Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Os autores agradecem a Tom Kodger, Michael Landry, e Christopher J. Barrett para obter assistência com a síntese do cordão. A.J.E. reconhece as bolsas do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Instituto canadense de pesquisa em saúde conceder n º 143327, sociedade canadense de câncer conceder n º 703930, e Fundação Canadense para a inovação #32749 do projeto. R. Denilson reconhece os institutos nacionais de saúde não conceder. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. foi apoiado por Fonds de Recherche Santé Québec, e Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Os autores agradecem a Johanan Idicula pela ajuda com o vídeo e o manuscrito e Zixin ele para obter ajuda na preparação do vídeo.

Nota: o protocolo a seguir guiará pesquisadores na fabricação e uso do prato TFM de vários poços mostrado na Figura 1.
1. preparação de substratos de silicone PDMS
<ol><li>Preparação da mistura da borracha de silicone de PDMS baseada em uma mistura composta de dois jogos comercialmente disponíveis.<ol>
<li>Adicione a parte A e a parte B do kit PDMS (por exemplo, GEL-8100, consulte a tabela de materiais) em uma relação de peso 1:1 no ...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Para o sucesso deste método, é crítico ter uma amostra uniformemente revestida com uma espessura constante de aproximadamente 100 μm. O módulo deve ser cuidadosamente escolhido para examinar o significado físico do sistema biológico de interesse. Ao fabricar uma camada superior, a concentração das partículas fluorescentes de autenticação deve ser otimizada para uma análise precisa do esforço de deslocamento e tração. A análise de células isoladas únicas requer uma camada fiduciária mais densa do que a...

A contratilidade do acto-miosina é um elemento essencial da mecânica celular ativa, impactando os comportamentos celulares da motilidade e proliferação para a diferenciação das células-tronco. Nos tecidos, a contratilidade impulsiona a atividade da separação polar na embriogênese, à constrição das vias aéreas e à atividade cardíaca. Criticamente, para gerar tensão, as células devem primeiro aderir ao seu ambiente extracelular. Ao fazê-lo, essa contratilidade gera forças de tração em seus arredores. A microscopia da força da tração (TFM) emergiu em uma multidão de formulários como uma maneira de quantificar estas forças das pilhas diversas circunstâncias diferentes.
O campo da TFM tem visto uma amplitude excepcional de inovação e aplicação, e os resultados têm pavimentado o caminho para novas perspectivas na biologia, que incorporam mecânica e forças físicas. Começando com enrugamento de substratos de silicone1, pesquisadores têm aplicado várias técnicas para medir as forças de tração celular. Estas abordagens têm sido continuamente melhoradas e alcançaram agora um nível de resolução na ordem de vários mícrons2. No entanto, surgiu um problema principal, que é a dificuldade em criar substratos de moduli adequadamente baixo usando os silicones disponíveis. Para contornar esse problema, a poliacrilamida foi adotada como um substituto devido à facilidade de criação de substratos na ordem de 1-20 kPa3. Recentemente implementamos silicones muito complacentes em TFM4, permitindo-nos fabricar a mesma gama de moduli como poliacrilamida, mas com as vantagens de silicone inerte e robusto.
As aproximações de TFM permitiram descobertas mechano-biológicas valiosas, entretanto, um lacuna persistente são sua complexidade, restringindo frequentemente seu uso aos investigadores nas disciplinas da engenharia ou das ciências físicas. Isto é devido em grande parte às calibrações detalhadas e cálculos desafiadores que são necessários para quantificar a contratilidade. Outro desafio significativo é que os métodos de TFM são em grande parte baixa taxa de transferência e, portanto, mal adaptados para estudar muitas condições diferentes ou populações simultaneamente5. Isso tem apresentado um gargalo, que tem dificultado a transferência de TFM a partir de um especialista em Biofísica configuração em aplicações biológicas e farmacológicas mais amplas.
Desenvolvemos recentemente uma placa TFM de formato multi-bem, que permite aos pesquisadores paralelizar suas medições de TFM para uma quantificação mais rápida das métricas de contratilidade, explorando o impacto de diferentes compostos e também usando menos reagentes4 . Esta metodologia tem ampla utilidade em diversos estudos de mecanobiologia, desde a avaliação dos efeitos de compostos na atividade celular, até a quantificação das alterações contrátil da diferenciação ou da doença.
Uma área de pesquisa biomédica que beneficiará grandemente da TFM é o estudo de como as pistas físicas impactam os fenótipos malignos das células cancerosas. A metástase, responsável para 90% de mortes Cancer-relacionadas, é caracterizada por pilhas cancerosas que saem de seu local original do tumor e que colonizar um local secundário. Para que as células migrem através do tecido e passem dentro e fora do sistema vascular, eles devem mudar radicalmente suas formas para espremer através dessas barreiras físicas, gerando forças substanciais para puxar seu caminho ao longo da matriz extracelular ou mover-se entre outros Células. Essas forças são transmitidas ao substrato por meio de interações de adesão focal2,3, podendo ser quantificadas usando TFM. Embora os cânceres sejam bioquimicamente excepcionalmente diversificados, com um repertório em expansão de mutações conhecidas e alterações protéicas, algumas mudanças físicas comuns foram observadas; em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de mama, próstata e pulmão, as células metastáticas têm demonstrado exercer 2-3 vezes as forças de tração das células não metastáticas6,7,8. Estes resultados sugerem que pode haver uma forte correlação entre a progressão metastática e as forças de tração exercidas pelas células; Entretanto, as mudanças tempo-dependentes detalhadas na contractilidade são difíceis de examinar.
A transição epitelial-mesenquimais (EMT) é um processo pelo qual as células reduzem aderências-e aderência da célula celular mediada pela junção apertada, tornando-se mais migratórias e invasivas. Além de funções fisiológicas que incluem cicatrização de feridas e processos de desenvolvimento, o EMT também é um processo explorado durante a metástase, tornando-se um sistema de modelo útil para estudar esse processo. Usando TGF-β, podemos induzir o EMT em células epiteliais mamárias murinas (NMuMG)9 para quantificar diretamente as alterações físicas durante essa transformação, e caracterizar o tempo e os efeitos dose-dependentes de TGF-β em EMT e contratilidade celular. Neste artigo, nós Demonstramos a utilidade desta aproximação medindo as mudanças na contractilidade durante um EMT induzido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

A contratilidade celular é essencial em diversos aspectos da biologia, conduzindo processos que vão desde a motilidade e divisão, à contração tecidual e estabilidade mecânica, e representa um elemento central da vida animal multicelular. Nas células aderentes, a contração do acto-miosina é observada nas forças de tração que as células exercem em seu substrato. A desregulação da contratilidade celular aparece em uma infinidade de patologias, tornando a contratilidade um alvo promissor em diversas abordagens diagnósticas utilizando biofísica como métrica. Além disso, as estratégias terapêuticas novas podem ser baseadas em corrigir o mau funcionamento aparente da contratilidade da pilha. Estas aplicações, no entanto, exigem a quantificação direta dessas forças.
Nós desenvolvemos o silicone elastomer-baseou a microscopia da força da tração (TFM) em um formato multi-bem paralelizado. Nosso uso de uma borracha de silicone, especificamente o polidimetilsiloxano (PDMS), um pouco do que o poliacrilamida comumente empregado do hidrogel (PAA) permite-nos de fazer carcaças robustas e inertes com prateleira-vidas indefinidas que não exigem nenhumas condições de armazenamento especializadas. Diferentemente das abordagens baseadas em Pilar-PDMS que têm um módulo na faixa GPa, o PDMS usado aqui é muito compatível, variando de aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Criamos uma plataforma de alta taxa de transferência para o TFM, Particionando esses grandes substratos monolíticos espacialmente em poços bioquimicamente independentes, criando uma plataforma multipoços para a triagem de força de tração que é compatível com sistemas de vários poços existentes.
Neste manuscrito, utilizamos este sistema de força de tração multipoços para examinar a transição epitelial para mesenquimal (EMT); Nós induzem o EMT em pilhas de NMuMG expondo os a TGF-β, e para quantificar as mudanças biofísicas durante EMT. Nós medimos a contratilidade em função da concentração e da duração da exposição ao TGF-β. Nossos achados aqui demonstram a utilidade da TFM paralelizada no contexto da doença Biofísica.

Antes da adição de TGF-β, um monocamada confluente das pilhas tem um paralelepípedos como a forma e é embalado firmemente. Em cima do tratamento de TGF-β, as pilhas tornam-se mais alongadas na morfologia, ampliando a área da pilha e adquirindo um phenotype mais mesenquimais. Utilizando o dispositivo do multi-poço fabricado com os elastômeros macios de PDMS, as propriedades físicas das pilhas em um total 17 circunstâncias diferentes foram estudadas. As células foram tratadas co...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Meu laboratório está interessado em mecanobiologia, que examina como as células se exercitam e são influenciadas por forças mecânicas. Uma maneira de quantificar a mecanobiologia é medir a contratilidade celular. Nas células aderentes, a contratlidade se manifesta em forças de tração exercidas no substrato celular. Quantificamos essas forças usando uma metodologia geralmente referida como microscopia de força de tração ou TFM. E tfm é implementado em uma ampla variedade de métodos diferentes, mas um aspecto comum é que é uma técnica de laboratório bastante serial e lenta feito tipicamente em um único prato como este aqui. Isso nos restringe a avaliar uma população ou condição de cada vez. Ao longo da cultura celular foi melhorado há algum tempo, mas criar pratos multiwell e pensamos, não seria ótimo que pudéssemos para tfm com o mesmo rendimento aumentado e a mesma eficiência de tempo e reagentes? E essa era nossa solução. Então criamos um prato de força de tração 96 bem. E se parece muito com um prato convencional de cultura de tecido 96, no entanto, com este prato podemos não só examinar 96 condições diferentes de cultura celular, mas também quantificar sua contratilidade celular. Isso apresenta uma solução de throughput muito maior do que abordagens de prato único, permitindo-nos examinar diversas condições celulares e respostas contratuais. Durante a metástase do câncer, as células cancerígenas viajam de seu local principal para locais secundários, espalhando a doença em nosso corpo. Esse comportamento metastático das células cancerosas é responsável por 90% da morte relacionada ao câncer. Um dos mecanismos propostos para que as células cancerígenas epiteliais adquiram um fenótipo mais migratório e invasivo é a transição epitelial-mesenquimal, EMT. Durante o EMT, eles se tornam mais migratórios e invasivos, mudando seu comportamento físico. Para entender melhor essas mudanças no comportamento físico, utilizamos nosso substrato de silício macio para medir mudanças na contratilidade das células da glândula mamária do rato com indução de EMT pela TGF-Neste estudo, investigamos como diferentes concentrações e tempo de incubação do comportamento físico das células TGF-afet. Polidimtilsiloxano é uma borracha muito compatível com o módulo mais baixo de Young de cerca de 0,6 quilopascal. A rigidez deste material também pode ser incapaz de usar diferentes concentrações de agente crosslink, incluindo SYLGARD 184.To medir propriedades mecânicas do PDMS usamos um reômetro. Depois de misturar a parte A e a parte B do PDMS, em uma relação de peso de um para um e adicionar o agente de cura com a porcentagem de peso especificada, carregue o lote preparado na placa de reômetro. Certifique-se de carregar o suficiente da amostra para cobrir completamente a área do eixo. É importante ter certeza de que o fuso toca a amostra completamente sem espaço livre na borda. Qualquer amostra extra deve ser cuidadosamente aparada e limpa da placa. Meça o módulo final de armazenamento e a dependência de tempo da viscoelasticidade de cada amostra fazendo varreduras de tempo e frequência em uma cepa de cisalhamento oscilatória de 0,5%Newsha]Este gráfico é um exemplo de teste seq de tempo, tendo feito para medir o comportamento reológico de polidimtilsiloxano com cepa de cisalhamento oscilatória aplicada de 0,5% e temperatura de 100

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Microscopia de Força de Tração para Estudar ativação de linfócitos B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...