Zeit-Seq-Test, der das rheologische Verhalten von Polydimethylsiloxan mit angewendetem Oszillator-Scherstamm von 0,5% und einer Temperatur von 100 gemessen hat.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traktionskraftmikroskopie zur Untersuchung der B-Lymphozytenaktivierung

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...