Name: using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants
Uploaded: 2019-07-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants at JoVE.com

1. Kultur E. coli OP50
<ol><li>1 M Natriumhydroxidlösung vorbereiten, indem 4 g Natriumhydroxid in 100 ml Wasser gelöst werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Lysogeny-Brühe (LB) Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid mit 1 L reinem Reinstwasser in einem 1 L konischen Kolben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M Natriumhydroxidlösung ein.</li>
	<li>Aliquot das LB flüssige Medium von Schritt1.2 in 20 konische Kolben (maximal zulässiges Volumen: 100 ml) mit jeweils 50 m...

<ol>
	<li>Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-dependent+stimulation+of+sodium+halide+salts+on+redox+reactants,+energy+supply+and+luminescence+in+Vibrio+fischeri.">The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri.</a> Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+nicotine+exposure+induces+dysfunction+of+mouse+endothelial+progenitor+cells.">Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells.</a> Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+effects+of+heavy+metals+on+L3+larva+of+Caenorhabditis+elegans+with+greater+behavior+and+growth+inhibitions+in+the+progeny.">Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).</li><li>Chen, R., Yu, Z., Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-generational+effects+of+lindane+on+nematode+lipid+metabolism+with+disturbances+on+insulin-like+signal+pathway.">Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway.</a> Chemosphere. 210, 607-614 (2018).</li><li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+mice+and+men:+ethical+issues+in+animal+experimentation.">A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation.</a> International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).</li><li>Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+effects+of+nickel+on+Daphnia+magna+depend+on+temperature+and+the+magnitude+of+the+effect+in+the+first+generation.">Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).</li><li>Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+trans-generational+effects+of+male+and+female+gut+microbiota+in+Drosophila+melanogaster.">Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 13, 20160966 (2017).</li><li>Coimbra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+effects+of+clofibric+acid+in+zebrafish+(Danio+rerio):+A+multigenerational+study.">Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study.</a> Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).</li><li>Sugi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+C.+elegans+and+other+nematode+species.">Genome editing in C. elegans and other nematode species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).</li><li>Leung, M. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+toxicity+to+Caenorhabditis+elegans+transferred+to+the+progeny+after+exposure+to+sulfamethoxazole+at+environmentally+relevant+concentration.">Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration.</a> Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).</li><li>Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+study+of+gold+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegans:+transgenerational+effect+of+maternal+exposure.">Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47, 5393-5399 (2013).</li><li>Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+transmission+of+environmental+information+in+C.+elegans.">Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans.</a> Science. 356, 320 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+influences+of+sulfamethoxazole+on+lifespan,+reproduction+and+population+growth+of+Caenorhabditis+elegans.">Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).</li><li>Buisset-Goussen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+gamma+irradiation:+a+multigenerational+study+using+Caenorhabditis+elegans.">Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans.</a> Radioactivity. 137, 190-197 (2014).</li><li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+exposure+to+dietary+zearalenone+(ZEA),+anestrogenic+mycotoxin,+affects+puberty+and+reproductionin+female+mice.">Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice.</a> Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).</li><li>Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+comparison+of+developmental+and+reproductive+toxicities+in+zearalenone+exposed+Caenorhabditis+elegans.">Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans.</a> Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+dlegans.">The genetics of Caenorhabditis dlegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+constancy+of+DNA+sequences+during+development+and+evolution+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).</li><li>Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+nutrient+response+system+partially+dependent+on+nuclear+receptor+NHR-49.">A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).</li><li>Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+metallothionein+expression+after+exposure+to+conventional+cigarette+smoke+but+not+electronic+cigarette+(ECIG)-generated+aerosol+in+Caenorhabditis+elegans.">Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Hill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+flexibility+in+the+convergent+evolution+of+hermaphroditism+in+Caenorhabditis+Nematodes.">Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes.</a> Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).</li><li>Breider, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+total+N-nitrosamine+concentrations+in+aqueous+samples+via+UV-photolysis+and+chemiluminescence+detection+of+nitric+oxide.">Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).</li></ol>

Um das beschriebene Protokoll erfolgreich durchführen zu können, sollten die folgenden Vorschläge berücksichtigt werden. Führen Sie die gesamten experimentellen Operationen in einer sterilen Umgebung durch. Unsachgemäße Bedienung kann zu einer Kontamination der E. coli-Stämme führen, z. B. Pilze und Milben können das normale Wachstum von C. elegans behindern und somit die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Beobachten Sie im Abschnitt, der die Kultivierung von C. elegans beschrei...

Die Anwendung und Abfallbewirtschaftung von Chemikalien hängt in hohem Maße von der Information ihrer Auswirkungen bei bestimmten Konzentrationen ab. Insbesondere ist die Zeit ein weiteres wesentliches Element zwischen Wirkungen und Konzentrationen. Das heißt, Chemikalien, insbesondere solche mit geringen Konzentrationen in den tatsächlichen Umgebungen, brauchen Zeit, um messbare Effekte zu provozieren1. Daher ordnen die Forscher unterschiedliche Längen der Expositionsdauer in Tierversuchen an und decken sogar den gesamten Lebenszyklus ab. Zum Beispiel waren Mäuse für 30, 90 oder 180 Tage Nikotin ausgesetzt, um seine toxischen Wirkungen zu untersuchen 2. Dennoch reichen solche Expositionsdauern immer noch nicht aus, um die langfristigen Auswirkungen von Schadstoffen (z. B. persistente organische Schadstoffe [POP]) aufzuklären, die über Generationen von Organismen in der Umwelt andauern können. Daher gewinnen Studien über Auswirkungen über Generationen immer mehr Aufmerksamkeit.
Es gibt zwei Hauptaspekte in Generationeneffektstudien. Die erste ist die transgenerationale (TG) Effektstudie, die robust testen kann, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern Auswirkungen auf den Nachwuchs haben kann3. Die zweite ist eine Mehrgenerationen-Effektstudie, die systematischer ist und sowohl bei der Exposition als auch bei den Resteffekten berücksichtigt wird. Einerseits werden die Multi-Generationen-Expositionseffekte (MGE) verwendet, um adaptive Reaktionen bei Tieren auf die langfristig herausfordernden Umgebungen zu veranschaulichen. Andererseits werden die Mehrgenerationen-Resteffekte (MGR) verwendet, um die langfristigen Restfolgen nach der Exposition zu demonstrieren, da die mütterliche Exposition mit einer Embryo-Exposition gegenüber den ersten Nachkommen und einer Keimbahn-Exposition gegenüber der zweiten Nachkommen, die den dritten Nachwuchs als erste Generation vollständig aus der Exposition4macht.
Obwohl Säugetiere (z. B. Mäuse) Musterorganismen in Toxizitätsstudien sind, insbesondere in Bezug auf den Menschen, ist ihre Anwendung bei der Untersuchung von Generationenwirkungen recht zeitaufwändig, teuer und ethisch in Bezug auf 5. Dementsprechend bieten Organismen wie die Krebstiere Daphnia magna6, Dasinsekt Drosophila melanogaster7 und der Zebrafisch Danio rerio8alternative Möglichkeiten. Doch diese Organismen haben entweder keine Ähnlichkeiten mit dem Menschen oder benötigen spezifische Ausrüstung in Studien.
Caenorhabditis elegans ist eine kleine freilebende Nematode (ca. 1 mm lang) mit einem kurzen Lebenszyklus (ca. 84 h bei 20 °C)9. Diese Nematode teilt viele biologische Wege konservativ für den Menschen, und daher wurde es weit verbreitet verwendet, um die Auswirkungen von verschiedenen Belastungen oder Giftstoffe zu veranschaulichen10. Insbesondere sind 99,5% der Nematoden Hermaphrodite, die diese Organismen sehr geeignet machen, um Generationeneffekte zu untersuchen, z. B. TG-Effekte von Schwermetallen und Sulfonamiden3,11, MGE-Effekte von Gold-Nanopartikeln und schweren Metalle12 und Temperatur13, MGR-Effekte von Sulfonamid14, und sowohl MGE und MGR-Effekte der Gamma-Bestrahlung15 und Lindan4. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse zwischen den Wirkungen von Chemikalien (z. B. Zearalenon) auf die Entwicklung und Fortpflanzung von Mäusen und C. elegans16,17gefunden, was einen Vorteil für die Extrapolatung Auswirkungen dieses kleinen Tieres auf den Menschen.
Sowohl TG- als auch MG-Effektstudien sind zeitaufwändig und benötigen sorgfältiges Design und Leistung. Insbesondere bestanden in den oben genannten Studien Unterschiede bei der Wahl des Lebensstadiums, den Expositionsbedingungen und den Methoden der Generationstrennung. Diese Unterschiede behinderten den direkten Vergleich der Ergebnisse und behinderten die weitere Interpretation der Ergebnisse. Daher ist es unerlässlich, einheitliche Protokolle zur Orientierung von TG- und MG-Effektstudien zu erstellen und auch ein größeres Bild zu liefern, um ähnliche Muster verschiedener Giftstoffe oder Schadstoffe in langfristigen Folgen aufzudecken. Das überzielige Ziel der vorliegenden Protokolle wird klare Arbeitsabläufe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit C. elegansdemonstrieren. Die Protokolle werden Forschern zugute kommen, die daran interessiert sind, die langfristigen Auswirkungen von Giftstoffen oder Schadstoffen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:684px;" width="684">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">&#160;agar powder</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">79nnHT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>&#160;Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">96-well sterile microplate</td>
			<td style="width:200px;">Costar&#65292;Corning&#65292;America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Autoclave sterilizer</td>
			<td style="width:200px;">Tomy, Tomy Digital Biology, Japan</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:200px;">LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">centrifuge&#160; 5417R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">cholesterol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:200px;">VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Filter</td>
			<td style="width:200px;">Thermo, Thermo Fisher Scientific, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">incubator</td>
			<td style="width:200px;">YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">inoculating loop</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">K2HPO4&#8226;3H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>16788-57-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">kraft paper</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Mcroplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Microscopes XTL-BM-9TD</td>
			<td style="width:200px;">BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Pipette</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Qiagen RNeasy kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:200px;">Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7681-52-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">tryptone</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">yeast extract</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>119-44-8</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants

Informationen über Toxizitäten von Chemikalien sind für ihre Anwendung und Abfallbewirtschaftung von wesentlicher Bedeutung. Bei Chemikalien in niedrigen Konzentrationen sind die langfristigen Auswirkungen sehr wichtig, um ihre Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit zu beurteilen. Bei der Demonstration langfristiger Einflüsse liefern die Auswirkungen von Chemikalien über Generationen hinweg in neueren Studien neue Erkenntnisse. Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über mehrere Generationen mit frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans. Zwei Aspekte werden vorgestellt: (1) trans-generationale (TG) und (2) Mehrgenerationeneffektstudien, von denen letztere durch Mehrgenerationenexposition (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR) getrennt sind. Die TG-Effektstudie ist robust mit einem einfachen Zweck, um festzustellen, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern zu Restfolgen für den Nachwuchs führen kann. Nachdem die Auswirkungen auf die Eltern gemessen wurden, werden Natriumhypochlorit-Lösungen verwendet, um die Eltern zu töten und den Nachwuchs zu halten, um die Wirkungsmessung auf den Nachwuchs zu erleichtern. Die TG-Effektstudie wird verwendet, um festzustellen, ob die Nachkommen betroffen sind, wenn ihr Elternteil den Schadstoffen ausgesetzt ist. Die MGE- und MGR-Effektstudie wird systematisch verwendet, um festzustellen, ob eine kontinuierliche Generationenexposition zu adaptiven Reaktionen bei Nachkommen über Generationen führen kann. Sorgfältige Abholung und Übertragung werden verwendet, um Generationen zu unterscheiden, um die Wirkungsmessung an jeder Generation zu erleichtern. Wir haben auch Protokolle kombiniert, um Das Bewegungsverhalten, die Fortpflanzung, die Lebensdauer, die biochemischen und Genexpressionsänderungen zu messen. Einige Beispielexperimente werden auch vorgestellt, um die trans- und mehrgenerationenischen Effektstudien zu veranschaulichen.

Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über Generationen hinweg mit C. elegans in transgenerationalen (TG), Mehrgenerationenexpositionen (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR). Als Beispiele werden unsere eigenen Forschungsergebnisse vorgestellt. Eine Studie präsentiert die TG-Effekte von Schwermetallen auf das Bewegungsverhalten3. Die beiden anderen Studien zeigen MGE- und MGR-Wirkungen von Sulfomethoxaz...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Trans- und mehrgenerationenische Wirkungen persistenter Chemikalien sind für die Beurteilung ihrer langfristigen Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit von wesentlicher Bedeutung. Wir bieten neuartige detaillierte Methoden zur Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit der freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans.

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Das vorgestellte Protokoll wird Studien über die Trans- und die Mehrgenerationenwirkung von Proteinen erleichtern, die für eine lange Zeit in der Umwelt existieren können. Wir setzten eine freilebende Nematode mit 99,5 als Hermaphrodite ein, um Zeit und Mühe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten zu sparen. Diese Technik kann verwendet werden, um die langfristigen Auswirkungen von Endmedikamenten zu demonstrieren, da das Nematode im vorliegenden Protokoll viele konservative Mechanismen oder Wege mit menschenweisenteilt.Diese Methode kann Einblicke in die Bereiche der pharmazeutischen Synthese und des Umweltmanagements geben, da sie eine Rückkopplung potenzieller Gefahren von Chemikalien benötigen. Diese Methode kann auf Daphnia magna mit mehr Fokus auf aquatische Toxizität angewendet werden. Auch Drosphila melanogaster, um den Einfluss auf das Geschlecht weiter zu erforschen.Er oder sie würde mit der Idee stecken bleiben, dass das Studium von Effekten über Generationen hinweg zeit- und energieaufwendig ist. Lassen Sie sich auf den ersten Blick nicht erschrecken. Das Folgen des Protokolls wird Ihnen ein fruchtbares Ergebnis bringen.Um E.coli zu kulturieren, Pipette 200 Mikroliter aus den bakteriellen Suspensionen in 50 Milliliter LB Medium in einem Kolben. Oder verwenden Sie eine Impfschleife, um eine kleine Kolonie aus NGM-Agars zu pflücken und sie in das LB-Medium zu legen. Um C.elegans zu kulturieren, zählen Sie unter dem Mikroskop die Nematoden auf den stapelnden NGM-Agars, die zuvor zubereitet wurden.Wenn die Zahl nahe 2.000 erreicht, verwenden Sie eine sterile Spitze, um 1/6 des NGM-Agars zu schneiden und auf neu zubereitete NGM-Agars mit bakteriellem Rasen zu übertragen. Halten Sie die NGM-Agars in einem 22 Grad Celsius Inkubator für die nachfolgende Kultur auf dem Kopf. Nach etwa 36 Stunden werden die Nematoden gravid.Verwenden Sie zwei Milliliter steriles Wasser, um die gravid Nematoden und neu produzierten Eier auf jedem NGM-Agar in sterile Zentrifugenröhrchen abzuspülen. Legen Sie die Rohre für 30 Minuten auf ein Gestell, um die Nematoden abzusetzen, und entsorgen Sie dann 85 % der Überräube durch Pipetten. Es ist sehr wichtig zu beurteilen, ob die Nematoden für die Synchronisation gravid genug sind.Andernfalls wäre die Alterssynchronisation senkfrei. Mischen Sie die Pellets mit sieben Volumina Natriumhypochloritlösung und schütteln Sie die Zentrifugenröhrchen alle zwei Minuten fünf bis acht Mal, um die Larven und erwachsenen Nematoden zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 700 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube durch Pipetten.Die Pellets in fünf Mengen sterilem Wasser wieder aufhängen, um die alterssynchronen Eier zu waschen. Zentrifuge bei 700 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Wiederholen Sie die Wäsche mit sterilem Wasser, zweimal.Als nächstes fügen Sie ein Volumen sterilen Wassers in die Schläuche ein, um die alterssynchronisierten Eier wieder aufzuhängen. Verteilen Sie die Eisuspensionen, indem Sie fünfzig Mikroliter auf jeden neuen NGM-Agar mit bakteriellem Rasen pfeifen. Halten Sie die NGM-Agars 30 Minuten lang in einem 20 Grad Celsius Inkubator auf der Oberseite, so dass das Wasser verdunstet oder vom bakteriellen Rasen absorbiert wird.Dann drehen Sie die NGM-Agars auf den Kopf, für die nachfolgende Kultur, und markieren Sie die Zeit als die Eizeit. 36 Stunden nach der Eizeit erreichen die Nematoden das L3-Larvenstadium. Verwenden Sie zwei Milliliter steriles Wasser, um die Nematoden von jedem NGM-Agar in Zentrifugenrohre zu spülen.Nach 30 Minuten Setzung 85% der Überräube durch K Medium ersetzen, um die Nahrung im Darm für zwei Stunden zu verdauen. Entsorgen Sie dann die Überräube. Verwenden Sie K Medium, um die Nematodensuspensionen für nachfolgende Experimente auf etwa 200 Nematoden pro 100 Mikroliter einzustellen.Um Kanteneffekte zu vermeiden, fügen Sie im mittleren Bereich einer 96-well sterilen Mikroplatte 100 Mikroliter vorbereiteter Kontroll- oder chemischer Lösungen in 10 Brunnen ein, wie sie in sechs Gruppen nachbilden. Fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Nematode K Medium zu jedem der 60 Brunnen hinzu. Markieren Sie die Zeit als T0. Führen Sie die Belichtung für 24 bis 96 Stunden durch.Nach der Exposition verwenden Sie eine Pipette, um Nematoden aus fünf Brunnen in jeder Gruppe in sechs 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren zu sammeln. Die Nematoden für 30 Minuten begleichen und dann Pipette, um die Überräube zu entsorgen. Waschen Sie die Nematoden am Boden mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser.Die Nematoden 30 Minuten lang begleichen. Entsorgen Sie die Überräube, und verwenden Sie die Nematoden unten für Indikatormessungen der exponierten übergeordneten Generation, die als F0 markiert ist. Sammeln Sie die Nematoden aus den verbleibenden fünf Brunnen in jeder Gruppe. Die Nematoden wie bisher absetzen und waschen.Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter steriles Wasser hinzu, um die Nematoden in jedem Rohr wieder aufzuhängen, und übertragen Sie die Nematodensuspensionen gleichmäßig auf drei neu zubereitete NGM-Agars mit bakteriellem Rasen. Inkubieren Sie die Nematoden für 36 Stunden, um gravid zu werden, und führen Sie alterssynchrone, wie zuvor. Nachdem Sie die synchronisierten Eier 36 Stunden lang auf NGM-Agars mit bakteriellem Rasen brüten, spülen Sie die Nematoden in sechs Zentrifugenröhren.Nachdem Sie sich mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser absetzen und waschen, verwenden Sie die Nematoden unten für Indikatormessungen der als T1 markierten Nachkommengeneration. Mischen Sie 99 Milliliter der warmen NGM Agars mit einem Milliliter Kontroll- oder chemischer Lösungen. Nach der Zubereitung der Agars mit Bakteriensuspensionen nach dem Manuskript, im Bio-Sicherheitsschrank, legen Sie die oberen Deckel der Petrischalen beiseite und setzen Sie den bakteriellen Rasen für 15 Minuten UV-Licht aus. Pipette die alterssynchronisierten Eier auf die UV-behandelten Agars.Markieren Sie den Beginn der Exposition gegenüber der übergeordneten Generation, F0, als Tag Null. Die Agars drei Tage lang bei 20 Grad Celsius bebrüten. Verwenden Sie dann die ausgereiften Nematoden, um Effekte in F0 zu messen. Verwenden Sie auch am dritten Tag eine Glasstange, die mit einem künstlichen Faserdraht ausgestattet ist, der in einen Ring gebogen ist, um F0-Reifennematoden zu pflücken und auf die Oberfläche neuer UV-behandelter NGM-Agars zu gleiten.Holen Sie sich am vierten Tag die reifen F0-Nematoden von NGM-Agars heraus und entsorgen Sie sie. Verwenden Sie am sechsten Tag die reifen F1-Nematoden, die drei Tage lang ausgesetzt waren, für die Indexmessung. In diesem Protokoll zeigten die transgenerationalen Wirkungen von Cadmium, Kupfer, Blei und Zink auf die Körperbiegefrequenz, dass die Hemmungen im Nematodenelternteil F0 nach pränataler Exposition geringer waren als bei ihrer Nachkommenschaft T1. Die mehrgenerationenlichen Restwirkungen von Sulfamethoxazol auf die Nematodenlebensdauer und Fortpflanzung zeigten, dass die Fortpflanzung bei der Exposition gegenüber Keimlinien signifikant beeinflusst wurde und die Toxizitäten in nicht exponierten Generationen von T3 bis T6-Generationen fortbestehen.Die mehrgenerationenliche Exposition und die mehrgenerationenübergreifenden Restwirkungen von Lindan auf die biochemischen und genetischen Nematodenindizes zeigten obessogene Wirkungen mit Störungen in der Insulinsignalregulation. Darüber hinaus zeigten die Veränderungen zwischen sgk-1 und akt-1 Signalisierung, dass Nematoden aus verschiedenen Expositionsgenerationen unterschiedliche Reaktionsstrategien für Toleranz und Vermeidung aufwiesen. Überprüfen Sie den Lebendensstatus der Nematoden vor jedem Vorgang, und ändern Sie die folgenden Schritte entsprechend.Andere Effekte, z. B. obessogene Wirkungen von Chemikalien, können einbezogen werden, um die zunehmende Prävalenz von Adipositas über Generationen weiter zu beantworten. Basierend auf der Methode können weitere Mechanismen erforscht werden. Zum Beispiel die vererbbaren epigenetischen Signale zwischen den Generationen.Die Chlorlösungen haben starke oxidative Potenziale und vermeiden den direkten Kontakt der Haut mit ihr.

Research

JoVE Journal

Environment

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Technik zur Untersuchung Gliederfüßer und Mikrobielle Gemeinschaften im Baum Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Forschung

Umwelt

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Ein CO<sub&gt; 2</sub&gt; Konzentration Gradient Facility for Testing CO<sub&gt; 2</sub&gt; Enrichment und Boden Auswirkungen auf Grünland-Ökosystemen Funktion

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Ein Durchflussbelichtungssystem für die Bewertung Schwebstoffe Auswirkungen auf Leben im Wasser

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protokoll für die Beurteilung der relativen Auswirkungen von Umwelt und Genetik auf Geweih und Körperwachstum für eine langlebige Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Ein experimentelles Protokoll für die Untersuchung von mineralischen Auswirkungen auf organische hydrothermalen Transformationen

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...