Name: high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

Författarna tackar tom Kodger, Michael Landry, och Christopher J. Barrett för hjälp med Bead syntes. A.J.E. erkänner naturvetenskap och teknik Forskningsrådet beviljar RGPIN/05843-2014 och EQPEQ/472339-2015, kanadensiska institut för hälsoforskning Grant nr 143327, Canadian Cancer Society Grant nr 703930, och kanadensiska Stiftelsen för innovation Projekt #32749. R. Ulrica erkänner National Institutes of Health Grant No. R21HL123522 och R01HL136209. H.Y. stöddes av fonds de Recherche Santé Québec, och fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Författarna tackar Johanan Idicula för hjälp med video och manuskript och Zixin han för hjälp med att förbereda videon.

Anmärkning: följande protokoll kommer att vägleda forskare i fabricera och använda multi-well TFM skålen visas i figur 1.
1. beredning av PDMS silikon substrat
<ol><li>Beredning av PDMS silikon gummiblandning baserad på en sammansatt blandning av två kommersiellt tillgängliga kit.<ol>
<li>Lägg till del A och del B i PDMS Kit (t. ex. GEL-8100, se material tabellen) i ett 1:1-viktförhållande i 50 ml-röret. Anmärkning: blandningen b...

<ol>
	<li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicone+rubber+substrata:+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion.">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li><li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+in+locomoting+cells.">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+Cell-to-Substrate+Interface+during+Locomotion+of+Fibroblasts.">Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Yoshie, H., Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Screening+Enabled+by+Compliant+PDMS+Elastomers.">Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers.</a> Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).</li><li>Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Agus, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+sciences+network+characterization+of+non-tumorigenic+and+metastatic+cells.">A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).</li><li>Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Stochastic,+Motor-Driven+Properties+of+the+Cytoplasm+Using+Force+Spectrum+Microscopy.">Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+LPP+and+alpha-actinin+mediates+TGFbeta-induced+migration+and+invasion+of+ErbB2-expressing+breast+cancer+cells.">A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).</li><li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer.">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid &amp; Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li></ol>

För att denna metod ska lyckas är det viktigt att ha ett jämnt belagt prov med en konstant tjocklek på cirka 100 μm. Modulus bör noga väljas för att undersöka den fysiska betydelsen av det biologiska systemet av intresse. När fabricera ett toppskikt, koncentrationen av relaterat fluorescerande partiklar bör optimeras för noggrann analys av förskjutning och dragkraft stress. Analysera isolerade enskilda celler kräver en tätare förvaltnings skikt än att mäta konfluenta monolayers. Dessutom bör ytan av un...

Acto-myosin kontraktilitet är en viktig del av aktiv cellmekanik, vilket påverkar cellernas beteenden från motilitet och proliferation till stamcells differentiering. I vävnader, kontraktilitet driver aktivitet från Polar separation i embryogenes, till luftvägarna sammandragning och hjärtaktivitet. Kritiskt, för att generera spänningar, celler måste först följa deras extracellulära miljö. På så sätt genererar denna kontraktilitet dragkraft krafter på sin omgivning. Traction Force mikroskopi (TFM) har dykt upp i en mängd olika former som ett sätt att kvantifiera dessa styrkor från olika celler under olika förhållanden.
Området TFM har sett en exceptionell bredd av innovation och tillämpning, och resultaten har banat väg för nya perspektiv i biologi, som införlivar mekanik och fysiska krafter. Från och med skrynkling silikon substrat1, forskare har tillämpat olika tekniker för att mäta celler dragkraft. Dessa metoder har kontinuerligt förbättrats och har nu nått en nivå av upplösning på order av flera mikrometer2. Dock har ett huvudproblem uppstått, vilket är svårigheten att skapa substrat av lämpligt låg moduli med hjälp av tillgängliga silikoner. För att kringgå detta problem antogs polyakrylamid som en ersättning på grund av hur lätt det var att skapa substrat på order av 1-20 kPa3. Vi har nyligen genomfört mycket kompatibla silikoner i TFM4, vilket gör att vi kan tillverka samma sortiment av moduli som polyakrylamid, men med fördelarna med inert och robust silikon.
TFM-metoder har möjliggjort värdefulla Mechano-biologiska upptäckter, men en ihållande brist är deras komplexitet, ofta begränsar deras användning till forskare inom teknik eller fysikaliska vetenskaper discipliner. Detta beror till stor del på de detaljerade kalibreringar och utmanande beräkningar som krävs för att kvantifiera kontraktilitet. En annan viktig utmaning är att TFM-metoder är i stort sett låg kapacitet och därför dåligt lämpade för att studera många olika villkor eller populationer samtidigt5. Detta har visat en flaskhals, vilket har hämmat överföringen av TFM från en specialist biofysik inställning till bredare biologiska och farmakologiska tillämpningar.
Vi har nyligen utvecklat en multi-well format TFM plattan, som gör det möjligt för forskare att parallellisera sina TFM mätningar för snabbare kvantifiering av kontraktilitet mätvärden, samtidigt undersöka effekterna av olika föreningar och även använda mindre reagens4 . Denna metod har bred nytta i olika Mekanobiologi studier, från att utvärdera effekterna av föreningar på cellulär aktivitet, att kvantifiera kontraktila förändringar i differentiering eller sjukdom.
Ett område av biomedicinsk forskning som kommer att dra stor nytta av TFM är studiet av hur fysiska signaler påverkar de maligna fenotyperna av cancerceller. Metastaser, ansvarig för 90% av cancerrelaterade dödsfall, kännetecknas av cancerceller lämnar sin ursprungliga tumör plats och kolonisera en sekundär plats. För celler att migrera genom vävnad och passera in och ut ur det vaskulära systemet, de måste radikalt ändra sina former för att pressa igenom dessa fysiska barriärer samtidigt generera betydande krafter för att dra sig längs extracellulära matris eller flytta mellan andra Celler. Dessa krafter överförs till underlaget genom fokala vidhäftning interaktioner2,3, och kan kvantifieras med hjälp av TFM. Medan cancer är biokemiskt exceptionellt varierande, med en expanderande repertoar av kända mutationer och protein förändringar, några vanliga fysiska förändringar har observerats; i en mängd olika cancerformer, inklusive bröst-, prostata-och lungcancer, metastatiska celler har visat sig utöva 2-3 gånger drag krafterna hos icke-metastaserande celler6,7,8. Dessa resultat tyder på att det kan finnas ett starkt samband mellan metastaserande progression och de dragkraft som utövas av celler; emellertid, de detaljerade tidsberoende förändringarna i kontraktilitet är svåra att undersöka.
Den epiteliala-till-mesenkymala övergången (EMT) är en process där celler minskar anhängare-och tätt-korsning medierad cell-cell adhesion, blir mer flyttande och invasiva. Förutom fysiologiska funktioner som inkluderar sårläkning och utvecklingsprocesser, är EMT också en process som utnyttjas under metastaser, vilket gör det till ett användbart modellsystem för att studera denna process. Med hjälp av TGF-β, kan vi inducera EMT i murina bröst epitelceller (NMuMG)9 att direkt kvantifiera de fysiska förändringarna under denna omvandling, och karakterisera tid och dos-beroende effekter av TGF-β på EMT och cell kontraktilitet. I denna artikel, vi visar nyttan av detta tillvägagångssätt genom att mäta förändringar i kontraktilitet under en inducerad EMT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:824pt" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl75" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Nusil Technology</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">GEL-8100</td>
			<td class="xl70" style="width:206pt" width="275">High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl70" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Ellsworth Adhesives</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Custom Cut Glass&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Hausser Scientific Company</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">109.6mm&#177; x 72.8mm&#177; x 1mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Target 2TM Nylon Syringe Filter</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">F2513-4</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">2572</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl69" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">3099</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Ethyl alcohol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Greenfield Global</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">P016EA95</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">0.95</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl69" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">2-Propanol</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">190764</td>
			<td class="xl69" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Surface Coating</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sulfo-SANPAH Crosslinker</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Proteochem</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">c1111-100mg</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Fibronectin bovine plasma</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">F1141-1MG</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">PBS, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">pH 7.4, without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">DMSO</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">472301</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl77" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">DMEM, 1X</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">319-005-CL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">080-150</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">Premium Quality,&#160;Endotoxin &#60;1, Hemoglobin &#60;25</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">HEPES</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">330-050-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">1M, free acid</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Human Insulin Recombinant</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">511-016-CM</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">USP grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-201-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100 X, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">L-Glutamine solution</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">609-065-EL</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">200mM solution, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl65" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Amphotericine B</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Wisent</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">450-105-QL</td>
			<td class="xl66" style="width:206pt" width="275">250&#956;g/ml, sterile filtered for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl66" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Peprotech</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">100-21</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">HEK293 Derived</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Acetic acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl65" style="width:206pt" width="275">537020</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Glacial, &#8805;99.85%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl65" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Cictric acid</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">251275&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">NMuMG</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">ATCC</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">CRL-1636</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Mouse Mammary Gland Cell Line</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Sodium azide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Fisher Schientific</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">AC190385000</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">99%, extra pure, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Potassium hydroxide</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" class="xl64" style="width:206pt" width="275">221473</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">ACS reagent, &#8805;85%, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">TritonX-100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">X100</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Bead Synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">468495-100MG</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">97%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methyl methacrylate</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">M55909-500ML</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">contains &#8804;30&#160;ppm MEHQ as inhibitor, 99%</td>
		</tr>
		<tr height="62" style="height:46.8pt">
			<td class="xl67" height="62" style="height:46.8pt;width:206pt" width="275">Inhibitor Remover</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">306312-1EA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl68" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Gelest&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">DMS-R31 (25,000g/mol)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl67" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">2,2&#8242;-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">441090-25G</td>
			<td align="right" class="xl72" style="width:206pt" width="275">98%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane&#160;</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">296090-2L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl67" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Hexane, mixture of isomers</td>
			<td class="xl67" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">227064-1L</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">anhydrous, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.2pt">
			<td class="xl66" height="42" style="height:31.2pt;width:206pt" width="275">Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 1</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">WHA1001055</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">circles, diam. 55&#160;mm,</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl76" colspan="4" height="21" style="height:15.6pt;
 width:824pt" width="1100">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl73" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Laurell WS-650Mz-23NPPB</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Laurell Technologies</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275"></td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl74" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">VWR</td>
			<td class="xl74" style="width:206pt" width="275">21474-622</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.6pt">
			<td class="xl64" height="21" style="height:15.6pt;width:206pt" width="275">Rheometer</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">Anton Paar</td>
			<td class="xl64" style="width:206pt" width="275">MCR 302 WESP</td>
			<td class="xl71" style="width:206pt" width="275"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput traction force microscopy using pdms reveals dose-dependent effects of transforming growth factor-&#946; on the epithelial-to-mesenchymal transition

Cellulär kontraktilitet är viktigt i olika aspekter av biologi, drivande processer som sträcker sig från motilitet och uppdelning, till vävnadkontraktion och mekanisk stabilitet, och utgör en central del av flercelliga djurliv. I anhängare celler, acto-myosin kontraktion ses i dragkrafter som celler utövar på deras substrat. Dysreglering av cellulära kontraktilitet visas i en myriad av patologier, vilket gör kontraktilitet ett lovande mål i olika diagnostiska metoder med hjälp av biofysik som ett mått. Dessutom kan nya terapeutiska strategier baseras på korrigering av skenbara fel i cell kontraktilitet. Dessa tillämpningar kräver dock en direkt kvantifiering av dessa styrkor.
Vi har utvecklat silikon elastomer-baserade Traction Force mikroskopi (TFM) i en parallelliserad multi-well format. Vår användning av ett silikon gummi, speciellt Polydimetylsiloxan (PDMS), snarare än den vanligen använda hydrogel polyakrylamid (PAA) gör det möjligt för oss att göra robusta och inerta substrat med obestämd hylla-liv kräver inga särskilda förvaringsförhållanden. Till skillnad från pelare-PDMS baserade metoder som har en Modulus i GPa-sortimentet, de PDMS som används här är mycket kompatibel, allt från ca 0,4 kPa till 100 kPa. Vi skapar en högpresterande plattform för TFM genom att partitionera dessa stora monolitiska substrat rumsligt i biokemiskt oberoende brunnar, vilket skapar en multi-well plattform för Traction Force screening som är kompatibel med befintliga multi-well system.
I detta manuskript använder vi detta multi-well dragkraft system för att undersöka epitelial till mesenkymala övergång (EMT); Vi inducerar EMT i NMuMG-celler genom att exponera dem för TGF-β och för att kvantifiera de biofysiska förändringarna under EMT. Vi mäter kontraktilitet som en funktion av koncentrationen och varaktigheten av TGF-β exponering. Våra fynd här visar nyttan av parallelliserade TFM i samband med sjukdomsbiofysik.

Innan tillsats av TGF-β, en konfluenta enskiktslager av celler har en kullersten som form och är tätt packad. Vid TGF-β behandling, celler blir mer långsträckt i morfologi, utvidga cellområdet och förvärva en mer mesenkymala fenotyp. Utnyttja multi-well enhet fabricerade med mjuka PDMS elastomerer, de fysikaliska egenskaperna hos celler i totalt 17 olika villkor studerades. Cellerna behandlades med fyra olika TGF-β-koncentrationer (0,5, 1, 2 och 4 ng/mL) och fyra olika inkubatio...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃŽÂ² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transi

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Vi presenterar en hög genomströmning dragkraft assay fabricerade med silikon gummi (PDMS). Denna nya analys är lämplig för att studera fysiska förändringar i cell kontraktilitet under olika biologiska och biomedicinska processer och sjukdomar. Vi visar den här metodens nytta genom att mäta en TGF-β beroende ökning i kontraktilitet under epitelial-till-mesenkymala övergången.

Hög genomströmning dragkraft mikroskopi med PDMS avslöjar dosberoende effekter omvandla tillväxtfaktor-β på epitelial-till-mesenkymala övergång

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Mitt labb är intresserad av mekanobiologi, som undersöker hur celler utövar och påverkas av mekaniska krafter. Ett sätt vi kan kvantifiera mekanobiologi är att mäta cellkontraktilitet. I vidhäftande celler manifesterar kontraktilitet i dragkraftskrafter som utövas på cellsubstratet. Vi kvantifierar dessa krafter med hjälp av en metod som i allmänhet kallas dragkraft mikroskopi eller TFM. Och TFM: s genomförs i en mängd olika metoder, men en vanlig aspekt är att det är en ganska följetong och långsam lab teknik görs vanligtvis i en enda maträtt som denna här. Detta begränsar oss till att utvärdera en population eller ett tillstånd i taget. Hela i cellkultur förbättrades för en tid sedan men att skapa multiwell rätter och vi tänkte, skulle det inte vara bra det vi kunde till TFM med samma ökade genomströmning och samma effektivitet av tid och reagenser? Och det här var vår lösning. Så vi skapade en 96 väl dragkraft kraft skålen. Och det ser mycket likt en konventionell 96 väl vävnad kultur maträtt, men med denna maträtt kan vi inte bara undersöka 96 olika villkor cellkultur, men också kvantifiera deras cell kontraktilitet. Detta presenterar en mycket högre genomströmning lösning än enkelrätt metoder, så att vi kan undersöka olika cellvillkor och kontraktil svar. Under cancer metastasering, cancerceller resa från deras primära plats till sekundära platser, sprida sjukdomen i vår kropp. Denna metastaserande beteende av cancerceller står för 90%av cancer-relaterade dödsfall. En av de föreslagna mekanismerna för epitelial cancerceller att förvärva en mer flyttande och invasiva fenotyp är epitelial-mesenchymal övergång, EMT. Under EMT blir de mer flyttande och invasiva, vilket ändrar deras fysiska beteende. För att bättre förstå dessa förändringar i fysiskt beteende, vi utnyttja vår mjuka kisel substrat för att mäta förändringar i kontraktilitet av mus bröstkörtelceller med EMT induktion av TGF-I denna studie undersökte vi hur olika koncentrationer och inkubationstiden för TGF-påverka cells'fysiskt beteende. Polydimetylsiloxan är ett mycket kompatibelt gummi med den lägsta Youngs modulus på ca 0,6 kilopascal. Styvheten i detta material också kan vara avstämbar med hjälp av olika koncentrationer av crosslink agent inklusive SYLGARD 184.To mäta mekaniska egenskaper PDMS vi använder en rheometer. Efter blandning del A och del B av PDMS, i en ett till ett viktförhållande och lägga till härdningsmedel med angiven vikt procent, lasta beredd parti på reometerplattan. Se till att lasta tillräckligt av provet för att helt täcka spindelområdet. Det är viktigt att se till att spindeln vidrör provet helt utan ledigt utrymme kvar vid dess kant. Eventuellt extraprov bör noggrant putsas och torkas av från plattan. Mät den slutliga lagringsmodulus och tidsberoendet av varje provs viskoeasticitet genom att göra tids- och frekvenssvep vid en oscillerande skjuvstam på 0,5%Newsha]Detta diagram är ett exempel på tidssupq-test, efter att ha gjort för att mäta reologiskt beteende av polydimetylsiloxan med tillämpad oscillatorisk skjuvstam på 0,5 %och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 % och temperatur på 100 %

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching Micropatterned Celler på en PDMS membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Ytpotential Mätning av bakterier Använda Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Tillverkning och implementering av en referens fri dragkrafts mikroskopi plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopi integrerat med mikrofluidik för Chemotactic kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction Force Mikroskopi till studie B lymfocyt Aktivering

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...