Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة-انجي بوغ غرانت 1 P50 CA121974 (r. Edelson, m. Girardi); المعاهد القومية للسرطان مركز الدعم منحه 3 P30 CA16359-28S1 (r. Edelson, m. Girardi); زمالة التدريب الخاصة بمعهد هوارد هيوز الطبي (ا. فاسيل) ؛ ومؤسسه القلب NY (r. Edelson, ا. فينتورا, ا. فاسيلي, h. Ezaldein). وقدم الدعم الجزئي من قبل R01 CA196660 إلى m. Bosenberg.
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للدكتور روبرت تيغيلار علي الإرشاد والتوجيه والبصيرة التجريبية. ونشكر زملائنا في Fraunhofer IBMT ، ولا سيما الدكتور ثورستن نول ، علي تطوير وتوفير غرفه TI المكافئة لECP. نيكولاس ثيوسوكيس ساعد بلطف مع المراحل الاوليه من تجارب YUMM. نشكر المتبرعين بالدم المتطوعين ، انغر كريستنسن وموظفيها المحترفين في مركز العلاج الخاص بجامعه ييل للمساعدة في شراء الدم التطوعي. الدكتور ويندل يارسبره والدكتورة ناتاليا Issaeva بالتكرم مشتركه معنا SCC61 و SCC61/7 خطوط الخلايا. للحصول علي المساعدة التقنية في المشروع ، نشكر الدكتورة جوليا لويس للمشورة بروتوكول FACS ، و e. Menet ، g. Tokmoulina ، c. كوت في جامعه ييل FACS الاساسيه. تم الحصول علي صور الفيلم من الخلايا داخل لوحه TI بمساعده فيليكس ريفيرا مولينا ، دكتوراه ، قسم بيولوجيا الخلية ومركز التصوير السينمائي ييل ، كليه ييل للطب. وأشرف علي إنتاج الأفلام اندرو اوسبورن ، كبير منتجي الفيديو ، مكتب الاتصالات ، كليه ييل للطب.

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

جامعه ييل تمتلك براءات الاختراع المستمدة من بحوث الخلايا الجذعية البروفيسور ريتشارد ادلسون التي تم ترخيصها لشركه ييل البدء ، Transimmune AG. ريتشارد ادلسون ومايكل جيراردي مستشارين علميين ل Transimmune AG, في حين أولغا Sobolev هو موظف Transimmune AG. Transimmune AG ليس لديها اي منتجات تجاريه الحالية ، ولكن علي أساس تعاوني فانه ينتج لوحات Transimmune المستخدمة في هذه المقالة. ومن الممكن ان يستفيد هؤلاء المؤلفون الثلاثة من الاستغلال التجاري لهذه الاكتشافات في المستقبل.

ويسمح الجهاز المصغر والبروتوكول الموصوف أعلاه للمرة الاولي باجراء تحقيقات مختبريه فعاله لليات ECP في النظم التجريبية للماوس ، وفي عينات الدم البشرية الصغيرة. هذا هو تقدم كبير; علي سبيل المثال ، فانه يسمح لنا لإثبات للمرة الاولي فعاليه transimmunization ضد الأورام الصلبة في نموذج الماوس 11، وفتح امكانيه المستقبل لتطبيق مماثل في الأورام البشرية.
قبل تطوير الجهاز والطريقة الموصوفة هنا ، كان من المستحيل التحقيق بشكل كامل في جميع جوانب ECP. في نماذج الماوس ، علي الرغم من ان 8-ممسحة ويمكن تكرار جانب من جوانب العلاج إلى حد ما عن طريق علاج الخلايا في صحن بيتري12،20، لم يكن هناك قدره علي الاندماج في طريقه الممر لوحه ، والتي ثبت ان توفير التفاعلات الصفائح الدموية الحيوية التي تكتسي اهميه حاسمه لتنشيط العاصمة الفسيولوجية ECP14. في الدراسات البشرية ، بدلا من ذلك ، كان عنصر التدفق موجودا بالبالكامل ، ولكن القدرة علي الكشف الانتقائي للمكونات الخلوية المحددة إلى 8-ممسحةA، أو لحمايتهم منه ، كانت مفقوده21،22. وقد حال ذلك دون الفهم الكامل لليه ECP ، والتحسين الأمثل للحصانة أو التسامح. الاضافه إلى ذلك ، كميه الدم المطلوبة للعمل مع جهاز ECP السريرية كبيره ، مما يعوق التحقيق العلمي. يسمح جهاز ECP المصغر والبروتوكول الموصوف هنا لأول مره بالنمذجة الفعالة والمرنة بالبالكامل والقابلة للتوقد لمختبر ECP. الاضافه إلى ذلك ، لوحه TI يسمح للرؤية في الوقت الحقيقي ورصد التفاعلات الخلية داخل اللوحة عن طريق المجهر.
لنجاح البروتوكول باستخدام كل من في الجسم الحيوي وأنظمه الجسم السابق ، فمن المهم ان المعالجة PBMC تحتوي علي الخلايا الاحاديه التي يمكن تفعيلها في DCs الوظيفية. لهذا التنشيط للمضي قدما ، فمن الضروري أيضا لضمان الجزء PBMC يحتوي علي عدد فيزيولوجي من صحية ، الصفائح الدموية activatable ، وان يتم اتباع بروتوكول المرور لوحه TI عن كثب. من أجل توجيه DCs المنشطة حديثا نحو التفاعل المحدد ، يجب توفيرها مع مستضد. وقد وجدنا ان الطريقة الأكثر كفاءه للتسليم مستضد لمكافحه السرطان المناعة هو بين عشيه وضحيها المشتركة الحاضنة لل DCs المنشطة حديثا مع الخلايا السرطانية التي تحتويعليمستضد 8-ممسحة المكشوفة. هذا لديه ميزه اضافيه من كونها قادره علي خلق استجابه مناعية لمكافحه السرطان دون التي تستلزم معرفه مسبقه من المستضدات الورم ، من خلال السماح لل DCs لتحديدها. ومع ذلك ، في الحالات التي يكون فيها مستضد معروف ، كان لدينا بعض النجاح في أنظمه الجسم السابق عند استخدام الببتيدات الحرة كمولدات في الحاضنة المشتركة. للتطبيقات المناعية ، يجب حماية DCs نفسها من 8-ممسحةA التعرض. وأخيرا ، في التجارب المجرية ، من المهم العمل مع نموذج الحيوانية التي هي قادره علي المناعة المضادة للورم. تعمل ترانسسيميموشن عن طريق إنشاء DCs النشطة المحددة ، والتي تعمل في الجسم لبدء الاستجابات المناعية الفطرية والمتكيفة. ضعف النشاط أو عدم وجود خلايا ناغورني كاراباخ ، أو CD8 T في الماوس المعالج سيؤثر علي فعاليه البروتوكول5،11.
في حين ان البروتوكول الموصوف هنا هو دليل علي مبدا واحد الذي تم الأمثل لنموذج الفئران الصلبة الورم المتزامن ، فانه يكشف مع ذلك العديد من الفرص. يتم توضيح أليات ECP في علم الأورام فقط ، ولا يزال هناك الكثير من المجال لتحسين الفهم. وعلي نطاق أوسع ، فان القدرة علي توليد الماوس المنشطة فسيولوجيا والإنسان DCs ، وتوجيهها بشكل انتقائي نحو مناعة محدده مستضد لديها العديد من التطبيقات المحتملة وراء السرطان. القدرة علي القيام بنفس الشيء ، ولكن بدلا من ذلك توجيه الوحدات النامية نحو التسامح مستضد محدده ، كما هو مقترح من قبل فعاليه التحمل من ECP نفسها ، ولها أيضا اثار طبية واسعه النطاق. مع هذه الطريقة ، ونحن نامل في توفير الاداات وفتح وسيله منتجه للبحوث لأي شخص لديه مصلحه في العلاجات الفيزيائية العاصمة.

العلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) هو العلاج المناعي المعمول به علي نطاق واسع في المراكز الجامعية في جميع انحاء العالم. وقد تم استخدامه من قبل الانتقائية فريدة من نوعها ، والسلامة ، وفعالية ثنائيه الاتجاه من العلاج ECP ، والصفات التي تشارك ECP مع الجهاز المناعي الفسيولوجي نفسها التي يبدو ان شريك. يقوم ECP بشكل انتقائي بتحصين الخلايا الخبيثة في الغدد الليمفاوية للخلايا التائية (ctcl)1،2، والتحمل الانتقائي للمستضدات المستهدفة في الزرع ، والمناعة الذاتية ، وإعدادات مرض الكسب غير الصالح للمضيف (gvhd) 3 , يتم تسليط الضوء علي 4.the والاستمناع من ECP من قبل الاعتماد علي مقصوره الخلية CD8 T سليمه في ctcl5، في حين تنعكس خصوصية من قبل ECP الشخصية رد فعل سلبي مواتيه جدا ، مع عدم وجود قمع المناعي خارج الهدف في زرع أو إعدادات GvHD ، وليس زيادة قابليه العدوى الانتهازية في CTCL ، حيث غير المسببة للامراض T الخلايا المستنسخة يمكن ان تضيع جنبا إلى جنب مع الخلايا الخبيثة T.
النظر إلى الاهميه السريرية لECP ، فان الأمل في ان يؤدي فهم أفضل للياته إلى توسيع نطاق العلاج العلاجي لهذا الهدف إلى طيف أوسع من السرطانات والاضطرابات المناعية قد حفز الاهتمام الدولي. وأجريت حلقتا عمل بشان الجزاءات علي الصعيد الوطني ، هما الندوة السادسة للدولة المعنية بالعلوم الصحية التابعة لمعاهد الصحة ، والمؤتمر السابع للجمعية الامريكيه من أجل التوصل إلى توافق في الآراء ، بهدف التعجيل ب تحديد المساهمين الخلويين الرئيسيين في التاثيرات المضادة للسرطان والتحمل في ECP.
وحتى الآن ، وعلي الرغم من كثرة التقارير المنشورة التي تحاول معالجه اليه العملية ، فان عقبتين رئيسيتين أعاقت التقدم العلمي. أولا ، كان التحقيق في أليات ECP في اعداد المختبر التجريبي محدودا بسبب نقص جهاز ECP المصغر الذي يعكس تماما تاثيرات ECP الخلوية والمجرية ، ويكون قابلا للتطبيق علي النماذج الحيوانية. ثانيا ، تم تقييد التحليل المختبري المتعمق لعينات ECP في البيئة السريرية بالتوافر المحدود للخلايا المناعية للمرضي المجهزة بواسطة ECP ، والتي تتطلب الوصول إلى مراكز العلاج ، وتخضع بالاضافه إلى ذلك لتوقيت ضخ المريض ، والحاجة الاخلاقيه لمجموعات غير القابلة للخطر من الكريات البيضاء التي غرسها المريض.
ولحل العقبات التي تعرقل تقدم البحوث المتعلقة بعمليه التعاون الموسع ، وضعنا لتطوير جهاز مصغر لECP من شانه ان يحاكي بشكل وثيق العناصر الرئيسية للعلاج. العلاج القياسي ECP ينطوي علي مرور الكريات البيضاء المخصب المريض من خلال 1 مم-سميكه ، الاشعه فوق البنفسجية ضوء (UVA)-شفافة ، لوحه من البلاستيك6،8. في لوحه ، وتتعرض الكريات البيضاء إلى 8-methoxypsoralen (8-ممسحة) ، وهو عامل الصور المنشطة التي علي التعرض للاشعه فوق البنفسجية تحولت بشكل عابر إلى نموذج رد الفعل (8-ممسحةا) ، قادره علي الصليب الحمض النووي عبر ربط لها ربط التكافؤ إلى قواعد بيريميداين علي الأخت الحمض النووي فروع9،10. يتم جمع الكريات البيضاء المعالجة ، 8-ممسحة وإرجاعها عن الوريد للمريض.
منذ ECP نفسه هو العلاج ثنائي الاتجاه ، وتحصين في السرطان والتسامح في زرع ، المناعة الذاتية وإعدادات GvHD ، للتوضيح قمنا بتسميه نموذج التمنيع ECP في وضع "transimmunization" ، ووضع التحمل "transtاوليزيشن". وركزنا أولا علي طريقه التركيز العابر. لدينا مؤخرا المصغرة تحجيم الماوس إلى الرجل ECP الجهاز ، وغرفه النقل (TI) أو لوحه ، والبروتوكول المقابل ، وأعاده إنتاج كل من الآثار الخلوية والمجرية من الجهاز البشري ECP في اعداد السرطان11.
من أجل جعل transimmunization في نموذج الجسم الصناعي كما ذات الصلة سريريا قدر الإمكان ، بدانا العلاج المناعي بعد جلد حقن الفئران المتزامنة الأورام أصبح واضحا ، التالي اختبار فعاليه البروتوكول في السرطان المعمول بها. المثل إلى ECP في CTCL ، فان البروتوكول الذي يثبت المبدا للتنقيط في نموذج YUMM 1.7 من الميلانوما يستخدم خلايا كريات الدم الاحاديه الطرفية (PBMC) من الماشية الحاملة للورم. يتم تمرير الخلايا من خلال لوحه TI تحت التدفق. في حين ان 8 -mop علاج الخلايا في غرفه مصغره من الممكن ، فمن الأفضل لاجراء ذلك بشكل منفصل ، للتاكد من ان نوع الخلية المطلوب فقط يتعرض لل 8-mopا. وتشير الدراسات السابقة إلى ان التاثير المحتمل لECP هو توسط من قبل 8-MOP المصابة مستضد-تقديم الخلايا12، في حين ان تاثير التحصين يتطلب 8-ممسحة أصابه الخلايا السرطانية المستهدفة11. في ال [ترنسسمبموايشن] بروتوكول اما الورم خلايا, أو ال [ايمون سل], يستطيع كنت بشكل انتقائي كشفت إلى [8-MOP][ا ] بما ان يحتاج. منذ تعظيم الوقت من الاتصال بين 8-ممسحة الخلايا السرطانية المصابة والخلايا الجذعية الناجمة عن ECP (DC) وقد ثبت ان يعزز إلى حد كبير قدره العلاج المناعي لل ecp السريرية13، ونحن أدرجت بين عشيه وضحيها المشاركة في حضانة خطوه في بروتوكول لدينا. بعد الحضانة بين عشيه وضحيها ، يتم إرجاع الخلايا المعالجة إلى الحيوانية الحاملة للورم.
هذا النظام يقلل بشكل موثوق نمو الورم وبدات المناعة المضادة للورم محدده في الفئران مع الأورام التركيبية الراسخة11، وسمح لنا لتشريح اليه السريرية لمكافحه الورم فعاليه المضادة للورم. في العديد من الدراسات وقد أظهرنا ان يتم البدء في الحصانة ECP من خلال تفعيل الصفائح الدموية السابقة في لوحه TI14,15. الصفائح الدموية المنشطة في وقت لاحق اشاره إلى نضوج الخلية الاحاديه إلى الجذعية14، مما يؤدي إلى إنتاج DCs الفسيولوجية. الخلايا النامية المشتقة حديثا هي قادره علي العرضية مستضدات المستوعبة من 8-MOP الأورام التالفة لتنشيط الاستجابات الخلية T الخاصة antigen16. وكما اقترح سابقا12،17، ومع ذلك، فان 8-MOP الاضرار الناجمة عن الناشئة DCs أنفسهم يمكن ان المضادة أو حتى عكس تاثير المضادة للورم11، وتوفير وصله ميكانيكيه للتسامح ECP.
كما تم استخدام لوحه TI لإنتاج DCs المنشطة فسيولوجيا من PBMC البشرية. المثل للدراسات الماوس ، وتعتمد DCs الإنسان المستمدة من لوحه المرور في وجود الصفائح الدموية لجيلهم ، وتظهر متطابقة ظاهريا لهذه المنتجة في لوحه ECP السريرية ، وقادره علي معالجه بكفاءة عبر تقديم مستضدات الورم البشري لتنشيط خلايا T البشرية11,16.
في الكشف عن اليه العلاج المناعي ECP ، ولذلك فقد كشفنا عن طريقه لتوليد بسرعة الفئران الفسيولوجية والخلايا البشرية الجذعية من خصوصية مستضد المطلوب ، التي يمكن التضمين وظيفيا. الجهاز TI مبتكره والبروتوكول لها اهميه كبيره محتمله في مجالات البحث والعلاج ECP والسرطان المناعي أكثر علي نطاق أوسع ، وفي اي مجال آخر مع الاهتمام في الفسيولوجية ، والخلايا الوظيفية الجذعية في اما المناعية أو طريقه التسامح. ونامل ان يوفر هذا المنشور الاداات اللازمة لمن لهم اهتمام بمجالات البحث هذه.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

العلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) هو العلاج المناعي السرطان المستخدمة علي نطاق واسع لخلايا الغدد الليمفاوية الجلدية T (CTCL) ، المنطوق في أكثر من 350 المراكز الجامعية في جميع انحاء العالم. وفي حين ان الفعالية السريرية لهذا الصندوق والصورة المثالية للسلامة قد دفعت إلى استخدامه علي نطاق واسع ، فان توضيح أليات الاساسيه ظل يشكل تحديا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نموذج لمختبر ECP. للتغلب علي هذه العقبة وإنشاء منصة بسيطه سهله الاستخدام للبحوث ECP ، قمنا بتطوير نسخه خفضت إلى أسفل من السريرية ECP الكريات البيضاء تجهيز الجهاز ، ومناسبه للعمل مع كل من نماذج الماوس ، وعينات الدم البشري الصغيرة. ويسمي هذا الجهاز الغرفة (TI) Transimmunization ، أو لوحه. في سلسله من التجارب التاريخية ، تم استخدام الجهاز المصغر لإنتاج لقاح خلوي الذي بدا بانتظام المناعة العلاجية المضادة للسرطان في عده نماذج ورم الفئران المتزامنة. عن طريق أزاله العوامل الفردية من النظام التجريبي والتحقق من مساهمتها في الجسم المضاد للورم الاستجابة ، ثم قمنا بتوضيح المحركات الميكانيكية الرئيسية من القدرة المناعية ECP. بشكل جماعي ، كشفت نتائجنا ان الآثار المضادة للورم من ECP هي التي بداتها الخلايا الجذعية (DC) ، التي تولد من الناحية الفسيولوجية من خلال التفاعل الكريات الدم مع الصفائح الدموية في لوحه TI ، ومحمله مستضدات من الخلايا السرطانية التي خليه ابوتوتيك يتم معايره الموت بدقه عن طريق التعرض للحمض النووي photoactivatable الصليب--ربط وكيل 8-methoxypsoralen والضوء UVA (8-ممسحةA). عندما عاد إلى الماوس ، وهذا اللقاح الخلوي يؤدي إلى مناعة الخلية المضادة للورم محدده وقابله للتحويل. تحققنا من ان غرفه TI هي أيضا مناسبه لمعالجه الدم البشري ، وإنتاج الإنسان DCs قابله للمقارنة تماما في حاله التنشيط والملف الشخصي لتلك المستمدة من غرفه ECP السريرية. وتهدف البروتوكولات المعروضة هنا للدراسات ECP في الماوس والرجل ، والجيل الذي تسيطر عليه من خلايا الورم ابوتوتيك مع 8-ممسحةا، والإنتاج السريع للإنسان الفسيولوجي والماوس وحدات التحكم الذاتي المشتقة من الخلية لمجموعه متنوعة من التطبيقات.

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

وقد تم تطوير الجهاز أو لوحه والبروتوكولات ذات الصلة (TI) لتكرار السمات الرئيسية للعلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) ، في بيئة تجريبية ، مما يسمح لإنتاج المنشطة فسيولوجيا ، الشجيري خلايا (DCs) للعلاج المناعي للسرطان.

بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

الخلايا الفسيولوجية المضجرة التي تقدم المستضد، والتي يطلق عليها PhDC، هي مفاتيح رئيسية مناعية تبدأ مناعة الخلية T الخاصة باستينية وتسامح. تحدد هذه الورقة طريقة فعالة لإنتاج PhDC. يتم إعاقة الاستخدام السريري للخلايا التشجر بواسطة طرق السيتوكين غير الفسيولوجية المستخدمة لإنتاجها.طريقتنا يتغلب على هذه المشكلة عن طريق كفاءة الصفائح الدموية إشارة من تحويل أحادية إلى العاصمة في البشر والفئران. هذه PhDC لا تعتمد على ظروف السيتوكين غير متوفرة في الجسم الحي، حتى يتمكنوا من توليد استجابات قوية السريرية المضادة للورم T الخلية في كل من البشر والفئران مع السرطانات المنشأة. الأنواع مستقلة بدء الصفائح الدموية من أحادية إلى PhDC النضج له تطبيق تجريبي واسع النطاق.PhDC تسمح تشريح فسيولوجيا الخلايا التشجرية، وتسهيل التعريفي من مناعة العلاجية المضادة للسرطان لسرطانات المناعة المناعية، وتقديم وعد للتطعيم المضادة للميكروبات شخصية. هذا النظام التجريبي هو رواية، وجوانب متعددة من ذلك مثل طلاء غرفة من البلاستيك، وعلاج الخلايا السرطانية مع 8-MOP/UVA، وظروف التدفق، والافراج عن monocytes هي أفضل ممثلة بصريا. (إثبات العملية ستكون (إيف روبنسون، تقني من مختبريلجمع خلايا أحادية النوى الدم الطرفية، قم أولاً بإعداد أنبوب 15 ملليلتر مع أربعة ملليلترات من عزل الخلايا الليمفاوية المتوسطة لكل خمسة إلى 10 فئران نزفت. ثم طبقة ببطء الدم التي تم جمعها من الفئران الحاملة للورم على رأس المتوسطة. قم ب تدوير الخلايا في 1, 000 إلى 1, 500-G لمدة 20 دقيقة لفصل PBMCs من خلايا الدم الحمراء.في نهاية الطرد المركزي، وجمع طبقة البلازما العليا، وترك 0.5 ملليلتر المتبقية فوق معطف بافي، وتخزينها في أربع درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. المقبل، وجمع طبقة معطف بافي في أنبوب نظيفة 15 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني إلى 15 ملليلتر، وتدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي موحد لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع PBMC. في نهاية الطرد المركزي، ماصة بعناية قبالة السوبر ونفض الغبار الأنبوب لإعادة تعليق بيليه.ثم إضافة ملليلترين من ACK الدم الحمراء خلية تحلل العازلة إلى أنبوب لإزالة أي خلايا الدم الحمراء المتبقية من PBMC. احتضان PBMC على الجليد لمدة 10 دقائق. ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني إلى 15 ملليلتر، وتدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي موحد لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع PBMC.ماصة بعناية قبالة الماغن ونفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه. Resuspend بيليه في 300 microliters من FBS. لإعداد خلايا الورم YUMM1.7 لكل مجموعة العلاج، أول resuspend بيليه الخلايا السرطانية في FBS في 2.5 مليون خلية لكل 300 ميكرولترات.مع أضواء غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة قبالة, إضافة 8-ميثوكسيبسورالين لتركيز النهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر إلى تعليق الخلايا الورم يوم 1.7. بعد ذلك، اخلط الخلايا، لف حاوية الخلية في احباط، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لمعطف ما قبل لوحة ثقافة الأنسجة 12-جيدا، إضافة ملليلتر واحد من FBS إلى بئر واحد لكل مجموعة العلاج من خمسة فئران، وتبريد لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.بعد 20 دقيقة، تحت غطاء لثقافة الأنسجة، وإزالة FBS من الآبار، وإضافة 300 ميكرولترات من الخلايا السرطانية التي تتعرض للميثوكسيبسورالين في بئر. ثم يعرض لوحة تحتوي على خلية للأشعة فوق البنفسجية قبل تسخين مصدر الضوء للإشعاع الكلي من أربعة جول لكل سنتيمتر مربع. لجمع 8-methoxypsoralen / UVA- علاج الخلايا السرطانية من كل بئر, دوامة لوحة وماصة بعناية لضمان استعادة الخلايا كاملة.لتنفيذ مرور لوحة transimmunization لكل مجموعة العلاج من خمسة فئران، والجمع بين 300 ميكرولترات من PBMC المناسبة و 300 ميكرولترات من الخلايا السرطانية 8-ميثوكسيpsoralen/UVA المعالجة في أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر وخلط الخلايا. المقبل، وفتح المشابك أنابيب المدخل والخروج من لوحة TI. استخدام حقنة 10 ملليلتر لملء أنابيب TI مع FBS، وإغلاق المشابك كما يتم تعبئة الأنابيب للاحتفاظ FBS داخل الأنابيب.افصلي الحقنة ضع طرف P1000 ماصة بشكل آمن في كمية لوحة TI. عقد لوحة في زاوية 45 درجة وملء لوحة ببطء مع PBMC ومزيج الخلايا السرطانية، وتجنب فقاعات.إزالة طرف ماصة من المداهمة قبل الإفراج عن المكبس الماص. إرجاع الخلايا المتبقية إلى أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر. احتضان الأنابيب المملوءة بـ FBS ، ولوح TI المملوء بالخلايا ، وأنبوب المخروطية 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على الخلايا المتبقية في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، والإفراج عن المشابك وإفراغ أنابيب TI عن طريق الجاذبية. ثم إدراج طرف P1000 ماصة مع المكبس الاكتئاب في ميناء لوحة لإزالة الخلايا من لوحة TI. عقد لوحة في زاوية 45 درجة وملء تلميح P1000 ماصة.وضع الخلايا مرة أخرى في الأصلي 1.5 ملليلتر أنبوب مخروطي. لتشغيل لوحة TI، قم بتوصيل أنبوب الخروج باللوحة، وتأمين لوحة TI في نظام تشغيل اللوحة. بعد ذلك ، باستخدام حقنة ذات ملليلتر واحد ، قم برسم 600 ميكرولترات من PBMC ومزيج الخلايا السرطانية من الأنبوب المخروطي 1.5 ملليلتر.إرفاق حقنة إلى أنبوب المدخل مع المشبك مفتوحة، وملء ببطء حتى السوائل تصل إلى نهاية الأنابيب. نعلق على نهاية حرة من أنبوب مدخل إلى لوحة TI ومواصلة بلطف تحميل وحدة التخزين المتبقية. إغلاق المشبك المدخل عند الانتهاء.فصل حقنة مليلتر واحد وتوصيل أنابيب المدخل بمضخة الحقنة. تأمين أنابيب الخروج إلى أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر نظيفة لجمع الخلايا. ضبط معدل تدفق مضخة حقنة إلى 0.09 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.إمالة لوحة TI حوالي 30 درجة نحو الجانب مضخة حقنة باستخدام منصة تشغيل TI لوحة. الإفراج بعناية المشبك على أنابيب المدخل. بدء ضخ حقنة، ومراقبة بعناية كيف يملأ لوحة TI.بمجرد ملء لوحة TI تمامًا ، قم بإمالةها إلى 30 درجة تقريبًا في الاتجاه المعاكس أثناء إفراغها. عندما تكون جميع الخلايا في السائل في أنبوب جمع مخروطي 1.5 ملليلتر ، أوقف المضخة. لغسل لوحة TI، افصل أنابيب المدخل من مضخة الحقنة، وربطها بحقنة ذات ملليلتر واحدة مليئة بـ 600 ميكرولتر من FBS.تعبئة حتى يتم تحميل FBS بالكامل. ثم افصل الحقنة واربط الأنابيب بمضخة الحقنة. ضبط معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 0.49 ملليلتر في الدقيقة.إطلاق المشبك المدخل، وتشغيل لوحة TI، وجمع الغسيل في نفس أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر. نفض الغبار أو اضغط على لوحة TI بلطف طوال الوقت للمساعدة في فصل و eluting أي الخلايا المتصونة كما يفرغ لوحة. افصل أنبوب مخروطي 1.5 ملليلتر من إعداد لوحة TI.تدور أنبوب جمع في microfuge benchtop في 250 مرات - G لمدة ثماني دقائق وتجاهل supernatant. لأداء بين عشية وضحاها الحضانة المشتركة من PBMC مع مستضد, أول resuspend PBMC وcedc cell بيليه في مليلترين من 15٪ 15٪ autologous فأر المصل. ثم خلايا لوحة في 35 ملليمتر غير الأنسجة الثقافة علاج طبق معقمة، واحتضان بين عشية وضحاها في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية.في اليوم التالي، قم بفصل أي خلايا منسجة بعناية من الجزء السفلي من الطبق مع مكشطة زراعة الأنسجة. تدوير الطبق في حين كشط لضمان جمع الخلايا حتى. جمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر.إضافة ملليلترين من برنامج تلفزيوني إلى الطبق، وتكرار خطوة كشط، وجمع الخلايا في نفس الأنبوب. شطف طبق 35 ملليمتر مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وإضافة شطف إلى نفس الأنبوب. تدور في 250 مرات-G في جهاز طرد مركزي قياسي لثقافة الأنسجة لمدة 10 دقائق لجمع الخلايا.ماصة بعناية قبالة supernatant، ثم نفض الغبار الأنبوب لإعادة تعليق بيليه. وأظهر العلاج انخفاض نمو الورم YUMM1.7 في أكثر من 100 الفئران المعالجة مقابل السيطرة، كما لوحظ في بيانات نمو الورم التراكمي من تسع تجارب مستقلة أجريت على مدى عامين. منحنيات نمو الورم التمثيلية للحيوانات الفردية داخل تجربة واحدة توفر إحساسًا بالتغير في النظام.عندما تستنفد إما أحاديات أو الصفائح الدموية من كسر PBMC، أو عند حذف مرور لوحة، لم يعد يلاحظ التأثير العلاجي. العلاج غير فعال في غياب الخلايا المناعية أو مصدر مستضد، أو في وجود مستضد غير متطابق، مثل الأورام YUMM1.7 تعامل باستخدام خلايا سرطان القولون MC38. للحصول على نتيجة للتحصين، من المهم أيضًا تجنب التعرض PBMC لـ 8 ميثوكسيبسورالين.تحليل FACS لتغيير العلامات المشار إليها من عناصر تحكم IgG المناظرة في الخلايا CD11c + البشرية بين إما PBMC المعزولة حديثًا ، و TI-المعالجة PBMC ، و TI-المعالجة PBMC بدون مرور اللوحة ، والصفائح المنضبة قبل مرور اللوحة ، أو كليهما أعلاه ، أظهر أن تنشيط DC يعتمد على وجود الصفائح الدموية في PBMC ، وعلى ممر TI. يمكن لـ TI-activated DCs معالجة فعالة وعبر الحاضر إما مستضدات الببتيد ، أو مستضدات من خلايا الورم البشري المعرضة لـ 8-methoxypsoralen لتنشيط خطوط الخلايا T الخاصة بالمستضد البشري في المختبرات في المختبرات بطريقة TI-and platelet تعتمد على. تعتمد خصوصية استجابات الخلية T على مصدر المستضدات المعالجة.عند الحث على مناعة ضد السرطان، يجب أن يكون مُزَمُّم الخلايا السرطانية من كل خط سرطاني مُلَمّزًا لتحقيق أقصى قدر من المناعة. وبما أن المناعة المستحثة ستكون خاصة بتحصين المستضدات، فإن تشريح كل نظام تفصيلي سيكون ممكناً. كل سرطان تجريبي أو سريري، وكل استجابة مضادة للميكروبات، ستكون مفيدة بشكل فريد.كل سرطان بشري فردي لديه مجموعة من المستضدات الخاصة بالورم. يقوم المركز بالفرز والعرض الضروريين لمستضدات الورم، دون الحاجة إلى تحديدها مختبرياً مسبقاً. يرجى أن نضع في اعتبارنا أن 8-MOP و UVA الخفيفة هي المواد المسرطنة.استخدام معدات الحماية المناسبة واتباع إجراءات السلامة عند التعامل مع 8-MOP وعند العمل مع مصادر ضوء UVA.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

إعداد ورم مستضد محملة الخلايا الجذعية الناضجة لعلاج مناعي

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...