Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
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这项工作得到了 NIH-NCI 孢子 Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi) 的支持;NIH 癌症中心支助赠款 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi);霍华德·休斯医学院培训研究金 (A. Vassall);和 NY 心脏基金会 (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein)。R01 CA196660-01 至 M. Bosenberg 提供了部分支助。
作者感谢罗伯特·蒂格尔博士的指导、指导和实验见解。我们感谢弗劳恩霍夫 IBMT 的同事, 特别是 Thorsten Knoll 博士开发并提供了与 ecp 等效的 TI 室。尼古拉斯·西奥多萨基斯在 YUMM 实验的初始阶段得到了亲切的帮助。我们感谢我们的志愿者献血者 Inger Christensen 和她在耶鲁 ECP 治疗中心的专业人员在志愿者血液采购方面提供的帮助。Wendell Yarbrough 博士和 Natalia Issaeva 博士亲切地与我们分享了 SCC61 和 SCC61-E67 细胞系。对于该项目的技术援助, 我们感谢 Julia LEWIS 博士的流式细胞仪协议建议, 并感谢其他专家组的 E. menet、G. TOKMOULINA、c. Cote。TI 板内细胞的电影图像是在费利克斯·里维拉-莫利纳博士、细胞生物学系和耶鲁医学院耶鲁 cinema 成像中心的帮助下获得的。电影制作由耶鲁医学院传播办公室高级视频制作人 Andrew Osborne 监督。

这里描述的所有老鼠方法都得到了耶鲁大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准, 并与国家动物保健指南研究所达成一致。所有人类研究都是在经过书面知情同意的情况下, 用健康志愿者捐献的血液进行的。人类血液研究是根据公认的道德准则 (例如《赫尔辛基宣言》、CIOMS、Belmont 报告、美国共同规则) 进行的, 并得到耶鲁人类调查审查委员会根据协议第0301023636号批准。
请注意:以下是描述小鼠异质肿瘤抗肿瘤治疗的横传的方案。
1. 联合 YIMM1.7 肿瘤植入术
<ol><li>遵循既定的方案, 根据感兴趣的肿瘤细胞系, 将同种肿瘤植入小鼠的侧翼。 请注意:下面的程序描述了 YAMM1.7 c57bl6 小鼠黑色素瘤肿瘤模型。YMM1.7 黑色素瘤细胞由耶鲁18博士 bosenberg 博士提供.</li>
	<li>
解冻冷冻的细胞, 并在一个细胞通道后使用细胞。在 Dulbecco 的改良鹰营养混合物 F-12 培养基 (DMM/F12) 中培养新鲜解冻的 YMM1.7 细胞, 并在标准下补充10% 的热灭活胎儿牛血清 (FBS)、1% 的青霉素/链霉素和1% 的非必需氨基酸组织培养条件 (37°C, 5% 二氧化碳)。
	<ol>
<li>通过添加足够的胰蛋白酶 edta 来覆盖细胞培养板或烧瓶的底部 (例如, T75 烧瓶为4毫升), 以 60 \ U201270% 的融合方式收集 YOMM1.7 细胞。</li>
		<li>在室温下将细胞培养容器休息 3\ u20124分钟, 偶尔轻轻敲击容器的底部或侧面, 以帮助分离细胞。</li>
		<li>在大多数细胞分离后, 每4毫升添加1毫升的胎牛血清 (FBS), 以阻止大多数细胞的反应。通过移液到15毫升锥形管收集细胞。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗烧瓶, 并将漂洗加入同一收集管。用 PBS 将试管填充到15毫升。</li>
		<li>取出一个小的子, 数一数细胞。</li>
		<li>在标准组织培养离心机中旋转 10分钟, 在 250 x克处收集肿瘤细胞。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在密度为 1 x 10 6 细胞的 PBS 中重新移植 YMM1.7细胞。</li>
	<li>在 100μl的pbs 中注入 1 x 10 5 Ymm1.7 肿瘤细胞, 进入接受者4至6周龄雄性 C57BL/6J 小鼠的右侧, 根据机构指南 (例如, 3\ u20125% 异氟烷吸入气体, 麻醉) 麻醉证实缺乏后爪捏反射)。</li>
	<li>使用卡尺通过双周测量垂直肿瘤直径和高度来监测肿瘤体积。计算 YMM1.7 (肿瘤体积为肿瘤长度 x 宽度 x height)/2。</li>
	<li>当肿瘤变得触手可及时, 启动转移治疗;对于 YUMM1.7 肿瘤, 这通常是第7天 \20210 后肿瘤植入。</li>
</ol>2. 外周血单个核细胞的收集
<ol><li>收集 100\ u2012150μl 的血液从每个肿瘤轴承小鼠通过脸颊出血。</li>
	<li>在采集血液时, 将每个小鼠治疗组 (每个5个实验小鼠 + 5 控制小鼠) 的血液集中在含有 5, 000 U/mL 肝素的15毫升管中。每收集100Μl 血液, 使用 10μl 10% 的肝素。 请注意:在收集过程中经常混合管, 以避免凝血。虽然对照荷瘤小鼠可以与实验小鼠同时出血, 但为了确保与治疗组条件相同, 可以丢弃 "对照" 血液, 也可以与治疗组的血液结合, 以提供额外的实验 PBMC 治疗组, 在调查人员的自由裁量权。</li>
	<li>每 5\ 201 2101只鼠血, 建立一个含有4毫升淋巴细胞分离培养基 (见材料表) 的15毫升管。慢慢地层血 (收集从肿瘤小鼠) 在培养基上。将细胞旋转 20分钟, 在 1, 000\ u2012 x克, 将 PBMC 与红血球分离。</li>
	<li>离心结束时, 收集顶部等离子体层, 使 ~ 0.5 mL 停留在蓬松涂层之上, 并存放在4°c下, 供以后使用 (步骤 7.1)。</li>
	<li>将蓬松的涂层收集到干净的15毫升管中, 用 PBS 填充到15毫升, 并在标准组织培养离心机中旋转 10分钟, 以 250 x g , 以收集 PBMC。</li>
	<li>小心地将上清液移开, 然后通过闪烁管重新悬浮颗粒。不要装饰, 因为颗粒是软的, 可能会丢失。在试管中加入2毫升的 ACK 红细胞裂解缓冲液 (见材料表), 以从 PBMC 中取出任何剩余的红血球。在冰上孵化10分钟。</li>
	<li>用 PBS 填充管到15毫升, 并在标准组织培养离心机中以 250 x g 的速度旋转 10分钟, 以收集 PBMC。</li>
	<li>小心地将上清液移开, 然后通过闪烁重新悬挂颗粒。不要装饰, 因为颗粒是软的, 可能会丢失。 请注意:在此步骤中, 经纯化的 PBMC 可以进行最适合实验的修改。各种 PBMC 成分 (血小板、单核细胞、其他免疫细胞类型) 可根据需要从 PBMC 中耗尽或分离。此外, PBMC 本身可以在第4节之前或之后 (在板块通过之前或之后--在第2节之后或第5节之后) 接触 8-MOPa,方法是遵循议定书步骤 3.3 \ wa20133.8, 而不是用 PBMC 取代 yummm1.7 细胞。这将截断治疗的免疫原性能力, 反而促进免疫耐受。</li>
	<li>对于每个治疗组 (每个5个实验小鼠 + 5个对照小鼠), 在 300Μl FBS 中重新悬浮 PBMC 颗粒。</li>
</ol>3. 肿瘤细胞的8-MOP/UVA 治疗
<ol><li>培养和收集 YUMM1.7 肿瘤细胞, 如步骤 1.2-1.3 所述, 以制备 8-MOPa暴露的肿瘤细胞抗原源。</li>
	<li>每对 5只小鼠的治疗组制备 2.5 x 10 6 Yumm1.7 肿瘤细胞。对于每个治疗组, 以 2.5 x10 6 细胞300μl (~ 8.33 x10 6 细胞) 重新悬浮 fbs 中的肿瘤细胞颗粒。</li>
	<li>在组织培养罩指示灯关闭的情况下, 在 YAMM1.7 肿瘤细胞悬浮液中加入 8-MOP (见材料表), 最终浓度为 8-Mop 100 ngml。 注意: 8-Mop 是一种可活化的 dna 损伤剂和致癌物质。在处理和配药时要小心, 避免与暴露在外的皮肤接触, 并适当丢弃。</li>
	<li>将细胞混合均匀, 用锡箔包裹细胞容器, 在37°c孵育20分钟。</li>
	<li>用 FBS 1 毫升, 在5只治疗组 (2.5 x10 6 ymm1.7 肿瘤细胞) 中, 用1毫升的细胞预涂一口12孔组织培养板, 并在4°c时冷藏填充板20分钟。</li>
	<li>打开 UVA 光源以预热。 注意事项:UVA 光是一种致癌物质。当使用 UVA 光源时, 可以快速、小心地工作, 保护皮肤免受照射, 并使用面罩或护目镜来保护面部和眼睛。</li>
	<li>20分钟后, 将冷藏的12孔板 (步骤 3.5) 移动到组织培养罩上, 从井中取出 FBS, 并为每口井添加 300μl (2.5 x10 6 细胞) 暴露于 mop 的肿瘤细胞 (从步骤 3.4)。</li>
	<li>将含有细胞的板暴露在预热的 UVA 光源上, 使总照射为 4 jcmm2。 请注意:这里描述的8-MOP 浓度和 UVA 剂量是针对 YUMM1.7 肿瘤细胞系进行校准的。对于每个实验肿瘤细胞系, 应进行8-MOP/UVA 剂量的滴定, 足以在接触后1周内导致100% 肿瘤细胞死亡, 以确定有效的杀伤剂量。这对于小鼠体内 TI 实验至关重要, 因为细胞在后轨道下被重新注射 (步骤 6.1), 因此任何未受损的肿瘤细胞都可能在被治疗的动物中形成眼睛肿瘤。作为指导, 4\ u20128 J/cm 2的 uva, 100\ u2012200 ngl 8-mop, 是大多数肿瘤细胞系的典型有效范围。</li>
	<li>从每口井收集 8-MOPa处理的肿瘤细胞, 旋转板和仔细移液, 以确保细胞完全恢复。</li>
</ol>4. 细胞 TI 板通道
<ol><li>对于5个小鼠的每个治疗组, 将适当的 PBMC 的 1.5 mL 锥形管 (从步骤 2.11) 和 8-MOPa处理的肿瘤细胞的 300μl (从步骤 3.9) 合并在一个 1.5 ml 的锥形管中。混合细胞。</li>
	<li>使用10毫升注射器填充 ti 管材的 "入口" 和 "出口" 套件 (请参见 材料表)与 FBS。打开油管夹, 以填充管, 并关闭夹紧夹, 一旦管填充之前, 断开注射器, 以保留 FBS 内的管。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将 PBMC 和肿瘤细胞混合 (从步骤4.1 开始) 添加到 TI 板 (见材料表)。将板保持在45°角, 将移液器尖端牢固地放入 ti 板进气口, 然后慢慢填充板, 避免气泡。</li>
	<li>在释放移液器柱塞之前, 从进气口取下移液器尖端。该板材可容纳 450μl;将剩余的细胞返回到 1.5 mL 锥形管。</li>
	<li>在37°c条件下, 将充满 fbs 的油管、充满细胞的 ti 板和含有组织培养孵化器中剩余细胞的 1.5 ml 锥形管孵育1小时。孵育后, 用重力清空 ti 管材, 释放夹子。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将移液器尖端插入板端口, 将其与柱塞压入板端口, 从而将细胞从 TI 板中取出。将板保持在45°角, 然后填充 p1000 移液器尖端。将细胞重新放入原来的 1.5 mL 锥形管。</li>
	<li>要运行 TI 板, 请将出口管连接到板, 并将 TI 板固定在板材运行系统中。</li>
	<li>使用1毫升注射器, 从 1.5 mL 锥形管中提取600Μl 的 PBMC 和肿瘤细胞混合物, 去除注射器中的任何气泡, 将注射器连接到入口管, 夹具打开, 慢慢填充, 直到液体到达管的末端。</li>
	<li>将入口管的自由端连接到 TI 板上, 并继续轻轻加载剩余的体积。关闭入口夹具。</li>
	<li>拆下1毫升注射器, 并将入口注射器连接到注射器泵。将出口管固定在一个干净的 1.5 mL 锥形管, 用于电池收集。</li>
	<li>将注射器泵的流量调整到 0.09 mL/min, 但尚未启动泵。使用 TI 板运行平台或任何其他方式 (例如, 板一端下的一个小扁平物体) 将 ti 板向注射器泵一侧倾斜 ~ 30°。</li>
	<li>小心松开入口管上的夹子。启动注射器泵, 仔细观察 TI 板如何填充, 并在必要时轻拍管道或板材, 如果有任何气泡阻碍流动。</li>
	<li>一旦 TI 板完全被填充, 倾斜它 ~ 30°在相反的方向, 因为它清空。当所有的细胞和液体都在 1.5 mL 锥形收集管中时, 停止泵。</li>
	<li>要清洗 TI 板, 请断开注射器泵的入口管, 连接到装有 600μl FBS 的1毫升注射器, 并按照步骤 4.8 \\ u20124.9 的步骤进行操作。</li>
	<li>按照步骤 4.12 \ U20120124.13 中的说明, 将注射器泵流量调整到 0.49 Ml/min, 松开入口夹具, 并运行 TI 板, 在相同的 1.5 mL 锥形管中收集清洗。在整个时间内轻轻轻触或点击 TI 板, 以帮助分离和洗脱任何粘附细胞。</li>
	<li>以 250 x g 的速度将收集 1.5 mL 锥形管的集合在 250 x g 中, 分叉 8分钟, 丢弃上清液。</li>
</ol>5. 用于夜间培养基的自体小鼠血清的制备
<ol><li>收集血液从 10\ u2012122周老 C57BL/6J 小鼠通过任何机构批准的方法 (例如, 眼睛出血, 尾静脉出血, 面颊出血, 或最终出血的心脏穿刺), 没有任何抗凝剂。估计每需要300Μl 血清收集1毫升血液。 请注意:在实验中, 每个治疗组的5只小鼠都需要300μl 的血清。</li>
	<li>允许血液在4°c 下过夜凝结。</li>
	<li>以 3, 000 x克的速度将凝血向下旋转 15分钟, 仔细收集含有血清的顶层 请注意:血清可立即用于制造隔夜细胞培养培养基 (步骤 6.1), 或保存用于未来的实验。为了保持血清, 在-20°c 的温度下冷冻。</li>
</ol>6. 多溴二苯并与抗原的隔夜共培养
<ol><li>用15% 自体小鼠血清 (在第5步中制备) 在透明 RPMI 2 毫升中重新移植 PBMC 和肿瘤细胞颗粒 (步骤 4.5)。板在35毫米非组织培养处理的无菌盘, 并在标准组织培养条件下孵育过夜 (37°c, 5% CO2)。 请注意:如果 PBMC 与非细胞抗原 (肽、纳米粒子、蛋白质等) 一起使用, 省略协议第3节, 然后从第2节直接进入第4节, 将所需的抗原添加到 ti 平台通过 PBMC 中, 以便在这里进行隔夜共同孵化。步骤6.1。</li>
	<li>第二天, 用组织培养刮刀小心地将盘子底部的任何粘附细胞分离, 在刮碗的同时旋转, 以确保即使是细胞收集。收集细胞在一个15毫升管。</li>
	<li>在盘子中加入2毫升 PBS, 重复刮板步骤, 将细胞收集到同一管中。用1毫升 PBS 冲洗35毫米的盘, 并将漂洗加入同一根管子。</li>
	<li>在标准组织培养离心机中旋转 10分钟, 在 250 x克处收集细胞。小心地将上清液移开, 然后通过闪烁管重新悬浮颗粒。不要装饰, 因为颗粒是软的, 可能会丢失。</li>
</ol>7. 将 ti 治疗的细胞再注射到荷瘤小鼠体内
<ol><li>在 750 x g 处向下旋转自体等离子体 (在步骤2.4 中制备 ) 15分钟, 以沉积任何颗粒。在600μl 的自体血浆或 PBS 中重新填充细胞颗粒 (从步骤6.4 开始)。</li>
	<li>以每只小鼠100Μl 的速度将细胞注入适当麻醉的后眼眶神经丛 (例如, 3e20125% 异氟烷吸入气体, 麻醉证实缺乏后爪夹紧反射) 荷瘤实验小鼠。如果需要, 重新注射对照肿瘤荷小于小鼠100μl 的自体血浆, 或 PBS。</li>
	<li>对于 YUMM1.7 含肿瘤小鼠, 每周重复两次治疗 (步骤 2-7.2), 为期 3周, 共6次治疗。每周收集和处理含肿瘤小鼠的 PBMC (协议第 2\ u20124 节) 在周一和周四, 并在周二和周五隔夜孵育后重新注入 (协议第5 \ u20127 节)。 请注意:本治疗方案适用于 YMM1.7 肿瘤在小鼠体内的特异性生长动力学。它可能需要滴定其他肿瘤系统的速度较慢或较快的肿瘤生长速度-分别增加或减少治疗的数量。</li>
	<li>使用卡尺测量垂直肿瘤直径和高度, 通过双周测量 (最好是在治疗时 (周二和周五) 监测肿瘤体积。当控制肿瘤体积达到机构指南和方案允许的最大大小时, 终止实验。</li>
</ol>8. 治疗少量人血的协议适应
<ol><li>通过首先从人类血液中分离 PBMC, 调整与人体细胞一起使用的协议。使用肝素作为抗凝剂, 与任何首选的 PBMC 隔离协议。</li>
	<li>确保隔离的 PBMC 分数包含血小板的生理数量, 以获得最佳的协议结果。使用任何标准的血液学计数器监测 pbmc 隔离前后的血小板计数。</li>
	<li>如果使用人类细胞抗原源, 按照第3节所述的步骤治疗人类抗原细胞, 以治疗 YMM1.7 细胞。相关的钛量8-MOP 和 UVA 剂量。</li>
	<li>执行第4节所述的板通道步骤, 每个 TI 板最多使用 3 x 10 7 pbmc。</li>
	<li>用第6节所述的纤维素/其他抗原进行隔夜培养, 但步骤6.1 中用15% 的人 AB 血清代替自体小鼠血浆作为隔夜培养培养基。</li>
	<li>在任何所需的检测中使用生成的细胞。例如, 与抗原反应 T 细胞联合培养, 观察 ti 处理细胞引发的抗原特异性 T 细胞反应。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

耶鲁大学拥有理查德·埃德尔森教授的树突状细胞研究所产生的专利, 该研究已获得耶鲁初创公司 Transimmune AG 的许可。Richard Edelson 和 Michael Girardi 是 Transimmune AG 的科学顾问, Olga Sobolev 是 Transimmune AG 的员工。Transimmune AG 没有任何当前的商业产品, 但在协作的基础上, 它产生了本文中使用的 Transimmune 板。这三位作者有可能在未来从这些发现的商业化中受益。

上述微型化装置和协议首次允许对小鼠实验系统和小型人体血液样本中的 ECP 机制进行有效的实验室调查。这是一个伟大的进步;例如, 它使我们能够首次证明在11大鼠模型中对实体肿瘤的转移的有效性, 为今后在人类肿瘤学中类似应用的可能性打开了可能性。
在开发本文所描述的转移装置和方法之前, 不可能对 ECP 的各个方面进行充分的研究。在小鼠模型中, 虽然通过治疗培养皿中的细胞12 ,20,可以在一定程度上复制这种疗法的 8-mop a 方面, 但没有能力将平板通道集成到该方法中, 这已被证明是提供动态血小板相互作用, 这对 ECP 的生理 DC 活化14至关重要。或者, 在人类研究中, 流动成分完全存在, 但有选择地将特定细胞成分暴露给 8-MOPa 或保护它们不受其影响的能力缺失了21,22。这妨碍了对 ECP 机制的充分理解, 也妨碍了对其抗扰或耐受性的优化。此外, 使用临床 ECP 设备所需的血液量很大, 阻碍了科学的调查。此处首次描述的小型化 ECP 设备和协议可实现高效、完全灵活和可调整的实验室 ECP 建模。此外, TI 板还可以通过显微镜对板内的细胞相互作用进行实时可视化和监测。
为了使协议在体内和体外系统中的成功, 经过处理的 PBMC 含有可激活到功能 Dc 中的单核细胞至关重要。为了进行这种激活, 还必须确保 PBMC 分数包含健康的、有活性的血小板的生理数量, 并严格遵循 TI 板通过协议。为了引导新激活的 Dc 走向特定的反应性, 必须向它们提供抗原。我们发现, 抗癌免疫的抗原传递最有效的方法是隔夜共同培养新激活的 Dc 与含有抗原的 8-MOPa暴露的肿瘤细胞。这样做的另一个好处是, 能够在不需要事先了解肿瘤抗原的情况下, 通过允许 Dc 选择肿瘤抗原, 产生免疫原性抗癌反应。然而, 在抗原已知的情况下, 我们在共同孵化中使用游离肽作为抗原时, 在体外系统中取得了一些成功。对于免疫原性应用, 应保护发展中国家本身不受 8-MOPa 接触。最后, 在体内实验中, 与能够抗肿瘤免疫的动物模型合作很重要。Transim勤奋化的工作原理是创建激活的、抗原特异性的 Dc, 它们在体内起到启动先天和适应性免疫反应的作用。治疗后的小鼠体内 NK、CD4 或 CD8 t 细胞的活性受损或缺乏将影响协议的疗效5、11.
虽然这里描述的协议是一个原则证明, 已经优化了小鼠固体异基因肿瘤模型, 但它揭示了许多机会。肿瘤学中 ECP 的机制才刚刚得到阐明, 仍有很大的改进理解空间。更广泛地说, 产生生理激活的小鼠和人类 Dc, 并有选择地引导它们接受抗原特异性免疫的能力, 除了癌症之外, 还有许多潜在的应用。这样做的能力, 但相反, 引导发展中国家的抗原特定的容忍度, 如 ECP 本身的耐受性功效所表明的, 也具有广泛的医学影响。有了这种方法, 我们希望为任何对生理直流疗法感兴趣的人提供工具, 开辟一条富有成效的研究渠道。

体外光化疗 (ECP) 是一种成熟的免疫治疗方法, 在世界各地的大学中心广泛运作。它的使用是由 ECP 治疗独特的选择性、安全性和双向疗效所驱动的, ECP 与生理免疫系统本身共有的特征, 而这些特征似乎与它成为了合作伙伴。Ecp 是有选择地免疫恶性细胞在皮肤 t 细胞淋巴瘤 (ctcl)1,2, 并有选择地耐受靶向抗原移植, 自身免疫, 和移植物抗宿主疾病 (gvhd) 设置3 个,4. ecp 的免疫原性突出了它对 ctccl5 中完整的 CD8 t 细胞室的依赖性, 而 ecp 非常有利的不良反应谱反映了特异性, 移植时没有非目标免疫抑制, 或者GvHD 设置, 并没有增加机会性感染易感性在 CTCL, 非致病性 T 细胞克隆可能会丢失与恶性 T 细胞。
鉴于 ECP 的临床重要性, 希望更好地了解其机制可能会扩大 ECP 的治疗范围, 以更广泛的癌症和免疫性疾病激发了国际兴趣。举办并报告了两次全国认可的讲习班, 即国家卫生研究院第6次科学状况研讨会和美国禁产学会第7届共识会议,目的是加快确定 ECP 抗癌和耐受性效应的主要细胞贡献者。
迄今为止, 尽管发表了许多报告试图解决欧洲方案的机制, 但有两个主要障碍阻碍了科学进步。首先, 由于缺乏能够充分反映 ECP 的细胞和体内效应的微型 ECP 装置, 以及适用于动物模型的微型 ecp 装置, 实验实验室环境中 ecp 机制的研究受到了限制。其次, 由于需要进入治疗中心的 ECP 处理的患者免疫细胞有限, 在临床环境中对 ECP 样本进行深入的实验室分析受到限制, 而且还取决于病人的输液, 以及对未被感染的患者白细胞的伦理需求。
为了解决阻碍 ECP 研究进展的障碍, 我们着手开发一种微型 ECP 装置, 该装置将最接近于治疗的关键要素。标准的 ecp 治疗包括患者的白细胞富营养化白细胞通过1毫米厚, 紫外线 a 光 (uva) 透明, 塑料板6, 8.在板中, 白细胞暴露在 8-甲氧基吡咯烷酮 (8-MOP) 中, 这种光激活剂在 UVA 暴露后被瞬变转化为反应形式 (8-MOPa), 能够通过其二价结合到吡啶碱基的 dna 交联。姐妹 dna 链9,10。经过加工的 8-MOP a 处理白细胞被收集并通过静脉注射返回给患者.
由于 ECP 本身是一种双向治疗, 在癌症中进行免疫, 并在移植、自身免疫和 GvHD 设置中耐受, 为了澄清起见, 我们将 ECP 模型的免疫模式命名为 "转移性", 以及耐受性模式 "传磁"。我们首先研究了转移式的方法。我们最近报告的微型可扩展鼠标对人的 ECP 装置、传输 (TI) 室或平板以及相应的协议, 在11例癌症中再现了人类 ECP 装置的细胞和体内效应.
为了使体内转移模型尽可能具有临床相关性, 我们在皮下注射的同种小鼠肿瘤后启动了免疫治疗, 从而测试了该方案在已建立的癌症中的有效性。与 CTCL 中的 ECP 类似, YUMM1.7 黑色素瘤模型中的原理转换协议使用了来自肿瘤动物的外周血单个核细胞 (PBMC)。细胞在流动下通过 ti 板。虽然对微型室中的细胞进行 8-MOPa处理是可能的, 但最好是单独进行, 以确保只有所需的细胞类型暴露在 8-MOPa 中。早期的研究表明, ECP 的耐受性作用是由 8-MOPa损伤抗原表达细胞12介导的, 而免疫作用需要 8 mop a损伤的目标肿瘤细胞 11。在转移协议中, 肿瘤细胞或免疫细胞都可以根据需要选择性地暴露在 8-MOPa 中。由于最大限度地延长 8-MOP a 损伤肿瘤细胞与 ecp 诱导的树突状细胞 (dc) 之间的接触时间已被证明能显著提高临床 ecp13的免疫治疗能力, 因此我们纳入了一夜期共同孵化进入我们的协议。经过一夜孵育, 经过处理的细胞返回到结瘤的动物。
该系统可靠地减少了肿瘤生长, 并引发了已建立的同种异体肿瘤11小鼠的特异性抗肿瘤免疫, 使我们能够剖析 ecp 临床抗肿瘤疗效的机制。在几项研究中, 我们已经证明 ecp 免疫是通过 ti板 14,15 中的体外血小板活化启动的。激活血小板随后信号单核细胞到树突状细胞成熟14, 导致生理 dc 的生产。新形成的单核细胞衍生 Dc 能够交叉呈现 8-MOP a 损伤肿瘤细胞的内化抗原, 激活抗原特异性 t 细胞反应16。然而, 正如先前第12,17, 8-mopaa引起的新生 dc 本身的损害可以反击, 甚至逆转抗肿瘤作用11, 提供了一个机械联系的 ecp 耐受性。
TI 板还被用来从人类 PBMC 中产生生理激活的 Dc。与小鼠研究类似, 人类 ti 衍生的 Dc 在血小板的存在下依赖于血小板的通过, 在表型上与临床 ECP 板中产生的血小板相似, 并且能够有效地处理和交叉呈现人类肿瘤抗原激活人 t 细胞11,16。
在揭示 ECP 免疫治疗的机制, 因此, 我们发现了一种方法, 迅速产生生理小鼠和人类树突状细胞所需的抗原特异性, 可以功能调节。创新的 TI 装置和协议在更广泛的 ECP 研究和治疗以及癌症免疫治疗领域具有重要的潜在价值, 在任何其他对生理、功能树突状细胞感兴趣的领域, 无论是免疫接种还是免疫。公差方式。我们希望, 该出版物将为那些对这些研究领域感兴趣的人提供必要的工具。

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

体外光化疗 (ECP) 是一种广泛应用于皮肤 T 细胞淋巴瘤 (CTCL) 的癌症免疫治疗方法, 可在全球350多个大学中心进行手术。虽然 ECP 的临床疗效和模范安全性状况推动了其广泛使用, 但阐明其潜在机制仍然是一个挑战, 部分原因是缺乏实验室 ECP 模型。为了克服这一障碍, 并为 ECP 研究创建一个简单、用户友好的平台, 我们开发了一个缩小规模的临床 ECP 白细胞处理装置, 适用于小鼠模型和小人体血液样本的工作。这种装置被称为 Transimmunization (TI) 腔室或板材。在一系列具有里程碑意义的实验中, 微型化装置被用来生产一种细胞疫苗, 该疫苗在几种同源小鼠肿瘤模型中定期启动治疗性抗癌免疫。通过从实验系统中去除个体因素, 确定其对体内抗肿瘤反应的贡献, 阐明了 ecp 免疫潜力的关键机械驱动因素。我们的结果表明, ECP 的抗肿瘤作用是由树突状细胞 (DC) 引起的, dc 是通过 ti 板中的血单核细胞与血小板的相互作用生理产生的, 并富含凋亡细胞的肿瘤细胞的抗原。通过接触可活化 DNA 交联剂 8-甲氧基吡咯和 UVA 光 (8-MOPa), 对死亡进行精细滴定。当返回到小鼠, 这种细胞疫苗导致特定的和可转移的抗肿瘤 t 细胞免疫。我们证实 ti 室也适用于人类血液处理, 产生的人体 Dc 在激活状态和轮廓上与临床 ECP 室得出的情况完全可比。这里介绍的方案是用于小鼠和人的 ECP 研究, 控制生成的凋亡肿瘤细胞与 8-MOPa,以及快速生产生理人类和小鼠单核细胞衍生的 dc 的各种应用。

我们最近开发了一个可从鼠标到人的可扩展微型 ECP 设备 ti 板 (图 1a), 并设计了相应的处理方案。该装置和协议再现了免疫 ECP 的关键细胞和体内特征, 称为 "转移性"。
主证明小鼠转移协议11 (图 1 b) 包括体外 ti 板通道外的外周血单个核细胞 (pbmc) 从肿瘤携带小鼠与凋亡 8-mopa-暴露肿瘤细胞。值得注意的是, TI 室是透明的, 大小与标准的显微镜幻灯片格式相匹配, 可以方便地显示 TI 板内的细胞相互作用在协议的任何一点 (视频 1)。Ti-血小板激活的免疫细胞与 8-MOPa暴露的凋亡肿瘤细胞隔夜培养, 促进肿瘤细胞的吸收、处理和肿瘤抗原转移到 dc。第二天, 共同培养的细胞混合物返回到结瘤动物的血液中。控制动物接受相同的血液收集程序, 以使淋巴消耗对肿瘤生长的任何影响正常化, 而是接受 PBS 再输液。在整个实验过程中, 所有动物的肿瘤生长都受到监测。
在使用 YUMM1.7 同一性小鼠黑色素瘤模型18的研究中, 在三周内每周重复两次转移过程, 每只动物共进行6次治疗 (图 1b)。这种疗法在所有接受治疗的动物中似乎耐受性良好 (gt;100), 并在经过2年的9项独立实验中观察到, 在治疗和控制的动物中, YAMM1.7 肿瘤生长持续下降 (图 2A. b)。结果表明, 在所有实验 (图 2a) 中, 经转移处理和控制的动物的累积肿瘤生长数据, 以及一个实验中单个动物具有代表性的肿瘤生长曲线, 以提供一种感觉系统中的可变性 (图 2B)。
我们发现, 该协议的成功关键取决于治疗后的 PBMC 中单核细胞的存在、PBMC 分数中血小板的存在以及 TI 板通道步骤。当省略板通道, 或者当血小板或单核细胞从 PBMC 分数中耗尽时, 治疗效果就不再被观察到 (图 3 a)。治疗还需要有凋亡的肿瘤细胞。在没有免疫细胞或抗原源的情况下, 或在存在不匹配的抗原的情况下, 例如在使用 MC38 结肠癌细胞治疗患有 YMM1.7 肿瘤的小鼠时, 这种方法是无效的 (图 3b)。对于免疫结果, 避免 PBMC 接触 8-MOPa 也是至关重要的。8-MOPa暴露的 PBMC 不仅可以消除甚至逆转抗肿瘤免疫 (图 3c), 而且还能抑制未暴露细胞的免疫潜力, 如实验中, 相当数量的 8-MOPa 暴露和8-mop 相同在没有可观察到的抗肿瘤作用的情况下使用了受保护的 PBMC (图 3c)。
利用人 PBMC、TI 腔和转移协议, 单核细胞成功活化进入 DC, 与临床 ECP 板的细胞表面和细胞内活化标志物无法区分 (表 1)。与小鼠研究一样, dc 激活 (图 4 a) 和透射生成的 dc 处理和呈现抗原的能力 (图 4A, c)关键取决于 pbmc 中是否存在血小板, 也取决于 ti 板通道。转位生长的人类 Dc 可以有效地处理和交叉呈现肽抗原 (图 4b), 或来自整个 8-Mpa暴露的人类肿瘤细胞的抗原, 在体外激活人抗原特异性 t 细胞系以 TI 和血小板依赖的方式进行检测 (图 4c)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> 图 1: Transimmunization 化 (ti) 腔室和协议原理图.(A) 转移处理室 (ti 板) 的示意图和规格。(B) 转移处理实验工作流程的原理图描述。简单地说, 动物是用异基因肿瘤细胞在皮下接种的;有明显肿瘤的动物每周接受两次治疗, 方法是抽血、从血液中分离 PBMC、PBMC 流经自体血小板涂层 ti 板, 在8-MOP/UVA 治疗的肿瘤细胞、PBMC 和肿瘤细胞联合培养一夜的情况下,将细胞重新注射到相同的肿瘤动物体内。肿瘤体积是在整个实验过程中测量的。这一数字已从11个修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> 图 2: 转基因控制 YAMM1.7 黑色素瘤异质肿瘤的生长.(A) 随着时间的推移, 为 c57bl6 小鼠绘制了 ymm1.7 肿瘤体积图, 这些小鼠接种了 1 x 10 5 ymm1.7 肿瘤细胞, 并接受了六种横断治疗 (黑线) 或六种控制治疗 (灰线)。数据是在两年内进行的9项独立实验的累积数据。(B) 来自单一代表性的 Y蒸M1.7 transimmunizaton 实验的数据, 每行显示单个小鼠的肿瘤生长。(A和b)所有实验中的 "PBS 控制" 小鼠都在与实验动物相同的时间表上流血, 但得到了6次无菌的 PBS 再输液。误差条表示使用 Sidak 的多次比较测试为每个时间点计算的 SEM p 值;* *, p = 0.0013;, p < 0.0001。这一数字已从11个修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> 图 3: 转移性要求 ti 血小板通过的 PBMC 组分中的单核细胞和血小板, 以及 8-MOPa治疗抗原匹配的肿瘤细胞和 8-mop a的 pbmc 节省.(A) 随着时间的推移, 为 c57bl6 小鼠绘制了 YMM1.7 肿瘤体积图, 用于接种 1 * 10 5 ymm1.7 肿瘤细胞, 并接受6次横断治疗 (固体黑线)、6次控制治疗 (固体灰色线) 或 6次 ti 治疗在平板通道步骤 (分别使用-CD11b 和 A-CD41 耗尽套件) 或板状通道 (虚线) 之前, 单核细胞或血小板从 PBMC 中耗尽的情况下。(B) 为 c57bl6 小鼠绘制了一段时间的肿瘤体积图, 接种了 1 x 10 5 yumm1.7 肿瘤细胞, 并接受了6种横截面处理 (固体黑线)、6种控制处理 (固体灰色线)、pbmc 单独 (虚线)、8-仅mop a 治疗的 ymm1.7 细胞, 或 ti 使用 8-mopa治疗的 mc38 肿瘤细胞 (虚线)。(C) 为 c57bl6 小鼠绘制了一段时间内的肿瘤体积图, 接种了 1 x10 5 ymm1.7 肿瘤细胞, 并接受了6种 transimsimu离处理 (固体黑线)、6种控制治疗 (固体灰色线)、6种 ti 治疗方法, 其中PBMC 在平板通道前均匀地暴露在 8-MOPa 中, 六种 ti 处理在平板通道后立即均匀暴露于 8-MOPa,或6次治疗, 即平板通道后的 ti 细胞与平板通道后混合 1: 1 与均匀暴露在 8-MOPa 辐照 (虚线) 中的 PBMC 的数量相等。(A、 b和c)所有实验中的 "PBS 控制" 小鼠都在与实验动物相同的时间表上流血, 但得到了6次无菌的 PBS 再输液。为具有代表性的实验提供了数据。条形图表示使用 Sidak 的多重比较测试为每个时间点计算的 SEM p 值;*, p < 0.05;* *, p < 0.01;, p < 0.001;, p < 0.0001;NS = 差异不显著。这一数字已从11个修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> 图4:ti 腔的 TI 协议可快速诱导人体 PBMC 中的 DC 成熟度、独特的激活剖面和 T 细胞激活能力, 这取决于板通道和血小板。 A. 对新分离的人类 pbmc ("控制")、ti 协议处理的 pbmc或使用 ti 处理的 pbmc (其中省略了平板通道、使用在板通过之前进行了 CD41 珠套件, 或同时进行了上述两种操作。数据总结了三个献血者的六个独立实验。条形图表示平均值, 而误差条表示使用配对 t 检验计算的每个比较的 SEM. p 值;*, p < 0.05;* *, p < 0.01。面板已从11个修改。B. 含有血小板或血小板耗尽的 ti 处理的人 PBMC 与不相关的 (siinfekl) 肽 (siinfekl) 共同孵育, 或与头颈部鳞状细胞癌相关的 Hpv e7 蛋白的长肽共同孵育。然后使用 PBMC 刺激人类 CD8 T 细胞系, 特别是对 E7 肽的反应。采用 IFNg 生产5天培养后测定 t 细胞刺激。(C) 含有血小板或血小板耗尽的 ti 治疗的人 PBMC 与8-moma 治疗的头颈部鳞状细胞癌细胞系 scc61 在一夜之间共同孵育, 要么表示 (scc61 hpv e6 7), 要么不表示 (SCC61 no HPV)) 抗原 HPV E6 和 E7 蛋白19。然后使用 PBMC 刺激人类 CD8 T 细胞系, 特别是对 E7 肽的反应。采用 IFNg 生产5天培养后测定 t 细胞刺激。(B和c)数据显示了具有代表性的实验, 每个实验有三个副本。条形图表示平均值, 而误差条表示使用 Sidak 的多重比较测试计算的每个比较的 SEM. p 值;, p < 0.001;, p < 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>标记</td>
			<td>参数</td>
			<td>治疗</td>
			<td>具有 TI 协议的 ECP 板</td>
			<td>Ti 板与 TI 协议</td>
			<td>p 值 ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>1001±42。4</td>
			<td>439.8±152。5</td>
			<td>417.7±152。2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td><Unk>%</td>
			<td>3.9±1。1</td>
			<td>22.3±7。2</td>
			<td>24.5±7。2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>0.3±0。2</td>
			<td>53.3±9。7</td>
			<td>51.4±17。4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>10.8±1。7</td>
			<td>103.9±23。4</td>
			<td>871±17。6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>PLAUR</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>54.5±12</td>
			<td>721.4±183。6</td>
			<td>528.7±135。5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>12.2±1。6</td>
			<td>17.9.6±28。5</td>
			<td>192.5±25。4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>53.6±25。7</td>
			<td>972.±31。6</td>
			<td>103.8±32。8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td><Unk>%</td>
			<td>0.6±0。5</td>
			<td>70.1 ±6。7</td>
			<td>552±8。9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td><Unk>%</td>
			<td>0.7±0。4</td>
			<td>39.1 ±7。2</td>
			<td>41.5 ±4。7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td><Unk>%</td>
			<td>0.3±0。2</td>
			<td>28.0±8。8</td>
			<td>353±11。7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (内林)</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>3.6±0。3</td>
			<td>124.3±25。4</td>
			<td>141.8±33。2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (内口 2)</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>10.9±1。8</td>
			<td>473±5。2</td>
			<td>50.9±9。2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>10.1±2。6</td>
			<td>2.2±1。4</td>
			<td>1.8±1。1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>-MFI</td>
			<td>2.9±1。5</td>
			<td>1.0±0。4</td>
			<td>1.2±0。6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ti 协议与 ti 室迅速诱导 DC 成熟相当于 ti 协议与临床 ecp 室诱导的成熟.流式细胞仪仪仪分析了在新分离的 PBMC ("未经处理")、PBMC 按照 TI 协议 ("具有 TI 协议的 ECP 板") 和分析了隔夜孵化后的情况, 或用 TI 协议 ("TI 板与协议") 处理的 PBMC, 并在隔夜孵化后进行了分析。对于标记, 如 HLA-DR, 其中整个细胞群被改变, 数据表示为平均荧光强度 (MFI) 的变化。对于只有一个单元格子集表示标记的标记 (如 CBL2), 则表示活 CD11c+ PBMC 的标记阳性单元的百分比百分比值的差异。数据总结了三个献血者的六个独立实验。每个标记的数据表示为均值 (SEM) 的平均±标准误差。使用配对 t 测试计算的每个比较的 p 值;NS = 差异不显著。表已从11修改。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> 视频 1: ti 板内血小板和免疫细胞相互作用的活细胞成像。 PBMC 是按照上文协议第2节的描述制备的, 暴露在第4节所述的过渡板中, 但步骤4.2.3 的静态潜伏期从1小时缩短到30分钟。在 TI 协议中, ti 板的尺寸与标准显微镜幻灯片相同, 在平板填充过程中, ti 板被安装到荧光成像系统的滑动保持阶段, 其内部的细胞以40x 的放大倍率和37°c 的速度成像 (4.2。2)、板孵育 (4.2.3) 和板流 (4.3.5) 阶段。使用 "自动扫描常规" 软件获取连续图像并制作电影。视频下方的说明表明了细胞正在拍摄的协议的阶段。视频中的箭头和圆圈, 以及相关的标题, 指出了细胞和感兴趣的区域。在整个视频过程中, 10μm 刻度条存在于右下角。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">请点击这里观看此视频。(右键单击下载.</a>

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Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

开发了转移 (TI) 装置或平板和相关的协议, 以便在实验环境中复制体外光化疗 (ECP) 的主要特征, 从而产生生理激活、可调谐的树突状用于癌症免疫治疗的细胞 (Dc)。

一种新的生理免疫原树突状细胞生成方法

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

生理树突抗原呈现细胞，即PhDC，是启动抗原特异性T细胞免疫和耐受性的免疫主开关。本文阐述了一种生产PDC的高效方法。树突状细胞的临床应用受到用于生产树突状细胞因子的非生理细胞因子方法的阻碍。我们的方法通过人类和小鼠单细胞到直流转换的高效血小板信号克服了这一问题。这些 PhDC 不依赖于体内不可用的细胞因子条件，因此它们可以在人类和患有已证实的癌症的小鼠中产生有效的临床抗肿瘤 T 细胞反应。单细胞到PhDC成熟与物种无关的血小板启动具有广泛的实验适用性。PhDC允许解剖树突状细胞生理学，促进免疫原癌的治疗性抗癌免疫诱导，并为个性化抗菌疫苗接种提供前景。该实验系统新颖，其多个方面，如塑料室的涂层，肿瘤细胞治疗8-MOP/UVA，流动条件，单细胞的释放是最佳的视觉表现。演示这个程序的将是伊芙·罗宾逊，一个来自我实验室的技术员。为了收集外周血单核细胞，首先建立一个15毫升的管，每5到10只老鼠流血，有4毫升淋巴细胞分离介质。然后慢慢将从带肿瘤的小鼠身上采集的血液层在介质上。在1000至1500倍-G下旋转细胞20分钟，将PBMC从红血球分离。离心结束时，收集顶部血浆层，将0.5毫升的毫克留在薄漆上方，并储存在4摄氏度内供以后使用。接下来，将薄涂层层收集到充满 PBS 至 15 毫升的清洁 15 毫升管中，并在标准组织培养离心机中以 250 倍 G 旋转 10 分钟，收集 PBMC。离心结束时，小心地移液器关闭上经剂，轻拂管子以重新暂停颗粒。然后向管中加入两毫升的 ACK 红细胞解液缓冲液，从 PBMC 中去除剩余的红血球。在冰上孵育PBMC10分钟。用 PBS 填充管至 15 毫升，并在标准组织培养离心机中以 250 倍-G 的电转 10 分钟收集 PBMC。小心地移液关闭上流液，轻拂管子以松开颗粒。将颗粒重新在 300 微升 FBS 中。为了准备每个治疗组的YUMM1.7肿瘤细胞，首先将FBS中的肿瘤细胞颗粒重新以每300微升250万个细胞重新暂停。关闭组织培养罩后，将 8-甲氧丙酮添加到 YUMM1.7 肿瘤细胞悬浮液中，最终浓度为每毫升 100 毫微克。接下来，混合细胞，用铝箔包裹细胞容器，在37摄氏度下孵育20分钟。要预涂一个12井组织培养板，每组5只小鼠加入一毫升FBS，并在4摄氏度下冷藏20分钟。20分钟后，在组织培养罩下，从井中去除FBS，每口井加入300微升的甲氧丙酮暴露肿瘤细胞。然后将含细胞的板暴露在预热的紫外线 A 光源中，使每平方厘米总照射四焦耳。从每口井中收集8个甲氧丙酸/UVA治疗的肿瘤细胞，小心地旋转板和移液器，以确保细胞完全恢复。要对每组5只小鼠进行转免疫板通道，将300微升的合适PBMC和300微升的8-甲氧丙酮/UVA治疗的肿瘤细胞混合在1.5毫升的圆锥管中，混合细胞。接下来，打开 TI 板的入口和出口管夹。使用 10 毫升注射器将 TI 油管装满 FBS，在管子充满时关闭夹子以将 FBS 保留在管内。断开注射器。将 P1000 移液器尖端牢固地放入 TI 板进气口中。以 45 度角握住板，用 PBMC 和肿瘤细胞混合缓慢填充板，避免气泡。在松开移液器柱塞之前，请从进气口中拆下移液器尖端。将剩余的细胞返回到 1.5 毫升锥形管。在37摄氏度下孵育充满FBS的管子、充满细胞的TI板和1.5毫升锥形管，这些结锥管含有组织培养箱中剩余的细胞，需要一小时。孵育后，松开夹子，通过重力排空 TI 管。然后将 P1000 移液器尖端插入板端口，将柱塞压入板端口，以从 TI 板上取出电池。以 45 度角握住板，并填充 P1000 移液器尖端。将细胞放回其原始的1.5毫升锥形管中。要运行 TI 板，请将出口管连接到板，然后将 TI 板固定到板运行系统中。接下来，使用一毫升注射器，从1.5毫升锥形管中绘制出PBMC和肿瘤细胞混合的600微升。将注射器连接到插入管上，打开夹子，然后慢慢填充，直到液体到达管子的末端。将入口管的自由端连接到 TI 板，然后继续轻轻加载剩余的体积。完成后关闭入口夹。拆下单毫升注射器，将入口管连接到注射器泵。将出口管固定到干净的 1.5 毫升锥形管中，以收集细胞。将注射器泵的流量调整为每分钟 0.09 毫升。使用 TI 板运行平台将 TI 板向注射器泵侧倾斜约 30 度。小心地松开入口管上的夹子。启动注射器泵，仔细观察 TI 板的填充情况。一旦 TI 板完全充满，在清空时，朝相反方向倾斜约 30 度。当液体中的所有细胞都在 1.5 毫升锥形收集管中时，停止泵。要清洗 TI 板，请断开入口管与注射器泵的连接，然后将其连接到装满 600 微升 FBS 的一毫升注射器。填充，直到 FBS 完全加载。然后断开注射器，将管子连接到注射器泵上。将注射器泵的流量调整为每分钟 0.49 毫升。松开入口夹，运行 TI 板，将洗涤液收集在同一 1.5 毫升锥形管中。轻拂或轻按 TI 板的整个时间，以帮助分离和分离任何粘附的细胞，因为板清空。断开收集 1.5 毫升锥形管与 TI 板设置的连接。在台式微浮子中旋转收集管，在 250 次 G 下旋转 8 分钟，然后丢弃上一液。为了进行PBMC与抗原的隔夜共育，首先在两毫升透明RPMI中重新暂停PBMC和肿瘤细胞颗粒，并辅以15%的自体小鼠血清。然后在35毫米非组织培养处理无菌盘中的板细胞，并在标准组织培养条件下孵育过夜。第二天，用组织培养刮刀小心地从盘子底部分离出任何粘附细胞。刮擦时旋转盘子，确保细胞收集均匀。将细胞收集在15毫升的管子中。将两毫升 PBS 加入盘中，然后重复刮擦步骤，将细胞收集到同一管中。用一毫升 PBS 冲洗 35 毫米的盘子，然后将冲洗添加到同一管中。在标准组织培养离心机中旋转250倍-G，10分钟收集细胞。小心地移液关闭上流液，然后轻拂管子以重新暂停颗粒。该疗法显示，在100多只治疗小鼠与对照小鼠相比，YUMM1.7肿瘤生长减少，在两年内进行的9次独立实验的累积肿瘤生长数据中观察到。单个动物在一个实验中具有代表性的肿瘤生长曲线提供了系统中的变异感。当单细胞或血小板从PBMC分数中耗尽时，或当板通道被省略时，不再观察到治疗效果。在没有免疫细胞或抗原来源的情况下，或在存在不匹配的抗原的情况下，如使用MC38结肠癌细胞治疗的YUMM1.7肿瘤，治疗无效。对于免疫结果，也至关重要的是避免PBMC接触8甲氧丙酮。FACS分析，在新鲜分离的PBMC、TI处理的PBMC、无板通道的TI处理的PBMC、板通过前耗尽的血小板或上述两者之间，人类CD11c+细胞中相应IgG控制物指示标记的变化表明，直流激活取决于PBMC和TI板通道中血小板的存在。TI 激活的人类DC可以有效地处理和交叉呈现肽抗原，或从整个8-甲氧丙酸暴露的人类肿瘤细胞的抗原，以TI和血小板依赖的方式激活人类抗原特异性T细胞系。T细胞反应的特异性取决于加工后抗原的来源。在诱导抗癌免疫时，必须对每一个癌细胞系的凋亡进行滴定，以最大限度地提高免疫原性。由于诱导免疫将特定于免疫抗原，详细解剖每个系统将是可能的。每个实验或临床癌症，以及每种抗菌反应，都将具有独特的信息。每个人类癌症都有自己的肿瘤特异性抗原阵列。PhDC 对肿瘤抗原进行必要的分选和呈现，无需事先进行实验室鉴定。请记住，8-MOP 和 UVA 光是致癌物质。在操作 8-MOP 和使用 UVA 光源时，请使用适当的防护设备并遵循安全程序。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

科研

免疫与感染

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

小鼠骨髓来源的树突状细胞与跟踪研究的Qdot纳米晶的生成及标签

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

小鼠肺树突状细胞的分离

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

制备肿瘤抗原负载成熟树突状细胞免疫治疗

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

隔离和免疫淋巴细胞和树突状细胞的小鼠Peyer氏斑

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

使用黑色素瘤和鳞状癌干细胞生成新型支气干细胞疫苗

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

从人类胸腺髓样树突状细胞和上皮细胞的分离

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

性T细胞Transinfection从树突状细胞捕捉细菌

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

不成熟，成熟和耐受性树突状细胞的生成与代谢不同表型

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

从全血人单核细胞来源的树突状细胞的生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...