Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Los autores agradecen a Tom Kodger, Michael Landry y Christopher J. Barrett por su ayuda con la síntesis de cuentas. A.J.E. reconoce que el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería otorga rgPIN/05843-2014 y EQPEQ/472339-2015, la subvención 143327 de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria, la subvención no 703930 de la Sociedad Canadiense contra el Cáncer y la Fundación Canadiense para la Innovación #32749 del proyecto. R. Krishnan reconoce que los Institutos Nacionales de Salud otorgan no. R21HL123522 y R01HL136209. H.Y. fue apoyado por Fonds de recherche Santé Québec, y Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Los autores agradecen a Johanan Idicula por su ayuda con el video y el manuscrito y a Zixin He por su ayuda en la preparación del vídeo.

NOTA: El siguiente protocolo guiará a los investigadores en la fabricación y el uso de la placa de MFT multi-pozo que se muestra en la Figura1.
1. Preparación de sustratos de silicona PDMS
<ol><li>Preparación de la mezcla de caucho de silicona PDMS basada en una mezcla compuesta de dos kits disponibles comercialmente.<ol>
<li>Añada la Parte A y la Parte B del kit PDMS (por ejemplo, GEL-8100, consulte la Tabla de Materiales)en una relación ...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

Para el éxito de este método, es fundamental tener una muestra recubierta uniformemente con un espesor constante de aproximadamente 100 m. El módulo debe ser cuidadosamente elegido para examinar la importancia física del sistema biológico de interés. Al fabricar una capa superior, la concentración de las partículas fluorescentes fiduciales debe optimizarse para un análisis preciso del desplazamiento y la tensión de tracción. El análisis de células individuales aisladas requiere una capa fiduciaria más densa...

La contractilidad acto-miosina es un elemento esencial de la mecánica celular activa, afectando los comportamientos celulares desde la motilidad y la proliferación hasta la diferenciación de células madre. En los tejidos, la contractilidad impulsa la actividad desde la separación polar en la embriogénesis, hasta la constricción de las vías respiratorias y la actividad cardíaca. Críticamente, para generar tensión, las células primero deben adherirse a su entorno extracelular. Al hacerlo, esta contractilidad genera fuerzas de tracción en su entorno. La Microscopía de Fuerza de Tracción (TFM) ha surgido en una multitud de formas como una manera de cuantificar estas fuerzas de diversas células bajo diferentes condiciones.
El campo del MFT ha visto una excepcional amplitud de innovación y aplicación, y los resultados han allanado el camino para nuevas perspectivas en biología, que incorporan mecánica y fuerzas físicas. A partir de arrugas sustratos de silicona1, los investigadores han aplicado varias técnicas para medir las fuerzas de tracción celular. Estos enfoques se han mejorado continuamente y ahora han alcanzadoun nivel de resolución sobre el orden de varios micras 2. Sin embargo, ha surgido un problema principal, que es la dificultad para crear sustratos de módulos adecuadamente bajos utilizando las siliconas disponibles. Para evitar este problema, la poliacrilamida se adoptó como reemplazo debido a la facilidad de creación de sustratos por el orden de 1-20 kPa3. Recientemente implementamos siliconas muy compatiblesen TFM 4, lo que nos permite fabricar la misma gama de módulos que la poliacrilamida, pero con las ventajas de la silicona inerte y robusta.
Los enfoques de MFT han permitido valiosos descubrimientos mecanobiológicos, sin embargo, una deficiencia persistente es su complejidad, a menudo restringiendo su uso a los investigadores en las disciplinas de ingeniería o ciencias físicas. Esto se debe en gran parte a las calibraciones detalladas y cálculos desafiantes que se requieren para cuantificar la contractilidad. Otro desafío importante es que los métodos de MFT son en gran medida de bajo rendimiento y, por lo tanto, no aptos para estudiar muchas condiciones o poblaciones diferentes simultáneamente5. Esto ha presentado un cuello de botella, que ha obstaculizado la transferencia de MFT de un entorno especializado en biofísica a aplicaciones biológicas y farmacológicas más amplias.
Recientemente hemos desarrollado una placa TFM de formato multipozo, que permite a los investigadores paralelizar sus mediciones de MFM para una cuantificación más rápida de las métricas de contractilidad, mientras exploran el impacto de diferentes compuestos y también utilizan menos reactivos4 . Esta metodología tiene una amplia utilidad en diversos estudios de mecanobiología, desde la evaluación de los efectos de los compuestos en la actividad celular, hasta la cuantificación de los cambios contractilo en la diferenciación o enfermedad.
Un área de investigación biomédica que se beneficiará enormemente de la MFT es el estudio de cómo las señales físicas afectan los fenotipos malignos de las células cancerosas. La metástasis, responsable del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer, se caracteriza por células cancerosas que salen de su sitio tumoral original y colonizan un sitio secundario. Para que las células migren a través del tejido y pasen dentro y fuera del sistema vascular, deben cambiar radicalmente sus formas para exprimir a través de estas barreras físicas mientras generan fuerzas sustanciales para abrirse camino a lo largo de la matriz extracelular o moverse entre otras Células. Estas fuerzas se transmiten al sustrato a través de interacciones de adhesión focal2,3, y se pueden cuantificar utilizando TFM. Mientras que los cánceres son bioquímicamente excepcionalmente diversos, con un repertorio en expansión de mutaciones conocidas y cambios de proteínas, se han observado algunos cambios físicos comunes; en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer esternón, próstata y pulmón, se ha demostrado que las células metastásicas ejercen 2-3 veces las fuerzas de tracción de las células no metastásicas6,7,8. Estos resultados sugieren que puede haber una fuerte correlación entre la progresión metastásica y las fuerzas de tracción ejercidas por las células; sin embargo, los cambios detallados de contractilidad dependientes del tiempo son difíciles de examinar.
La transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso por el cual las células reducen la adhesión de células celulares mediadas por unión mediada y estrecha, cada vez más migratorias e invasivas. Además de las funciones fisiológicas que incluyen la cicatrización de heridas y los procesos de desarrollo, la EMT es también un proceso explotado durante la metástasis, por lo que es un sistema modelo útil para estudiar este proceso. Usando TGF-, podemos inducir la EMT en células epiteliales mamarias murinas (NMuMG)9 para cuantificar directamente los cambios físicos durante esta transformación, y caracterizar el tiempo y los efectos dependientes de la dosis de TGF-o en la EMT y la contractilidad celular. En este artículo, demostramos la utilidad de este enfoque midiendo los cambios en la contractilidad durante una EMT inducida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

La contractilidad celular es esencial en diversos aspectos de la biología, impulsando procesos que van desde la motilidad y la división, hasta la contracción de los tejidos y la estabilidad mecánica, y representa un elemento central de la vida animal multicelular. En las células adherentes, la contracción acto-miosina se ve en las fuerzas de tracción que las células ejercen sobre su sustrato. La disregulación de la contractilidad celular aparece en un sinfín de patologías, haciendo de la contractilidad un objetivo prometedor en diversos enfoques de diagnóstico utilizando la biofísica como métrica. Además, las nuevas estrategias terapéuticas pueden basarse en corregir el mal funcionamiento aparente de la contractilidad celular. Estas aplicaciones, sin embargo, requieren la cuantificación directa de estas fuerzas.
Hemos desarrollado microscopía de fuerza de tracción basada en elastómero de silicona (TFM) en un formato multipozo paralelizado. Nuestro uso de un caucho de silicona, específicamente polidimetilsiloxano (PDMS), en lugar del poliacrilamida de hidrogel (PAA) comúnmente empleado nos permite hacer sustratos robustos e inertes con vidas útiles indefinidas que no requieren condiciones de almacenamiento especializadas. A diferencia de los enfoques basados en pilar-PDMS que tienen un módulo en la gama GPa, el PDMS utilizado aquí es muy compatible, que van desde aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Creamos una plataforma de alto rendimiento para TFM dividiendo estos grandes sustratos monolíticos espacialmente en pozos bioquímicos independientes, creando una plataforma multipozo para el cribado de fuerza de tracción que es compatible con los sistemas multipozo existentes.
En este manuscrito, utilizamos este sistema de fuerza de tracción multipozo para examinar el Epitelial a la Transición Mesenquimal (EMT); inducimos la EMT en las células NMuMG exponiéndolas a TGF-o, y cuantificando los cambios biofísicos durante la EMT. Medimos la contractilidad en función de la concentración y la duración de la exposición a TGF. Nuestros hallazgos aquí demuestran la utilidad del MFT paralelizado en el contexto de la biofísica de la enfermedad.

Antes de la adición de TGF-o, una monocapa confluente de células tiene una forma adoquinada y está apretadamente embalada. Tras el tratamiento con TGF, las células se vuelven más alargadas en morfología, ampliando el área celular y adquiriendo un fenotipo más mesenquimal. Utilizando el dispositivo multipozo fabricado con elastómeros PDMS suaves, se estudiaron las propiedades físicas de las células en un total de 17 condiciones diferentes. Las células fueron tratadas con cuatro...

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mi laboratorio está interesado en la mecanobiología, que examina cómo las células ejercen y están influenciadas por fuerzas mecánicas. Una forma de cuantificar la mecanobiología es midiendo la contractilidad celular. En las células adherentes, la contractilidad se manifiesta en las fuerzas de tracción ejercidas sobre el sustrato celular. Cuantificamos estas fuerzas utilizando una metodología generalmente conocida como microscopía de fuerza de tracción o MFT. Y TFM se implementa en una amplia variedad de métodos diferentes, pero un aspecto común es que es una técnica de laboratorio bastante serial y lenta hecha típicamente en un solo plato como este aquí. Esto nos limita a evaluar una población o condición a la vez. A lo largo del cultivo celular se mejoró hace algún tiempo, pero la creación de platos multipocilnos y pensamos, ¿no sería genial que pudiéramos TFM con el mismo mayor rendimiento y la misma eficiencia de tiempo y reactivos? Y esta fue nuestra solución. Así que creamos un plato de fuerza de tracción de 96 pozos. Y se ve muy similar a un plato convencional de cultivo de tejido de 96 pozos, sin embargo con este plato no sólo podemos examinar 96 condiciones diferentes de cultivo celular, sino también cuantificar su contractilidad celular. Esto presenta una solución de rendimiento mucho más alta que los enfoques de un solo plato, lo que nos permite examinar diversas condiciones celulares y respuestas contráctiles. Durante la metástasis del cáncer, las células cancerosas viajan desde su sitio primario a sitios secundarios, propagando la enfermedad en nuestro cuerpo. Este comportamiento metastásico de las células cancerosas representa el 90% de la muerte relacionada con el cáncer. Uno de los mecanismos propuestos para que las células cancerosas epiteliales adquieran un fenotipo más migratorio e invasivo es la transición epitelial-mesenquimal, EMT. Durante la EMT, se vuelven más migratorios e invasivos, cambiando su comportamiento físico. Para entender mejor estos cambios en el comportamiento físico, utilizamos nuestro sustrato de silicio blando para medir los cambios en la contractilidad de las células de la glándula mamaria de ratón con inducción EMT por TGF-En este estudio, investigamos cómo diferentes concentraciones y tiempo de incubación del comportamiento físico de las células afecta a TGF. El polidimetilsiloxano es un caucho muy compatible con el módulo más bajo de Young de aproximadamente 0,6 kilopascales. La rigidez de este material también puede ser sintonizable utilizando diferentes concentraciones de agente de reticulación incluyendo SYLGARD 184.To medir las propiedades mecánicas de PDMS utilizamos un reómetro. Después de mezclar la parte A y la parte B del PDMS, en una relación de peso de uno a uno y agregar el agente de curado con el porcentaje de peso especificado, cargue el lote preparado en la placa del reómetro. Asegúrese de cargar lo suficiente de la muestra para cubrir completamente el área del husillo. Es importante asegurarse de que el husillo toca la muestra completamente sin espacio libre en su borde. Cualquier muestra adicional debe ser cuidadosamente recortada y limpiada de la placa. Mida el módulo de almacenamiento final y la dependencia de tiempo de la viscoelasticidad de cada muestra haciendo barridos de tiempo y frecuencia a una cepa de cizallamiento oscilatoria de 0.5%Newsha]Este gráfico es un ejemplo de prueba de tiempo seq, habiendo hecho para medir el comportamiento reológico de polidimetilsiloxano con tensión de cizallamiento oscilatoria aplicada de 0.5% y temperatura de 1000

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Microscopía de fuerza de tracción para estudiar la activación de linfocitos B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...