Name: using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants
Uploaded: 2019-07-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants at JoVE.com

1. cultura E. coli OP50
<ol><li>Prepare 1 M de solução de hidróxido de sódio dissolvendo 4 g de hidróxido de sódio em 100 mL de água.</li>
	<li>Prepare o meio de caldo de lisogenia (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio com 1 L de água ultrapura em um balão cônico de 1 L. Ajuste o pH para 7,0 com solução de hidróxido de sódio a 1 M.</li>
	<li>Aliquot o meio líquido LB da etapa 1.2 em 20 frascos cônicos (volume máximo admissível: 100 mL) com m...

<ol>
	<li>Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-dependent+stimulation+of+sodium+halide+salts+on+redox+reactants,+energy+supply+and+luminescence+in+Vibrio+fischeri.">The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri.</a> Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+nicotine+exposure+induces+dysfunction+of+mouse+endothelial+progenitor+cells.">Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells.</a> Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+effects+of+heavy+metals+on+L3+larva+of+Caenorhabditis+elegans+with+greater+behavior+and+growth+inhibitions+in+the+progeny.">Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).</li><li>Chen, R., Yu, Z., Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-generational+effects+of+lindane+on+nematode+lipid+metabolism+with+disturbances+on+insulin-like+signal+pathway.">Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway.</a> Chemosphere. 210, 607-614 (2018).</li><li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+mice+and+men:+ethical+issues+in+animal+experimentation.">A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation.</a> International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).</li><li>Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+effects+of+nickel+on+Daphnia+magna+depend+on+temperature+and+the+magnitude+of+the+effect+in+the+first+generation.">Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).</li><li>Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+trans-generational+effects+of+male+and+female+gut+microbiota+in+Drosophila+melanogaster.">Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 13, 20160966 (2017).</li><li>Coimbra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+effects+of+clofibric+acid+in+zebrafish+(Danio+rerio):+A+multigenerational+study.">Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study.</a> Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).</li><li>Sugi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+C.+elegans+and+other+nematode+species.">Genome editing in C. elegans and other nematode species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).</li><li>Leung, M. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+toxicity+to+Caenorhabditis+elegans+transferred+to+the+progeny+after+exposure+to+sulfamethoxazole+at+environmentally+relevant+concentration.">Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration.</a> Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).</li><li>Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+study+of+gold+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegans:+transgenerational+effect+of+maternal+exposure.">Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47, 5393-5399 (2013).</li><li>Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+transmission+of+environmental+information+in+C.+elegans.">Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans.</a> Science. 356, 320 (2017).</li><li>Yu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+influences+of+sulfamethoxazole+on+lifespan,+reproduction+and+population+growth+of+Caenorhabditis+elegans.">Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).</li><li>Buisset-Goussen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+gamma+irradiation:+a+multigenerational+study+using+Caenorhabditis+elegans.">Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans.</a> Radioactivity. 137, 190-197 (2014).</li><li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigenerational+exposure+to+dietary+zearalenone+(ZEA),+anestrogenic+mycotoxin,+affects+puberty+and+reproductionin+female+mice.">Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice.</a> Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).</li><li>Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+comparison+of+developmental+and+reproductive+toxicities+in+zearalenone+exposed+Caenorhabditis+elegans.">Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans.</a> Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+dlegans.">The genetics of Caenorhabditis dlegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+constancy+of+DNA+sequences+during+development+and+evolution+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).</li><li>Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+nutrient+response+system+partially+dependent+on+nuclear+receptor+NHR-49.">A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).</li><li>Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+metallothionein+expression+after+exposure+to+conventional+cigarette+smoke+but+not+electronic+cigarette+(ECIG)-generated+aerosol+in+Caenorhabditis+elegans.">Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Hill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+flexibility+in+the+convergent+evolution+of+hermaphroditism+in+Caenorhabditis+Nematodes.">Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes.</a> Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).</li><li>Breider, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+total+N-nitrosamine+concentrations+in+aqueous+samples+via+UV-photolysis+and+chemiluminescence+detection+of+nitric+oxide.">Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).</li></ol>

A fim conduzir com sucesso o protocolo descrito, as seguintes sugestões devem ser levadas em consideração. Realize as operações experimentais gerais em um ambiente estéril. A operação inadequada pode resultar na contaminação das cepas de e. coli , por exemplo, fungos e ácaros podem dificultar o crescimento normal de C. elegans e, portanto, afetam os resultados experimentais. Na seção que descreve cultivar c. elegans, Observe a escala de crescimento de c. elegans sobre o ng...

A aplicação e gestão de resíduos de produtos químicos é altamente dependente da informação dos seus efeitos em determinadas concentrações. Notavelmente, o tempo é outro elemento essencial entre efeitos e concentrações. Ou seja, produtos químicos, especialmente aqueles em baixas concentrações nos ambientes reais, precisam de tempo para provocar efeitos mensuráveis1. Portanto, os pesquisadores organizam diferentes comprimentos da duração da exposição em experimentos com animais, e até mesmo cobrem todo o ciclo de vida. Por exemplo, camundongos foram expostos à nicotina por 30, 90 ou 180 dias para estudar seus efeitos tóxicos 2. No entanto, tais durações de exposição ainda não são suficientes para elucidar os efeitos a longo prazo dos poluentes (por exemplo, poluentes orgânicos persistentes [POPs]) que podem durar mais de gerações de organismos no ambiente. Portanto, estudos sobre os efeitos sobre as gerações estão ganhando mais e mais atenção.
Existem dois aspectos principais nos estudos de efeito geracional. O primeiro é o estudo de efeito trans-geracional (TG) que pode testar de forma robusta se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências na descendência3. O segundo é um estudo de efeito multigeracional que é mais sistemático com considerações tanto na exposição quanto nos efeitos residuais. Por um lado, os efeitos da exposição multigeracional (MGE) são usados para ilustrar as respostas adaptativas nos animais aos ambientes desafiadores de longo prazo. Por outro lado, os efeitos residuais multigeracionais (MGR) são utilizados para demonstrar as consequências residuais a longo prazo após a exposição, uma vez que a exposição materna é acompanhada com exposição embrionária à primeira prole e exposição da linha germinal à segunda descendência que torna a terceira descendência como a primeira geração completamente fora da exposição4.
Embora os mamíferos (por exemplo, camundongos) sejam organismos modelo em estudos de toxicidade, especialmente em relação aos seres humanos, sua aplicação no estudo de efeitos geracionais é bastante demorada, cara e eticamente a respeito de 5. Assim, os organismos, incluindo o crustásio Daphnia magna6, o inseto Drosophila melanogaster7 e o zebrafish Danio rerio8, proporcionam opções alternativas. No entanto, esses organismos ou falta de semelhanças com os seres humanos, ou necessitam de equipamentos específicos em estudos.
A Caenorhabditis elegans é um pequeno nematódeo de vida livre (aproximadamente 1 mm de comprimento) com um ciclo de duração curto (aproximadamente 84 h a 20 ° c)9. Este nematódeo compartilha muitas vias biológicas conservadoras para os seres humanos, e, portanto, tem sido amplamente empregado para ilustrar os efeitos de várias tensões ou tóxicos10. Notavelmente, 99,5% dos nematoides são hermafroditas, tornando esses organismos extremamente adequados para o estudo de efeitos geracionais, por exemplo, efeitos de TG de metais pesados e sulfonamidas3,11, efeitos de MGE de nanopartículas de ouro e pesados metais12 e temperatura13, Mgr efeitos da sulfonamida14, e ambos os efeitos MGE e Mgr da irradiação gama15 e lindano4. Além disso, foram encontrados resultados comparáveis entre os efeitos dos produtos químicos (por exemplo, zearalenona) no desenvolvimento e reprodução de camundongos e C. elegans16,17, o que proporcionaria uma vantagem para extrapolar efeitos deste pequeno animal para os seres humanos.
Ambos os estudos de efeito TG e MG são demorados e precisam de um design cuidadoso e desempenho. Notavelmente, existiam diferenças nas escolhas de estágio de vida, condições de exposição e métodos de separação de gerações nos estudos supracitados. Tais diferenças dificultaram a comparação direta entre os resultados e dificultaram a interpretação dos resultados. Portanto, é imperativo estabelecer protocolos uniformes para orientar os estudos de efeitos de TG e MG, e também para fornecer um quadro maior para revelar padrões semelhantes de vários tóxicos ou poluentes em conseqüências a longo prazo. O objetivo mais longo dos protocolos atuais demonstrará processos claros de operação no estudo de efeitos trans e multigeracionais com C. elegans. Os protocolos beneficiarão os pesquisadores que estão interessados em estudar os efeitos a longo prazo de tóxicos ou poluentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:684px;" width="684">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">&#160;agar powder</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">79nnHT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>&#160;Applied Biosystems&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">96-well sterile microplate</td>
			<td style="width:200px;">Costar&#65292;Corning&#65292;America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Autoclave sterilizer</td>
			<td style="width:200px;">Tomy, Tomy Digital Biology, Japan</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:200px;">LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">centrifuge&#160; 5417R</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:200px;">Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">cholesterol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:200px;">VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Filter</td>
			<td style="width:200px;">Thermo, Thermo Fisher Scientific, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">incubator</td>
			<td style="width:200px;">YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">inoculating loop</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">K2HPO4&#8226;3H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>16788-57-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">kraft paper</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Mcroplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Microscopes XTL-BM-9TD</td>
			<td style="width:200px;">BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">Pipette</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Qiagen RNeasy kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen Inc., Valencia, CA, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:191px;">RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:200px;">Sinopharm chemical reagent company Ltd, China</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;">sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:200px;">Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China</td>
			<td style="width:123px;">7681-52-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">tryptone</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">yeast extract</td>
			<td style="width:200px;">OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>119-44-8</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans for studying trans- and multi-generational effects of toxicants

Informações sobre toxicidades de produtos químicos são essenciais na sua aplicação e gestão de resíduos. Para os produtos químicos em baixas concentrações, os efeitos a longo prazo são muito importantes para julgar as suas consequências no ambiente e na saúde humana. Ao demonstrar influências de longo prazo, os efeitos dos produtos químicos ao longo das gerações em estudos recentes fornecem novas percepções. Aqui, nós descrevemos protocolos para estudar efeitos dos produtos químicos sobre gerações múltiplas usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida. Dois aspectos são apresentados: (1) estudos de efeito trans-geracional (TG) e (2) multigeracional, sendo este último separado para estudos de exposição multigeracional (MGE) e de efeito multigeracional residual (MGR). O estudo do efeito TG é robusto com um objetivo simples de determinar se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências residuais na descendência. Após os efeitos são medidos sobre os pais, soluções de hipoclorito de sódio são usados para matar os pais e manter a prole de modo a facilitar a medição de efeito sobre a prole. O estudo do efeito TG é usado para determinar se a prole é afetada quando seu pai é exposto aos poluentes. O estudo do efeito MGE e MGR é sistematical usado para determinar se a exposição geracional contínua pode resultar em respostas adaptativas na prole ao longo das gerações. O pick-up e a transferência cuidadosos são usados para distinguir gerações para facilitar a medida do efeito em cada geração. Nós igualmente combinamos protocolos para medir mudanças do comportamento da locomoção, da reprodução, do tempo, as bioquímicas e da expressão genética. Alguns exemplos de experimentos também são apresentados para ilustrar os estudos de efeito trans e multigeracional.

Aqui, nós descrevemos protocolos para estudar efeitos de produtos químicos ao longo de gerações usando C. elegans em trans-geracional (TG), exposição multigeracional (MGE) e multigeracional residual (MGR) estudos de efeito. Nossos próprios resultados de pesquisa são apresentados como exemplos. Um estudo apresenta os efeitos do TG de metais pesados no comportamento da locomoção3. Os outros dois estudos apresentam efeitos de MGE e MGR de sulfometox...

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Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

Os efeitos trans e multigeracionais dos produtos químicos persistentes são essenciais para julgar as suas consequências a longo prazo no ambiente e na saúde humana. Nós fornecemos métodos detalhados novos para estudar efeitos trans e multi-Generational usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida.

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

O protocolo apresentado facilitará estudos sobre os efeitos trans e multigeracionais de proteínas que podem existir por muito tempo no meio ambiente. Empregamos um nematoide de vida livre com 99,5 como hermafroditas para economizar tempo e esforço no estudo de efeitos trans e multigeracionais. Essa técnica pode ser usada para demonstrar os impactos a longo prazo das drogas finais porque o nematoide no presente protocolo compartilha muitos mecanismos ou caminhos conservadores com os seres humanos.Este método pode fornecer insights sobre os campos da síntese farmacêutica e do manejo ambiental, pois eles precisam de feedback dos potenciais perigos dos produtos químicos. Este método pode ser aplicado à Daphnia magna com mais foco na toxicidade aquática. Também Drosphila melanogaster para explorar ainda mais a influência sobre o gênero.Ele ou ela ficaria preso à ideia de que estudar efeitos ao longo de gerações é o tempo e o consumo de energia. Não se assuste com a primeira impressão. Seguir o protocolo lhe dará um resultado frutífero.Para a cultura E.coli, pipetas 200 microliters das suspensões bacterianas em 50 mililitros de meio LB em um frasco. Ou use um laço inoculante para escolher uma pequena colônia de ágars NGM e colocá-lo no meio LB. Para cultivar C.elegans, sob um microscópio, conte os nematoides nos ágares ngm empilhados preparados anteriormente.Quando o número chegar perto de 2.000, use uma ponta estéril para cortar 1/6 do ágar NGM e transferi-lo para ágars NGM recém-preparados com gramado bacteriano. Mantenha os ágars NGM de cabeça para baixo em uma incubadora Celsius de 22 graus para a cultura subsequente. Depois de cerca de 36 horas, os nematoides ficam gravid.Use dois mililitros de água estéril para eliminar os nematoides gravid e ovos recém-produzidos em cada ágar NGM em tubos de centrífuga estéreis. Coloque os tubos em um rack por 30 minutos para acalmar os nematoides e, em seguida, descarte 85% dos supernantes por pipetação. É muito importante julgar se os nematoides são gravid o suficiente para sincronização.Caso contrário, a operação de sincronização etária seria em vão. Misture as pelotas com sete volumes de solução de hipoclorito de sódio e agite os tubos centrífugas a cada dois minutos por cinco a oito vezes para lise as larvas e nematoides adultos. Centrifugar os tubos a 700 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius e, em seguida, descartar os supernacantes por pipetação.Suspenda as pelotas em cinco volumes de água estéril para lavar os ovos sincronizados por idade. Centrífuga a 700 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius. Repita a lavagem por água estéril, duas vezes.Em seguida, adicione um volume de água estéril nos tubos para suspender re suspendida os ovos sincronizados por idade. Distribua as suspensões dos ovos pipetando 50 micro litros em cada novo ágar de NGM com gramado bacteriano. Mantenha os ágars ngm do lado superior em uma incubadora de 20 graus Celsius por 30 minutos, permitindo que a água evapore ou seja absorvida pelo gramado bacteriano.Em seguida, vire os ágars ngm, de cabeça para baixo, para a cultura subsequente, e marque o tempo como o tempo do ovo. 36 horas após o tempo do ovo, os nematoides chegam ao estágio das larvas L3. Use dois mililitros de água estéril para tirar os nematoides de cada ágar NGM em tubos centrífugas.Depois de se contentar por 30 minutos, substitua 85% dos supernacantes por K Medium para digerir o alimento nas entranhas por duas horas. Então, descarte os supernantes. Use o K Medium para ajustar as suspensões do nematoide a cerca de 200 nematoides por 100 microliters para experimentos subsequentes.Para evitar efeitos de borda, na área média de uma microplacão estéril de 96 poços, adicione 100 microlitros de controle preparado ou soluções químicas em 10 poços, como replica em seis grupos. Adicione 100 microliters do nematode K Médio preparado a cada um dos 60 poços. Marque o tempo como T0. Realizar a exposição por 24 a 96 horas.Após a exposição, use uma pipeta para coletar nematoides de cinco poços em cada grupo, em seis tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Resolva os nematoides por 30 minutos e depois pipeta para descartar os supernantes. Lave os nematoides na parte inferior com um mililitro de água esterilizada.Resolva os nematoides por 30 minutos. Descarte os supernantes e use os nematoides na parte inferior para medir indicadores da geração pai exposta, marcado como F0. Recolhe os nematoides dos cinco poços restantes em cada grupo. Acomode e lave os nematoides como antes.Em seguida, adicione 100 microliters de água estéril para suspender os nematoides em cada tubo, e transfira as suspensões de nematoides uniformemente para três ágaros NGM recém-preparados com gramado bacteriano. Incubar os nematoides por 36 horas para se tornar gravid, e realizar a sincronização etária, como anteriormente. Depois de incubar os ovos sincronizados em ágars NGM com gramado bacteriano por 36 horas, lave os nematoides em seis tubos de centrífuga.Após a fixação e lavagem com um mililitro de água esterilizada, use os nematoides na parte inferior para medir indicadores da geração da prole marcada como T1. Misture 99 mililitros dos ágares ngm quentes com um mililitro de controle ou soluções químicas. Depois de preparar os ágars com suspensões de bactérias de acordo com o manuscrito, no armário de biosegurança, reserve as tampas superiores das placas de petri e exponha o gramado bacteriano à luz UV por 15 minutos. Pipeta os ovos sincronizados com idade nos ágares tratados com UV.Marque o início da exposição à geração dos pais, F0, como o dia zero. Incubar os ágars por três dias a 20 graus Celsius. Em seguida, use os nematoides maduros para medir efeitos em F0. Além disso, no terceiro dia, use uma haste de vidro equipada com um fio de fibra feito pelo homem dobrado em um anel para escolher nematoides maduros F0, e deslize para a superfície de novos ágars NGM tratados com UV.No quarto dia, escolha e descarte os nematoides F0 maduros dos ágars ngm. No sexto dia, use os nematoides maduros da F1 que experimentaram exposição por três dias para medição de índices. Neste protocolo, os efeitos transgeracionais de cádmio, cobre, chumbo e zinco na frequência de dobra corporal mostraram que as inibições no pai do nematodo, F0, após a exposição pré-natal foram menores do que em sua prole, T1. Os efeitos residuais multigeracionais do sulfametoxonazol na vida útil e reprodução do nematoides mostraram que a reprodução foi significativamente afetada na exposição da linha germinal, e as toxicidades persistiram em gerações não expostas das gerações T3 a T6.A exposição multigeracional e os efeitos residuais multigeracionais de lindane nos índices bioquímicos e genéticos do nematodo mostraram efeitos obesogênicos com distúrbios na regulação do sinal de insulina. Além disso, as mudanças entre a sinalização sgk-1 e akt-1 indicaram que nematoides de diferentes gerações de exposição mostraram diferentes estratégias de resposta para tolerância e evasão. Verifique o estado de vida dos nematoides antes de cada operação e modifique as seguintes etapas em conformidade.Outros efeitos, por exemplo, efeitos obesogênicos de produtos químicos, podem ser incluídos para responder ainda mais à crescente prevalência de obesidade ao longo das gerações. Com base no método, outros mecanismos podem ser explorados. Por exemplo, os sinais epigenéticos herdáveis entre gerações.As soluções de cloro têm fortes potenciais oxidativos, e evitam o contato direto da pele com ele.

Research

JoVE Journal

Environment

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Técnica de Estudos de Artrópodes e comunidades microbianas dentro Árvore Tecidos

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Ambiente

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; Facility Concentração Gradiente para Teste CO<sub&gt; 2</sub&gt; Enriquecimento do solo e efeitos sobre a função da pastagem de Ecossistemas

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Análise de LC-MS de Plaquetas Humanas como Plataforma para Estudar o Metabolismo Mitocôndrial

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Um Sistema de Exposição Fluxo através de sedimentação de Efeitos Avaliando suspensos sobre a vida aquática

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protocolo para avaliar os efeitos relativos do ambiente e da genética na galhada e no crescimento corporal de um cervídeo de vida longa

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Um protocolo Experimental para estudar efeitos Mineral sobre transformações hidrotermais orgânicos

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...