Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Авторы благодарят Тома Кодгера, Майкла Лэндри и Кристофера Барретта за помощь в синтезе биса. A.J.E. признает гранты Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям RGPIN/05843-2014 и E-PE/472339-2015, Канадские институты исследований в области здравоохранения No 143327, Грант Канадского онкологического общества No 703930 и Канадский фонд инноваций Проект #32749. Р. Кришнан признает, национальные институты здравоохранения грант нет. R21HL123522 и R01HL136209. H.Y. была поддержана Фондами де Рехерче Санте Квебеки и Fonds de recherche Nature et Technologies Квебека. Авторы благодарят Johanan Idicula за помощь в видео и рукописи и Зиксин Он за помощь в подготовке видео.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол будет направлять исследователей в изготовлении и использовании многоскважины TFM блюдо показано на рисунке 1.
1. Приготовление силиконовых субстратов PDMS
<ol><li>Приготовление силиконовой резиновой смеси PDMS на основе композит?...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Для успеха этого метода, очень важно иметь равномерно покрытый образец с постоянной толщиной около 100 мкм. Модули должны быть тщательно отобраны для изучения физической значимости биологической системы интересов. При изготовлении верхнего слоя, концентрация фидуциальных флуоресцент?...

Контрактность акто-миозина является важным элементом активной клеточной механики, влияющим на поведение клеток от подвижности и пролиферации до дифференциации стволовых клеток. В тканях контрактность приводит к активности от полярного разделения при эмбриогенезе, к сужению дыхательных путей и сердечной деятельности. Критически, для того чтобы произвести напряжение, клетки должны сперва придерживаться к их внеклеточной окружающей среде. При этом эта договорность генерирует силы тяги на их окрестностях. Микроскопия силы тяги (TFM) вытекла в множество форм как путь к количественной оценке этих усилий от различных клеток на по-разному условиях.
Область TFM стала свидетелем исключительной широты инноваций и применения, и результаты проложили путь к новым перспективам в биологии, которые включают механику и физические силы. Начиная с морщинсиликоновых силиконовых субстратов1, исследователи применили различные методы для измерения сил тяги клеток. Эти подходы постоянно совершенствуются и в настоящее время достиглиуровня разрешения порядка нескольких микрон 2. Тем не менее, одна основная проблема возникла, которая является трудность в создании субстратов соответствующим низким модули с использованием имеющихся силиконов. Чтобы обойти эту проблему, полиакриламид был принят в качестве замены в связи с легкостью создания субстратов по заказу 1-20 кПа3. Недавно мы внедрили оченьсовместимые силиконы в TFM 4, что позволяет нам изготовить тот же диапазон модули, что и полиакриламид, но с преимуществами инертного и надежного силикона.
Подходы ТФМ позволили провести ценные механо-биологические открытия, однако постоянным недостатком является их сложность, часто ограничивающая их использование исследователями в инженерных или физических дисциплинах. Это в значительной степени объясняется подробными калибровками и сложными расчетами, которые необходимы для количественной оценки контрактности. Еще одной важной проблемой является то, что методы TFM в основном низкой пропускной способ и, следовательно, плохо подходит для изучения многих различных условий или популяций одновременно5. Это создало узкое место, которое препятствует переносу ТФМ из специализированной биофизики в более широкие биологические и фармакологические приложения.
Недавно мы разработали многоскважинную пластину TFM, которая позволяет исследователям параллелизировать свои измерения TFM для более быстрой количественной оценки показателей контрактности, исследуя влияние различных соединений, а также используя меньше реагентов4 . Эта методология имеет широкую полезность в различных исследованиях механобиологии, от оценки влияния соединений на клеточную активность до количественной оценки сократительных изменений в дифференциации или заболеваниях.
Одной из областей биомедицинских исследований, которые принесут большую пользу от TFM является изучение того, как физические сигналы воздействия злокачественных фенотипов раковых клеток. Метастаз, ответственный за 90% смертей, связанных с раком, характеризуется раковыми клетками, покидающих исходный участок опухоли и колонизирующих вторичном месте. Для клеток мигрировать через ткани и пройти в и из сосудистой системы, они должны радикально изменить свою форму, чтобы протиснуться через эти физические барьеры, генерируя значительные силы, чтобы тянуть свой путь вдоль внеклеточной матрицы или двигаться между другими Клетки. Эти силы передаются в субстрат через фокусные взаимодействия2,3и могут быть количественно с помощью TFM. В то время как раковые заболевания биохимически исключительно разнообразны, с расширяющимся репертуаром известных мутаций и белковых изменений, наблюдались некоторые общие физические изменения; в различных раковых заболеваний, в том числе молочной железы, простаты и рака легких, метастатические клетки были показаны оказывать 2-3 раза тяговые силы неметастатических клеток6,7,8. Эти результаты показывают, что может быть сильная корреляция между метастатическим прогрессированием и тяговые силы, оказываемые клетками; однако трудно изучить подробные временные изменения в контрактности.
Эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) представляет собой процесс, при котором клетки уменьшают адепты и плотное соединение опосредованное сливки клеток, становясь более мигрирующим и инвазивным. В дополнение к физиологическим функциям, которые включают заживление ран и процессы развития, EMT также процесс, используемый во время метастазирования, что делает его полезной модельной системой для изучения этого процесса. Используя TGF-я, мы можем побудить EMT в murine молочной эпителиальных клеток (NMuMG)9 непосредственно количественно физических изменений во время этой трансформации, и характеризуют время и дозо-зависимые эффекты TGF-я на ЭМТ и сократительность клеток. В этой статье мы демонстрируем полезность этого подхода, измеряя изменения в контрактности во время индуцированной EMT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

Сотовая контрактность имеет важное значение в различных аспектах биологии, движущих процессов, которые варьируются от подвижности и деления, для сокращения тканей и механической стабильности, и представляет собой основной элемент многоклеточной жизни животных. В клетках атто-миозина, акто-миосин сокращения наблюдается в тяговых сил, которые клетки оказывают на их субстрат. Дисрегуляция клеточной контрактильности появляется в множестве патологий, что делает контрактность перспективной мишенью в различных диагностических подходах с использованием биофизики в качестве метрики. Кроме того, новые терапевтические стратегии могут быть основаны на исправлении очевидной неисправности клеточной контрактности. Однако эти приложения требуют прямой количественной оценки этих сил.
Мы разработали силиконовую эластомерную масляную силовую микроскопию (TFM) в параллельном формате мультиколодца. Наше использование силиконовой резины, в частности полидиметилсилоксана (PDMS), а не широко используемых гидрогель полиакриламид (PAA) позволяет нам сделать надежные и инертные субстраты с неопределенным исполидных сроков хранения, не требующих специализированных условий хранения. В отличие от подходов на основе столба-PDMS, которые имеют модуль в диапазоне GPa, PDMS, используемый здесь, очень совместим, от примерно 0,4 кПа до 100 кПа. Мы создаем платформу высокой пропускной силы для TFM путем раздела этих больших монолитных субстратов, пространственно в биохимически независимых скважин, создавая многоскважинную платформу для скрининга силы тяги, совместимую с существующими многоскважинными системами.
В этой рукописи мы используем эту многостороннюю систему силы тяги для изучения Эпителия к мезенхимальному переходу (EMT); мы индуцируем EMT в клетках NMuMG путем подвергать их к TGF-я, и для того чтобы количественно биофизические изменения во время EMT. Мы измеряем сородичность как функцию концентрации и продолжительности воздействия TGF-я. Наши выводы здесь демонстрируют полезность параллелизированного TFM в контексте биофизики болезней.

Перед добавлением TGF-я, слияние монослой клеток имеет булыжник, как форма и плотно упакованы. После лечения TGF-я, клетки становятся более удлиненные в морфологии, увеличение области клеток и приобретения более мезенхимального фенотипа. Используя мульти-хорошо устройст...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Мы представляем высокую пропускную силу силы ассеис изготовлены с силиконовой резины (PDMS). Этот новый ассси подходит для изучения физических изменений в сотрудничности клеток во время различных биологических и биомедицинских процессов и заболеваний. Мы демонстрируем полезность этого метода, измеряя tGF-я зависимое увеличение контрактности во время эпителиального перехода к мезенхимальному.

Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Моя лаборатория интересуется механобиологией, которая исследует, как клетки оказывают давление и находятся под влиянием механических сил. Одним из способов количественной оценки механобиологии является измерение клеточной сотысячность. В адептовых клетках контрактичность проявляется в силах тяги, оказываемых на клеточный субстрат. Мы количественно эти силы с помощью методологии обычно называют тяги силы микроскопии или TFM. И TFM реализована в широком спектре различных методов, но общий аспект заключается в том, что это довольно серийный и медленный метод лаборатории, как правило, в одном блюде, как этот здесь. Это ограничивает нас в оценке одного населения или состояния за один раз. На протяжении в клеточной культуры была улучшена некоторое время назад, но создание мультиуэлл блюда, и мы думали, не было бы здорово, мы могли бы TFM с той же повышенной пропускной способности и той же эффективности времени и реагентов? И это было наше решение. Таким образом, мы создали 96 хорошо тяги силы блюдо. И это очень похоже на обычные 96 хорошо ткани культуры блюдо, однако с этим блюдом мы можем не только изучить 96 различных условий клеточной культуры, но и количественно их клеток контракту. Это представляет собой гораздо более высокое решение пропускной способности, чем один подход блюдо, что позволяет нам изучить различные условия клеток и контрактильные ответы. Во время метастазирования рака раковые клетки путешествуют от своего основного участка к вторичным участкам, распространяя болезнь в нашем организме. На это метастатическое поведение раковых клеток приходится 90% случаев смерти, связанных с раком. Одним из предлагаемых механизмов эпителиальных раковых клеток для приобретения более мигрирующих и инвазивных фенотипов является эпителиально-мезенхимальный переход, ЭМТ. Во время скорой МТ они становятся более мигрируют и инвазивны, изменяя свое физическое поведение. Чтобы лучше понять эти изменения в физическом поведении, мы используем наш мягкий подложка кремния для измерения изменений в контрактности клеток молочной железы мыши с индукцией ЭМТ TGF-В этом исследовании, мы исследовали, как различные концентрации и инкубационные время TGF-влияния клеток физического поведения. Polydimethylsiloxane является очень совместимой резины с самым низким модул янг около 0,6 килопаскаля. Жесткость этого материала также может быть настроена с использованием различных концентраций перекрестного агента, включая SYLGARD 184.To измеряет механические свойства PDMS мы используем реометр. После смешивания части А и части В PDMS, в соотношении один к одному веса и добавления лечебного средства с указанным процентом веса, загрузите подготовленную партию на реометровую пластину. Убедитесь в том, чтобы загрузить достаточно образца, чтобы полностью покрыть область шпинделя. Важно убедиться, что шпиндель касается образца полностью без свободного пространства осталось на его краю. Любой дополнительный образец следует тщательно подстригать и вытирать с тарелки. Измерьте окончательную модулу хранения и зависимость времени вязкости каждого образца, делая время и частоту зачисток на осцилляторном деформации стрижки 0.5%Newsha'Этот график является одним из примеров теста seq времени, сделав для измерения реологического поведения полидиметилсилоксана с прикладным колеблемым деформацией стрижки 0,5% и температурой 100%

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Тракция Микроскопия интегрирована с микрофлюиди для хемотаксической коллективной миграции

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Микроскопия силы тяги для изучения активации лимфоцитов B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...