Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

著者らは、トム・コジャー、マイケル・ランドリー、クリストファー・J・バレットにビーズ合成の支援に感謝しています。A.J.E.は、自然科学・工学研究評議会がRGPIN/05843-2014およびEQPEQ/472339-2015、カナダ保健研究所助成金第143327号、カナダ癌学会助成金第703930号、カナダイノベーション財団を承認プロジェクト #32749。R.クリシュナンは、国立衛生研究所の助成金を認めます。R21HL123522およびR01HL136209。H.Y.はフォンド・ド・レチェルシュ・サンテ・ケベック、フォンド・ド・レチェルシュ・ネイチャー・エ・テクノロジーズ・ケベックによってサポートされました。著者は、ビデオと原稿の支援のためにヨハナン・イディキュラに感謝し、ビデオの準備を支援するためにZixin He.

注: 次のプロトコルは、図 1に示すマルチウェル TFM 皿の製造と使用に関する研究者を導きます。
1. PDMSシリコーン基板の調製
<ol><li>2つの市販キットの複合混合物に基づくPDMSシリコーンゴム混合物の調製。<ol>
<li>PDMSキットのパートAとパートB(例えば、GEL-8100、材料の表を参照)を50 mLチューブに1:1の重量比で追加します。 注:混合物は?...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

この方法の成功のためには、約100μmの一定の厚さの均一にコーティングされたサンプルを持つことが重要です。モジュラスは、目的の生物学的システムの物理的な意義を調べるために慎重に選択する必要があります。最上層を製造する場合、フィデューシャル蛍光粒子の濃度は、変位と牽引応力の正確な分析のために最適化する必要があります。単一細胞を分析するには、コンフルエント単?...

アクトミオシン収縮は、運動性および増殖から幹細胞分化に細胞行動に影響を与える活性細胞力学の不可欠な要素である。組織では、収縮性は胚形成における極性分離から気道収縮および心臓活動に活動を駆動する。批判的に、緊張を生成するために、細胞は最初に細胞外環境に付着しなければなりません。そうすることで、この収縮性は周囲に牽引力を生み出す。トラクションフォース顕微鏡(TFM)は、異なる条件下で多様な細胞からこれらの力を定量化する方法として、多数の形態で出現した。
TFMの分野は、革新と応用の例外的な幅を見てきました, そして、結果は、力学と物理的な力を組み込んだ生物学の新しい視点のための道を開きました.シリコーン基板1のしわから始まり、研究者は細胞牽引力を測定するために様々な技術を適用してきました。これらのアプローチは継続的に改善され、現在は数ミクロン2の順序で解像度のレベルに達しています。しかし、1つの主な問題が浮上しており、これは利用可能なシリコーンを用いて適切に低いモジュリの基板を作成する難しさである。この問題を回避するために、ポリアクリルアミドは、1-20 kPa3の順序で基板を作成する容易さのために代替として採用されました。我々は最近、TFM4に非常に準拠したシリコーンを実装し、ポリアクリルアミドと同じ範囲のモジュリを製造することができますが、不活性で堅牢なシリコーンの利点を持ちます。
TFMのアプローチは貴重なメカノ生物学的発見を可能にしましたが、持続的な欠点は、その複雑さであり、多くの場合、工学や物理科学の分野の研究者にその使用を制限します。これは、収縮性を定量化するために必要な詳細なキャリブレーションと挑戦的な計算に大部分が起因します。もう一つの重要な課題は、TFM法が主に低スループットであり、したがって、同時に多くの異なる条件や集団を研究するのに適していないことです 5.これは、より広範な生物学的および薬理学的応用への専門的な生物物理学からのTFMの移転を妨げているボトルネックを提示している。
我々は最近、研究者が異なる化合物の影響を探求し、またより少ない試薬を使用しながら、収縮性メトリックのより速い定量のために彼らのTFM測定値を並列化することを可能にするマルチウェルフォーマットTFMプレートを開発しました4.この方法論は、細胞活動に対する化合物の影響の評価から、分化または疾患の収縮変化の定量化にまで、多様なメカノバイオロジー研究において広範な有用性を有する。
TFMから大きな利益を得る生物医学的研究の1つの領域は、物理的な手がかりが癌細胞の悪性発現型にどのように影響するかの研究です。転移は、癌関連死の90%を担う、癌細胞が元の腫瘍部位を離れ、二次部位を植民地化することを特徴とする。細胞が組織を通って移動し、血管系の中を出入りするためには、細胞外マトリックスに沿って自分の道を引っ張ったり、他の間を移動したりする実質的な力を生み出しながら、これらの物理的な障壁を圧迫するために形状を根本的に変更する必要があります。細胞。これらの力は、焦点接着相互作用2、3を介して基板に伝達され、TFMを用いて定量することができる。癌は非常に多様であるが、既知の突然変異およびタンパク質の変化の拡大するレパートリーと共に、いくつかの一般的な物理的変化が観察されている。乳癌、前立腺癌、肺癌を含む様々な癌において、転移細胞は非転移細胞6、7、8の牽引力の2〜3倍を発揮することが示されている。これらの結果は、転移性進行と細胞が働く牽引力との間に強い相関関係がある可能性があることを示唆している。しかし、収縮性の詳細な時間依存の変化を調べるのは困難です。
上皮間葉転移(EMT)は、細胞が付着性および接合接合性媒介細胞接着を減少させ、より渡り、侵襲的になるプロセスである。創傷治癒や発達過程を含む生理機能に加えて、EMTは転移時に利用されるプロセスであり、このプロセスを研究するのに有用なモデルシステムです。TGF-βを用いて、マウス乳液上皮細胞(NMuMG)9にEMTを誘導し、この形質転換中の物理的変化を直接定量し、EMTおよび細胞収縮性に対するTGF-βの時間および用量依存的効果を特徴付けることができる。この記事では、誘発EMT中の収縮性の変化を測定することによって、このアプローチの有用性を実証する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

細胞の収縮性は、生物学の多様な側面において不可欠であり、運動性と分裂から組織収縮および機械的安定性に至るまで、多細胞動物生活の中核的な要素を表すプロセスを駆動する。付着細胞では、アクトミオシン収縮は、細胞がその基板に作用する牽引力で見られる。細胞収縮の調節不定は無数の病理に現れ、生物物理学をメトリックとして用いた多様な診断アプローチにおいて、収縮性が有望な標的となる。さらに、新しい治療戦略は、細胞収縮の明らかな誤動作を修正することに基づいていることができます。しかし、これらのアプリケーションは、これらの力の直接定量化を必要とします。
シリコーンエラストマーベースのトラクション力顕微鏡(TFM)を並列マルチウェルフォーマットで開発しました。シリコーンゴム、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用することで、一般的に使用されるヒドロゲルポリアクリルアミド(PAA)ではなく、特殊な貯蔵条件を必要としない無期限の棚寿命を持つ堅牢で不活性な基板を作ることができます。GPa範囲に係数を持つピラーPDMSベースのアプローチとは異なり、ここで使用されるPDMSは、約0.4 kPaから100 kPaに至るまで、非常に準拠しています。これらの大きなモノリシック基板を生化学的に独立したウェルに空間的に分割することにより、TFMのハイスループットプラットフォームを作成し、既存のマルチウェルシステムと互換性のある牽引力スクリーニングのためのマルチウェルプラットフォームを作成します。
この原稿では、このマルチウェル牽引力システムを使用して、上皮から間質遷移(EMT)を調べます。NMuMG細胞にEMTを誘導し、TGF-βにさらすことで、EMT中の生物物理学的変化を定量化します。TGF-β暴露の濃度と持続時間の関数として収縮性を測定する。我々の知見は、疾患生物物理学の文脈における並列化されたTFMの有用性を示す。

TGF-βを添加する前に、細胞のコンフルエント単層は、形状のような石畳を有し、しっかりと詰め込まれる。TGF-β治療では、細胞は形態でより細長くなり、細胞領域を拡大し、より間葉性表現型を獲得する。ソフトPDMSエラストマーで製造されたマルチウェル装置を用いて、合計17種類の条件で細胞の物性を検討した。細胞を4つの異なるTGF-β濃度(0.5、1、2、および4 ng/mL)?...

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

私の研究室では、細胞がどのように作用し、機械的な力の影響を受けるかを調べるメカノバイオロジーに興味があります。メカノバイオロジーを定量化する1つの方法は、細胞収縮性を測定する方法です。付着細胞において、収縮性は細胞基質に及ぼす牽引力に現れる。我々は、一般に牽引力顕微鏡またはTFMと呼ばれる方法論を用いてこれらの力を定量化する。TFMはさまざまな方法で実装されていますが、一般的な側面は、このような単一の料理で通常行われるかなりシリアルで遅いラボテクニックです。これは、一度に1つの人口または条件を評価することを制限します。細胞培養を通してしばらく前に改善されましたが、マルチウェル料理を作り出し、私たちは同じスループットと時間と試薬の同じ効率でTFMにできることは素晴らしいことだと思いませんか?そして、これが私たちの解決策でした。そこで、96ウェルトラクションフォースディッシュを作成しました。そして、それは従来の96ウェル組織培養皿に非常によく似ていますが、この料理では96の異なる細胞培養条件を調べるだけでなく、細胞の収縮性を定量化することができます。これは、単一の皿のアプローチよりもはるかに高いスループットソリューションを提示し、多様な細胞の状態と収縮応答を調べることができます。がん転移の間、がん細胞は原発部位から二次部位に移動し、体内に病気を広げます。癌細胞の転移性行動は、癌関連死の90%を占める。上皮癌細胞がより渡りおよび侵襲的表現型を獲得するための提案されたメカニズムの1つは、上皮間葉転移である、EMTである。EMTの間に、彼らはより多くの回遊性と侵襲的になり、彼らの物理的な行動を変える。これらの物理的挙動の変化をよりよく理解するために、ソフトシリコン基板を利用して、TGFによるEMT誘導によるマウス乳腺細胞の収縮性の変化を測定する研究では、TGF細胞の物理的挙動に対する濃度とインキュベーション時間の異なる影響を調べた。ポリジメチルシロキサンは、ヤング率が約0.6キロパスカルの最も低い非常に準拠したゴムです。この材料の剛性はまた、我々は、Rheometerを使用して、PDMSの機械的特性を測定するSYLGARDを含む架橋剤の異なる濃度を使用して調整184.Toすることができます。PDMSの部品AとB部を混合した後、1対1重量比で硬化剤を指定重量パーセントで添加し、準備したバッチをレオメータプレートにロードする。スピンドル領域を完全にカバーするためにサンプルを十分にロードしてください。スピンドルが、端に空きスペースが残っていないまま、サンプルに完全に触れないようにすることが重要です。余分なサンプルは慎重にトリミングし、プレートから拭く必要があります。0.5%ニューシャの振動剪断線で時間と周波数スイープを行うことによって、各サンプルの粘弾性の最終的な貯蔵弾性率と時間依存性を測定する]このグラフは、0.5%の適用された振動剪断線株と1000の温度を有するポリジメチルシロキサンのレオロジー挙動を測定するために行った時間セク試験の一例である

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Bリンパ球活性化を研究するための牽引力顕微鏡

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...