Name: using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants
Uploaded: 2019-07-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants at JoVE.com

1. Cultura E. coli OP50
<ol><li>Preparare la soluzione di idrossido di sodio da 1 M sciogliendo 4 g di idrossido di sodio in acqua di 100 mL.</li>
	<li>Preparare il brodo di lisogenità (LB) medio sciogliendo 10 g di tripone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio con 1 L di acqua ultrapura in una fiaschetta conica 1 L. Regolare il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio da 1 M.</li>
	<li>Aliquota del supporto liquido LB da passo 1.2 a 20 flaconi conici (volume massimo consentito: 100 m...

<ol>
	<li>Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-dependent+stimulation+of+sodium+halide+salts+on+redox+reactants,+energy+supply+and+luminescence+in+Vibrio+fischeri.">The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri.</a> Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+nicotine+exposure+induces+dysfunction+of+mouse+endothelial+progenitor+cells.">Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells.</a> Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+effects+of+heavy+metals+on+L3+larva+of+Caenorhabditis+elegans+with+greater+behavior+and+growth+inhibitions+in+the+progeny.">Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).</li><li>Chen, R., Yu, Z., Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-generational+effects+of+lindane+on+nematode+lipid+metabolism+with+disturbances+on+insulin-like+signal+pathway.">Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway.</a> Chemosphere. 210, 607-614 (2018).</li><li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+mice+and+men:+ethical+issues+in+animal+experimentation.">A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation.</a> International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).</li><li>Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+effects+of+nickel+on+Daphnia+magna+depend+on+temperature+and+the+magnitude+of+the+effect+in+the+first+generation.">Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).</li><li>Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+trans-generational+effects+of+male+and+female+gut+microbiota+in+Drosophila+melanogaster.">Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 13, 20160966 (2017).</li><li>Coimbra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+effects+of+clofibric+acid+in+zebrafish+(Danio+rerio):+A+multigenerational+study.">Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study.</a> Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).</li><li>Sugi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+C.+elegans+and+other+nematode+species.">Genome editing in C. elegans and other nematode species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).</li><li>Leung, M. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+toxicity+to+Caenorhabditis+elegans+transferred+to+the+progeny+after+exposure+to+sulfamethoxazole+at+environmentally+relevant+concentration.">Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration.</a> Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).</li><li>Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+study+of+gold+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegans:+transgenerational+effect+of+maternal+exposure.">Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47, 5393-5399 (2013).</li><li>Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+transmission+of+environmental+information+in+C.+elegans.">Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans.</a> Science. 356, 320 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+influences+of+sulfamethoxazole+on+lifespan,+reproduction+and+population+growth+of+Caenorhabditis+elegans.">Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).</li><li>Buisset-Goussen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+gamma+irradiation:+a+multigenerational+study+using+Caenorhabditis+elegans.">Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans.</a> Radioactivity. 137, 190-197 (2014).</li><li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+exposure+to+dietary+zearalenone+(ZEA),+anestrogenic+mycotoxin,+affects+puberty+and+reproductionin+female+mice.">Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice.</a> Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).</li><li>Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+comparison+of+developmental+and+reproductive+toxicities+in+zearalenone+exposed+Caenorhabditis+elegans.">Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans.</a> Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+dlegans.">The genetics of Caenorhabditis dlegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+constancy+of+DNA+sequences+during+development+and+evolution+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).</li><li>Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+nutrient+response+system+partially+dependent+on+nuclear+receptor+NHR-49.">A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).</li><li>Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+metallothionein+expression+after+exposure+to+conventional+cigarette+smoke+but+not+electronic+cigarette+(ECIG)-generated+aerosol+in+Caenorhabditis+elegans.">Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Hill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+flexibility+in+the+convergent+evolution+of+hermaphroditism+in+Caenorhabditis+Nematodes.">Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes.</a> Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).</li><li>Breider, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+total+N-nitrosamine+concentrations+in+aqueous+samples+via+UV-photolysis+and+chemiluminescence+detection+of+nitric+oxide.">Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).</li></ol>

Al fine di condurre con successo il protocollo descritto, dovrebbero essere presi in considerazione i seguenti suggerimenti. Eseguire le operazioni sperimentali complessive in un ambiente sterile. Un'operazione impropria può provocare la contaminazione dei ceppi di E. coli, ad esempio, funghi e acari può ostacolare la normale crescita di C. elegans e quindi influenzare i risultati sperimentali. Nella sezione che descrive la coltivazione C. elegans, osservare la scala di crescita di C. ele...

L'applicazione e la gestione dei rifiuti di sostanze chimiche dipende fortemente dalle informazioni dei loro effetti a determinate concentrazioni. In particolare, il tempo è un altro elemento essenziale tra effetti e concentrazioni. Vale a dire, le sostanze chimiche, soprattutto quelle a basse concentrazioni negli ambienti reali, hanno bisogno di tempo per provocare effetti misurabili1. Pertanto, i ricercatori organizzano diverse lunghezze della durata dell'esposizione negli esperimenti sugli animali e coprono anche l'intero ciclo di vita. Ad esempio, i topi sono stati esposti alla nicotina per 30, 90 o 180 giorni per studiare i suoi effetti tossici 2. Tuttavia, tali durate di esposizione non sono ancora sufficienti a chiarire gli effetti a lungo termine degli inquinanti (ad esempio, inquinanti organici persistenti [POP]) che possono durare su generazioni di organismi nell'ambiente. Pertanto, gli studi sugli effetti nel corso delle generazioni stanno guadagnando sempre più attenzione.
Ci sono due aspetti principali negli studi di effetti generazionali. Il primo è lo studio dell'effetto transgenerazionale (TG) che può verificare in modo robusto se l'esposizione chimica ai genitori può comportare conseguenze sulla prole3. Il secondo è uno studio multigenerazionale degli effetti che è più sistematico con considerazioni sia in esposizione che in quelli residui. Da un lato, gli effetti dell'esposizione multigenerazionale (MGE) vengono utilizzati per illustrare le risposte adattive negli animali agli ambienti difficili a lungo termine. D'altra parte, gli effetti residui multigenerazionali (MGR) sono utilizzati per dimostrare le conseguenze residue a lungo termine dopo l'esposizione, poiché l'esposizione materna è accompagnata da esposizione embrionale alla prima prole e all'esposizione germinale alla seconda prole che rende la terza prole come la prima generazione completamente fuori esposizione4.
Anche se i mammiferi (ad es. topi) sono organismi modello negli studi di tossicità soprattutto in relazione agli esseri umani, la loro applicazione nello studio degli effetti generazionali è piuttosto dispendiosa in termini di tempo, costosa ed eticamente relativa 5 . Di conseguenza, gli organismi tra cui il crostaceo Daphnia magna6, gli insetti Drosophila melanogaster7 e il pesce zebra Danio rerio8, forniscono scelte alternative. Tuttavia, questi organismi o mancano di somiglianze con gli esseri umani, o richiedono attrezzature specifiche negli studi.
Caenorhabditis elegans è un piccolo nematode free-living (circa 1 mm di lunghezza) con un breve ciclo di vita (circa 84 h a 20 gradi centigradi)9. Questo nematode condivide molti percorsi biologici conservatori con gli esseri umani, e quindi è stato ampiamente impiegato per illustrare gli effetti di varie sollecitazioni o tossici10. In particolare, il 99,5% dei nematodi sono ermafroditi che rendono questi organismi estremamente adatti nello studio degli effetti generazionali, ad esempio gli effetti TG di metalli pesanti e solfati33,11, effetti MGE di nanoparticelle d'oro e pesanti metalli12 e temperatura13, effetti MGR della solfonamide14, e gli effetti MGE e MGR di irradiazione gamma15 e lindane4. Inoltre, sono stati riscontrati risultati comparabili tra gli effetti delle sostanze chimiche (ad esempio zearalenone) sullo sviluppo e la riproduzione di topi e C. elegans16,17, che fornirebbero un vantaggio per estrapolare effetti da questo piccolo animale agli esseri umani.
Entrambi gli studi sugli effetti TG e MG richiedono molto tempo e richiedono un'attenta progettazione e prestazioni. In particolare, esistevano differenze nelle scelte della fase di vita, nelle condizioni di esposizione e nei metodi di separazione della generazione negli studi summenzionati. Tali differenze hanno ostacolato il confronto diretto tra i risultati e ostacolato un'ulteriore interpretazione dei risultati. Pertanto, è imperativo stabilire protocolli uniformi per guidare gli studi sugli effetti TG e MG, e anche fornire un quadro più ampio per rivelare modelli simili di vari sostanze tossiche o inquinanti in conseguenze a lungo termine. L'obiettivo superiore dei protocolli attuali dimostrerà chiari processi operativi nello studio degli effetti trans e multigenerazionali con C. elegans. I protocolli andranno a beneficio dei ricercatori interessati a studiare gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche o inquinanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:684px;" width="684">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">&#160;agar powder</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">79nnHT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>&#160;Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">96-well sterile microplate</td>
			<td style="width:200px;">Costar&#65292;Corning&#65292;America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Autoclave sterilizer</td>
			<td style="width:200px;">Tomy, Tomy Digital Biology, Japan</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:200px;">LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">centrifuge&#160; 5417R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">cholesterol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:200px;">VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Filter</td>
			<td style="width:200px;">Thermo, Thermo Fisher Scientific, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">incubator</td>
			<td style="width:200px;">YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">inoculating loop</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">K2HPO4&#8226;3H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>16788-57-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">kraft paper</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Mcroplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Microscopes XTL-BM-9TD</td>
			<td style="width:200px;">BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Pipette</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Qiagen RNeasy kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:200px;">Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7681-52-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">tryptone</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">yeast extract</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>119-44-8</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants

Le informazioni sulle tossicità delle sostanze chimiche sono essenziali nella loro applicazione e nella gestione dei rifiuti. Per le sostanze chimiche a basse concentrazioni, gli effetti a lungo termine sono molto importanti nel giudicarne le conseguenze nell'ambiente e sulla salute umana. Nel dimostrare influenze a lungo termine, gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni negli studi recenti forniscono nuove informazioni. Qui, descriviamo protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche su più generazioni utilizzando nematode Caenorhabditis elegansfree-living . Sono presentati due aspetti: (1) studi di effetti transgenerazionali (TG) e (2) di effetti multigenerazionali, quest'ultimo dei quali è separato da studi di esposizione multigenerazionale (MGE) e residuio multigenerazionale (MGR). Lo studio sugli effetti TG è robusto con un semplice scopo per determinare se l'esposizione chimica ai genitori può provocare conseguenze residue sulla prole. Dopo che gli effetti sono misurati sui genitori, le soluzioni di ipoclorito di sodio vengono utilizzate per uccidere i genitori e mantenere la prole in modo da facilitare la misurazione degli effetti sulla prole. Lo studio sugli effetti TG viene utilizzato per determinare se la prole è interessata quando il genitore è esposto agli inquinanti. Lo studio degli effetti MGE e MGR viene utilizzato sistematicamente per determinare se l'esposizione generazionale continua può provocare risposte adattative nella prole nel corso delle generazioni. Un attento pick-up e trasferimento sono utilizzati per distinguere le generazioni per facilitare la misurazione degli effetti su ogni generazione. Abbiamo anche combinato protocolli per misurare il comportamento di locomozione, la riproduzione, la durata della vita, i cambiamenti biochimici e dell'espressione genica. Alcuni esperimenti di esempio sono presentati anche per illustrare gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali.

Qui, descriviamo i protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni utilizzando C. elegans negli studi di esposizione trans-generazionale (TG), esposizione multigenerazionale (MGE) e residui multigenerazionale (MGR). I nostri risultati di ricerca sono presentati come esempi. Uno studio presenta gli effetti TG dei metalli pesanti sul comportamento di locomozione3. Gli altri due studi presentano gli effetti MGE e MGR di...

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Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Gli effetti trans e multigenerazionali delle sostanze chimiche persistenti sono essenziali per giudicare le loro conseguenze a lungo termine nell'ambiente e sulla salute umana. Forniamo nuovi metodi dettagliati per studiare gli effetti trans e multigenerazionali utilizzando il nematode free-living Caenorhabditis elegans.

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Il protocollo presentato faciliterà gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali delle proteine che possono esistere a lungo nell'ambiente. Abbiamo utilizzato un nematode free-living con 99.5 come ermafroditi per risparmiare tempo e fatica nello studio degli effetti trans e multigenerazionali. Questa tecnica può essere utilizzata per dimostrare gli impatti a lungo termine dei farmaci finali perché il nematode nel presente protocollo condivide molti meccanismi o percorsi conservativi con l'uomo.Questo metodo può fornire informazioni sui campi della sintesi farmaceutica e della gestione ambientale perché hanno bisogno di feedback sui potenziali rischi delle sostanze chimiche. Questo metodo può essere applicato alla Daphnia magna con maggiore attenzione alla tossicità acquatica. Anche Drosphila melanogaster per esplorare ulteriormente l'influenza sul genere.Sarebbe bloccato dall'idea che studiare gli effetti nel corso delle generazioni richiede tempo ed energia. Non aver paura alla prima impressione. Seguire il protocollo ti farà guadagnare un risultato fruttuoso.Per coltura E.coli, pipetta 200 microlitri dalle sospensioni batteriche in 50 millilitri di mezzo LB in un pallone. Oppure usa un anello inoculante per scegliere una piccola colonia dagli agar NGM e posizionarla nel mezzo LB. Per la coltura C.elegans, al microscopio, contare i nematodi sugli agar NGM impilanti preparati in precedenza.Quando il numero raggiunge quasi 2.000, utilizzare una punta sterile per tagliare 1/6 dell'agar NGM e trasferirlo su agar NGM appena preparati con prato batterico. Tieni gli agar NGM a testa in giù in un incubatore di 22 gradi Celsius per la cultura successiva. Dopo circa 36 ore, i nematodi diventano gravidi.Utilizzare due millilitri di acqua sterile per scaricare i nematodi gravidi e le uova di nuova produzione su ciascun agar NGM in tubi di centrifuga sterili. Posizionare i tubi su un rack per 30 minuti per depositare i nematodi, quindi scartare l'85% dei supernatanti pipettando. È molto importante giudicare se i nematodi sono abbastanza gravidi per la sincronizzazione.In caso contrario, l'operazione di sincronizzazione dell'età sarebbe vana. Mescolare i pellet con sette volumi di soluzione di ipoclorito di sodio e agitare i tubi della centrifuga ogni due minuti per cinque-otto volte per lelyse le larve e i nematodi adulti. Centrifugare i tubi a 700 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius e quindi scartare i supernatanti pipettando.Sospendere di nuovo i pellet in cinque volumi di acqua sterile per lavare le uova sincronizzate con l'età. Centrifuga a 700 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius. Ripetere il lavaggio con acqua sterile, due volte.Quindi, aggiungere un volume di acqua sterile nei tubi per sospendere le uova sincronizzate con l'età. Distribuire le sospensioni delle uova pipettando cinquanta micro litri su ogni nuovo agar NGM con prato batterico. Tenere gli agar NGM dall'alto in un incubatore di 20 gradi Celsius per 30 minuti, consentendo all'acqua di evaporare o essere assorbita dal prato batterico.Quindi, gira gli agar NGM, a testa in giù, per la cultura successiva, e segna il tempo come il tempo delle uova. 36 ore dopo il tempo delle uova, i nematodi raggiungono lo stadio delle larve L3. Utilizzare due millilitri di acqua sterile per scaricare i nematodi da ogni agar NGM in tubi di centrifuga.Dopo essersi sistemato per 30 minuti, sostituire l'85% dei supernatanti con K Medium per digerire il cibo nelle viscere per due ore. Quindi, scarta i supernatanti. Utilizzare K Medium per regolare le sospensioni del nematode a circa 200 nematodi per 100 microlitri per esperimenti successivi.Per evitare effetti sui bordi, nella zona centrale di una micropiatta sterile da 96 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzioni di controllo preparate o chimiche in 10 pozzi, come si replica in sei gruppi. Aggiungere 100 microlitri del nematode preparato K Medium a ciascuno dei 60 pozzi. Contrassegnare l'ora come T0. Eseguire l'esposizione per 24-96 ore.Dopo l'esposizione, utilizzare una pipetta per raccogliere i nematodi da cinque pozzi in ogni gruppo, in sei tubi di centrifuga da 1,5 millilitri. Depositare i nematodi per 30 minuti e quindi pipettare per scartare i supernatanti. Lavare i nematodi sul fondo con un millilitro di acqua sterilizzata.Sistemare i nematodi per 30 minuti. Scartare i supernatanti e utilizzare i nematodi nella parte inferiore per le misurazioni degli indicatori della generazione padre esposta, contrassegnati come F0. Raccogli i nematodi dai restanti cinque pozzi in ogni gruppo. Sistemare e lavare i nematodi come in precedenza.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di acqua sterile per sospendere di nuovo i nematodi in ogni tubo e trasferire le sospensioni nematode uniformemente su tre agar NGM appena preparati con prato batterico. Incubare i nematodi per 36 ore per gravidi ed eseguire la sincronizzazione dell'età, come in precedenza. Dopo aver incubato le uova sincronizzate sugli agar NGM con prato batterico per 36 ore, sciacquare i nematodi in sei tubi di centrifuga.Dopo la sedimentazione e il lavaggio con un millilitro di acqua sterilizzata, utilizzare i nematodi nella parte inferiore per misurazioni indicatori della generazione di prole contrassegnate come T1. Mescolare 99 millilitri degli agar NGM caldi con un millilitro di controllo o soluzioni chimiche. Dopo aver preparato gli agar con sospensioni batteriche secondo il manoscritto, nell'armadio di biosicurezza, mettere da parte i coperchi superiori delle piastre di Petri ed esporre il prato batterico alla luce UV per 15 minuti. Pipettare le uova sincronizzate con l'età sugli agar trattati con UV.Contrassegnare l'inizio dell'esposizione alla generazione padre, F0, come giorno zero. Incubare gli agar per tre giorni a 20 gradi Celsius. Quindi, utilizzare i nematodi maturi per misurare gli effetti in F0. Inoltre, il terzo giorno, utilizzare un'asta di vetro dotata di un filo di fibra prodotto dall'uomo piegato in un anello per raccogliere nematodi maturi F0 e scivolare sulla superficie di nuovi agar NGM trattati con UV.Il quarto giorno, scegli e scarta i nematodi F0 maturi dagli agar NGM. Il sesto giorno, utilizzare i nematodi maturi F1 che hanno sperimentato l'esposizione per tre giorni per la misurazione degli indici. In questo protocollo, gli effetti transgenerazionali di cadmio, rame, piombo e zinco sulla frequenza di piegatura del corpo hanno mostrato che le inibizioni nel genitore nematode, F0, dopo l'esposizione prenatale erano inferiori a quelle della loro progenie, T1. Gli effetti residui multigenerazionali del sulfamethoxazolo sulla durata e sulla riproduzione del nematode hanno mostrato che la riproduzione è stata significativamente influenzata dall'esposizione alla linea germinale e le tossicità sono persistete nelle generazioni non esposte dalle generazioni T3 a T6.L'esposizione multigenerazionale e gli effetti residui multigenerazionali del lindano sugli indici biochimici e genetici del nematode hanno mostrato effetti obesogenici con disturbi nella regolazione del segnale di insulina. Inoltre, i cambiamenti tra la segnalazione sgk-1 e akt-1 indicavano che i nematodi di diverse generazioni di esposizione mostravano diverse strategie di risposta per la tolleranza e l'evitamento. Controllare lo stato di vita dei nematodi prima di ogni operazione e modificare di conseguenza i seguenti passaggi.Altri effetti, ad esempio gli effetti obesogenici delle sostanze chimiche, possono essere inclusi per rispondere ulteriormente alla crescente prevalenza dell'obesità nel corso delle generazioni. Sulla base del metodo, è possibile esplorare ulteriori meccanismi. Ad esempio, i segnali epigenetici ereditari tra generazioni.Le soluzioni di cloro hanno forti potenzialità ossidanti ed evitano il contatto diretto della pelle ad esso.

Research

JoVE Journal

Environment

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Tecnica per lo Studio artropodi e comunità microbiche all&#39;interno Albero tessuti

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Ricerca

Ambiente

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; Gradiente di concentrazione strumento per il test di CO<sub&gt; 2</sub&gt; Arricchimento e del suolo Effetti sulla Prateria Ecosistema Funzione

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Un sistema di esposizione di flusso-through per valutare sospeso Sedimenti Effetti sulla vita acquatica

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protocollo per la valutazione degli effetti relativi di ambiente e genetica sulla Antler e la crescita del corpo per un cervide longevo

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Un protocollo sperimentale per lo studio di minerali effetti sulle trasformazioni organiche idrotermale

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...