Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Gli autori ringraziano Tom Kodger, Michael Landry e Christopher J. Barrett per l'assistenza con la sintesi di perline. A.J.E. riconosce le sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council fecondazione RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research grant n. 143327, Canadian Cancer Society grant no. 703930 e Canadian Foundation for Innovation #32749 del progetto. R. Krishnan riconosce la sovvenzione dei National Institutes of Health no. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. è stato supportato da Fonds de recherche Santé Québec e Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Gli autori ringraziano Johanan Idicula per l'assistenza con il video e il manoscritto e per l'assistenza nella preparazione del video.

NOTA: Il seguente protocollo guiderà i ricercatori nella fabbricazione e nell'utilizzo del piatto TFM multi-bene illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione dei substrati in silicone PDMS
<ol><li>Preparazione della miscela di gomma in silicone PDMS basata su una miscela composita composta di due kit disponibili in commercio.<ol>
<li>Aggiungere la parte A e la parte B del kit PDMS (ad esempio, GEL-8100, vedere la Tabella dei materiali) in un rapp...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Per il successo di questo metodo, è fondamentale avere un campione uniformemente rivestito con uno spessore costante di circa 100 m. Il modulo deve essere scelto con attenzione per esaminare il significato fisico del sistema biologico di interesse. Quando si fabbrica uno strato superiore, la concentrazione delle particelle fluorescenti fiduciarie deve essere ottimizzata per un'analisi accurata dello spostamento e dello stress da trazione. L'analisi di singole cellule isolate richiede uno strato fiduciario più denso ris...

La contrattilità dell'acto-miosina è un elemento essenziale della meccanica delle cellule attive, influenzando i comportamenti delle cellule dalla motilità e la proliferazione alla differenziazione delle cellule staminali. Nei tessuti, la contrattilità determina l'attività dalla separazione polare nell'embriogenesi, alla costrizione delle vie aeree e all'attività cardiaca. Fondamentalmente, per generare tensione, le cellule devono prima aderire al loro ambiente extracellulare. In questo modo, questa contrattilità genera forze di trazione sull'ambiente circostante. La microscopia a forza di trazione (TFM) è emersa in una moltitudine di forme come un modo per quantificare queste forze da diverse cellule in diverse condizioni.
Il campo della TFM ha visto un'eccezionale ampiezza di innovazione e applicazione, e i risultati hanno aperto la strada a nuove prospettive in biologia, che incorporano la meccanica e le forze fisiche. A partire da substrati di silicone rugosa1, i ricercatori hanno applicato varie tecniche per misurare le forze di trazione cellulare. Questi approcci sono stati continuamente migliorati e hanno ora raggiunto un livello di risoluzione dell'ordine di diversi micron2. Tuttavia, è emerso un problema principale, che è la difficoltà di creare substrati di moduli opportunamente bassi utilizzando i siliconi disponibili. Per aggirare questo problema, la poliacrilammide è stata adottata in sostituzione grazie alla facilità di creazione di substrati nell'ordine di 1-20 kPa3. Recentemente abbiamo implementato siliconi moltoconformi in TFM 4, permettendoci di fabbricare la stessa gamma di moduli come poliacrilammide, ma con i vantaggi di silicone inerte e robusto.
Gli approcci TFM hanno permesso preziose scoperte meccano-biologiche, tuttavia, una persistente carenza è la loro complessità, spesso limitandone l'uso ai ricercatori nelle discipline ingegneristiche o scienze fisiche. Ciò è dovuto in gran parte alle calibrazioni dettagliate e ai calcoli impegnativi necessari per quantificare la contrattilità. Un'altra sfida significativa è che i metodi TFM sono in gran parte a bassa velocità effettiva e quindi inadatti a studiare molte condizioni diverse o popolazioni contemporaneamente5. Ciò ha presentato un collo di bottiglia, che ha ostacolato il trasferimento di TFM da un'impostazione di biofisica specialistica in applicazioni biologiche e farmacologiche più ampie.
Recentemente abbiamo sviluppato una piastra TFM multi-bene, che consente ai ricercatori di parallelizzare le loro misurazioni TFM per una più rapida quantificazione delle metriche di contrattilità, esplorando l'impatto di diversi composti e utilizzando anche meno reagenti4 . Questa metodologia ha un'ampia utilità in diversi studi di meccanobiologia, dalla valutazione degli effetti dei composti sull'attività cellulare, alla quantificazione dei cambiamenti contrattuali nella differenziazione o nella malattia.
Un'area di ricerca biomedica che trarrà grande beneficio dalla TFM è lo studio di come i segnali fisici influenzano i fenotipi maligni delle cellule tumorali. La metastasi, responsabile del 90% dei decessi correlati al cancro, è caratterizzata da cellule cancerose che lasciano il loro sito tumorale originale e colonizzano un sito secondario. Affinché le cellule migrano attraverso i tessuti e passino dentro e fuori dal sistema vascolare, devono cambiare radicalmente le loro forme per spremere attraverso queste barriere fisiche, generando forze sostanziali per muoversi lungo la matrice extracellulare o spostarsi tra gli altri Cellule. Queste forze vengono trasmesse al substrato attraverso interazioni di adesione focale2,3e possono essere quantificate utilizzando TFM. Mentre i tumori sono biochimicamente eccezionalmente diversi, con un repertorio in espansione di mutazioni note e cambiamenti proteici, sono stati osservati alcuni cambiamenti fisici comuni; in una varietà di tumori, tra cui il seno, la prostata e i tumori polmonari, le cellule metastatiche hanno dimostrato di esercitare 2-3 volte le forze di trazione delle cellule non metastatiche6,7,8. Questi risultati suggeriscono che ci può essere una forte correlazione tra la progressione metastatica e le forze di trazione esercitate dalle cellule; tuttavia, i cambiamenti dettagliati dipendente dal tempo nella contrattilità sono difficili da esaminare.
La transizione epiteliale-mesenchica (EMT) è un processo attraverso il quale le cellule riducono l'adesione mediata cellulare-aderente e a giunzione stretta, diventando più migratoria e invasiva. Oltre alle funzioni fisiologiche che includono la guarigione delle ferite e i processi di sviluppo, EMT è anche un processo sfruttato durante la metastasi, rendendolo un utile sistema modello per studiare questo processo. Utilizzando il TGF-z, possiamo indurre l'EMT nelle cellule epiteliali mammarie murine (NMuMG)9 a quantificare direttamente i cambiamenti fisici durante questa trasformazione e a caratterizzare gli effetti dipendenti dal tempo e dalla dose del TGF- su EMT e sulla contratcietà cellulare. In questo articolo viene illustrata l'utilità di questo approccio misurando i cambiamenti nella contrattilità durante un EMT indotto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

La contrattilità cellulare è essenziale in diversi aspetti della biologia, guidando processi che vanno dalla motilità e divisione, alla contrazione dei tessuti e alla stabilità meccanica, e rappresenta un elemento fondamentale della vita animale multicellulare. Nelle cellule aderenti, la contrazione acto-miosina è osservata nelle forze di trazione che le cellule esercitano sul loro substrato. La disregolazione della contrattilità cellulare appare in una miriade di patologie, rendendo la contrattilità un obiettivo promettente in diversi approcci diagnostici utilizzando la biofisica come metrica. Inoltre, nuove strategie terapeutiche possono essere basate sulla correzione dell'apparente malfunzionamento della contrattilità cellulare. Queste applicazioni, tuttavia, richiedono la quantificazione diretta di queste forze.
Abbiamo sviluppato la microscopia a forza di trazione basata su elastomeri in silicone (TFM) in un formato multi-well parallelizzato. Il nostro uso di gomma in silicone, in particolare polidimetilsiloxane (PDMS), piuttosto che la poliacrilammide idrogel comunemente impiegata (PAA) ci permette di fare substrati robusti e inerti con una durata di conservazione indefinita che non richiede condizioni di stoccaggio specializzate. A differenza degli approcci basati su pillar-PDMS che hanno un modulo nella gamma GPa, il PDMS qui utilizzato è molto conforme, che vanno da circa 0,4 kPa a 100 kPa. Creiamo una piattaforma ad alta velocità per TFM partizionando questi grandi substrati monolitici spazialmente in pozzi biochimicamente indipendenti, creando una piattaforma multi-bene per lo screening della forza di trazione che è compatibile con i sistemi multi-well esistenti.
In questo manoscritto, utilizziamo questo sistema di forza di trazione multi-bene per esaminare la transizione epitelica a mesenchymica (EMT); induciamo EMT nelle cellule NMuMG esponendole al TGF-z e per quantificare i cambiamenti biofisici durante EMT. Misuriamo la contrattilità in funzione della concentrazione e della durata dell'esposizione al TGF- I nostri risultati qui dimostrano l'utilità della TFM parallelizzata nel contesto della biofisica della malattia.

Prima dell'aggiunta del TGF-z, un monostrato confluente di cellule ha una forma simile a un ciottolo ed è strettamente imballato. Dopo il trattamento con il TGF-z, le cellule diventano più allungate in morfologia, allargando l'area cellulare e acquisendo un fenotipo più mesenchymal. Utilizzando il dispositivo multi-bene fabbricato con elastomeri PDMS morbidi, sono state studiate le proprietà fisiche delle cellule in un totale di 17 condizioni diverse. Le cellule sono state trattate co...

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.

La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Il mio laboratorio è interessato alla meccanobiologia, che esamina come le cellule esercitano e sono influenzate dalle forze meccaniche. Un modo per quantificare la meccanobiologia è misurare la contrattilità cellulare. Nelle cellule aderenti, la contrattilità si manifesta nelle forze di trazione esercitate sul substrato cellulare. Quantifichiamo queste forze utilizzando una metodologia generalmente indicata come microscopia a forza di trazione o TFM. E TFM è implementato in un'ampia varietà di metodi diversi, ma un aspetto comune è che è una tecnica di laboratorio piuttosto seriale e lenta fatta tipicamente in un singolo piatto come questo qui. Questo ci limita a valutare una popolazione o una condizione alla volta. In tutta la coltura cellulare è stato migliorato qualche tempo fa, ma creando piatti multiwell e abbiamo pensato, non sarebbe fantastico che potessimo TFM con la stessa maggiore produttività e la stessa efficienza di tempo e reagenti? E questa era la nostra soluzione. Così abbiamo creato un piatto di forza di trazione di 96 pozzi. E sembra molto simile a un piatto convenzionale di coltura tissutale da 96 pozzi, tuttavia con questo piatto possiamo non solo esaminare 96 diverse condizioni di coltura cellulare, ma anche quantificare la loro contrattilità cellulare. Questo presenta una soluzione di produttività molto più elevata rispetto agli approcci a piatto singolo, che ci consente di esaminare diverse condizioni cellulari e risposte contrattili. Durante la metastasi tumorale, le cellule tumorali viaggiano dal loro sito primario ai siti secondari, diffondendo la malattia nel nostro corpo. Questo comportamento metastatico delle cellule tumorali rappresenta il 90% della morte correlata al cancro. Uno dei meccanismi proposti per le cellule tumorali epiteliali per acquisire un fenotipo più migratore e invasivo è la transizione epiteliale-mesenchimale, EMT. Durante l'EMT, diventano più migratori e invasivi, cambiando il loro comportamento fisico. Per comprendere meglio questi cambiamenti nel comportamento fisico, utilizziamo il nostro substrato di silicio morbido per misurare i cambiamenti nella contrattilità delle cellule della ghiandola mammaria del topo con induzione EMT da parte di TGF-In questo studio, abbiamo studiato come diverse concentrazioni e tempi di incubazione del comportamento fisico delle cellule influenzate dal TGF. Il polidimetilsiloxano è una gomma molto conforme con il modulo di Young più basso di circa 0,6 kilopascal. La rigidità di questo materiale può anche essere tonnibile utilizzando diverse concentrazioni di agente di reticello tra cui SYLGARD 184.To misurare le proprietà meccaniche del PDMS usiamo un reometro. Dopo aver miscelato la parte A e la parte B del PDMS, in un rapporto peso uno a uno e aver aggiunto l'agente polimerizzante con la percentuale di peso specificata, caricare il lotto preparato sulla piastra del reometro. Assicurarsi di caricare abbastanza del campione per coprire completamente l'area del mandrino. È importante assicurarsi che il mandrino tocchi completamente il campione senza lasciare spazio libero sul bordo. Qualsiasi campione aggiuntivo deve essere accuratamente tagliato e pulito dalla piastra. Misurare il modulo di stoccaggio finale e la dipendenza dal tempo della viscoelasticità di ciascun campione facendo sweep di tempo e frequenza a un ceppo di taglio oscillatorio dello 0,5%Newsha]Questo grafico è un esempio di test seq del tempo, dopo aver fatto per misurare il comportamento reologico del polidimetilsiloxano con ceppo oscillatorio applicato dello 0,5% e temperatura del 100

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Ricerca

Bioingegneria

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Microscopia a forza di trazione per studiare l'attivazione dei linfociti B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...