Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-NCI spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center støtte tilskud 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Howard Hughes Medical Institute uddannelse stipendium (A. Vassall); og NY kardiel Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Der blev ydet delvis støtte af R01 CA196660-01 til M. Bosenberg.
Forfatterne er taknemmelige for Dr. Robert Tigelaar for hans mentorordning, vejledning og eksperimenterende indsigt. Vi takker vores kolleger hos Fraunhofer IBMT, især Dr. Thorsten Knoll, for at udvikle og levere ECP-ækvivalent TI kammer. Nicholas Theodosakis venligt hjulpet med indledende stadier af YUMM eksperimenter. Vi takker vores frivillige bloddonorer, Inger Christensen og hendes professionelle personale på Yale ECP Treatment Center for hjælp med frivillige blod indkøb. Dr. Wendell Yarbrough og Dr. Natalia Issaeva venligt delt med os SCC61 og SCC61-E6/7 cellelinjer. For teknisk assistance på projektet, takker vi Dr. Julia Lewis for FACS protokol rådgivning, og E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote på Yale FACS Core. Film billeder af celler i TI-pladen blev erhvervet med assistance fra Felix Rivera-Molina, PhD, dept of Cell Biology og Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Filmproduktion blev overvåget af Andrew Osborne, Senior video producer, Office of Communications, Yale School of Medicine.

Alle de muse metoder, der er beskrevet her, er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Yale University efter aftale med de nationale institutter for dyresundheds retningslinjer. Alle humane undersøgelser blev udført med blod doneret af raske frivillige, med skriftligt informeret samtykke. Humane blod studier blev gennemført i overensstemmelse med anerkendte etiske retningslinjer (f. eks. Helsingfors-erklæringen, CIOMS, Belmont Report, usa's fælles regel) og blev godkendt af Yale Human Investigational Review Board under protokolnummer 0301023636.
Bemærk: Følgende er den protokol, der beskriver transimmunization for anti-tumor terapi af mus murinsynogene tumorer.
1. syngeneic YUMM 1.7 tumor implantation
<ol><li>Følg etablerede protokoller for at implantatet murinsynogene tumorer i flankerne af mus, som er passende til tumor cellelinje af interesse. Bemærk: Protokollen nedenfor beskriver YUMM 1.7 C57BL/6 mus melanom tumor model. YUMM 1.7 melanom celler blev venligt leveret af Dr. Bosenberg, Yale18.</li>
	<li>
Optøning af en frossen alikvot celle og brug celler efter en celle passage. Kultur frisk optøet YUMM 1.7 celler i Dulbecco's modificerede Ørnens næringsstof blanding F-12 medium (DMEM/F12), suppleret med 10% varme inaktiveret føtal bovin serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin og 1% ikke-essentielle aminosyrer, under standard vævs dyrkningsbetingelser (37 °C, 5% CO2).
	<ol>
<li>Der opsamles YUMM 1.7 celler ved 60 \ u201270% sammen løb ved tilsætning af tilstrækkeligt trypsin-EDTA til at dække bunden af celle dyrknings pladen eller-kolben (f. eks. 4 mL til en T75 kolbe).</li>
		<li>Hvil cellekulturen fartøjer ved stuetemperatur for 3 \ u20124 min, forsigtigt at trykke på bunden eller siderne af beholderen lejlighedsvis for at hjælpe med at løsne cellerne.</li>
		<li>Der tilsættes 1 mL føtal kvægserum (FBS) pr. 4 mL trypsin-ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) for at standse reaktionen, når de fleste celler er løsrevet. Saml cellerne ved at pipette ind i et 15 mL konisk rør. Kolben skylles med fosfat-bufferet saltvand (PBS), og skylningen tilsættes det samme opsamlings glas. Fyld røret til 15 mL med PBS.</li>
		<li>Tag en lille alikvot og Tæl cellerne.</li>
		<li>Spin ned i 10 min ved 250 x g i en standard vævskultur centrifuge til at indsamle tumorceller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der resuspenderes YUMM 1.7 celler i PBS ved densitet 1 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Injicer 1 x 105 yumm 1,7 tumorceller subkutant i 100 μl PBS i højre flanker af recipient 4 til 6-ugers vildtype mandlige C57BL/6j mus, bedøvet i henhold til institutionelle retningslinjer (f. eks. 3 \ u20125% isofluran inhalation gas, anæstesi bekræftet af manglende Hind pote knivspids refleks).</li>
	<li>Monitor tumorvolumen via bi-ugentlige målinger af vinkelret tumor diametre og højde ved hjælp af en caliper. Beregn YUMM 1.7 (tumorvolumen som tumor længde x bredde x højde)/2.</li>
	<li>Initiere transimmunization terapi, når tumorer bliver bare håndgribelig; for YUMM 1.7 tumorer, dette er normalt dag 7 \ u201210 post tumor implantation.</li>
</ol>2. indsamling af perifert blod Mononuclear celler til Transimmunization
<ol><li>Saml 100 \ u2012150 μL blod fra hver tumor-bærende mus via kind blødning.</li>
	<li>Efterhånden som der opsamles blod, pooles blod fra hver mus behandlingsgruppe (hver 5 eksperimentelle mus + 5 kontrolmus) i et enkelt 15 mL rør, der indeholder 5.000 U/mL heparin. Brug 10 μL 10% heparin pr. 100 μL blod indsamlet. Bemærk: Bland røret hyppigt under samlingen for at undgå blodets koagulation. Mens kontrol tumor-bærende mus kan afblødes på samme tid som de eksperimentelle mus, for at sikre lige betingelser med behandlingsgruppen, "kontrol" blod kan enten kasseres, eller kombineret med blod i behandlingsgruppen til at give yderligere Eksperimentel PBMC for behandlingsgruppen efter investigatorernes skøn.</li>
	<li>Indstil 1 15 mL rør med 4 mL lymfocyt isolations medium (Se tabellen over materialer) pr. 5 \ u201210 musene bløder. Langsomt lag blod (indsamlet fra tumor-bærende mus) på toppen af mediet. Spin cellerne i 20 min ved 1000 \ u20121, 500 x g for at adskille PBMC fra røde blodlegemer.</li>
	<li>Ved centrifugering opsamles det øverste plasma lag, og ~ 0,5 mL forbliver over Buffy Coat, og opbevares ved 4 °C til senere brug (trin 7,1).</li>
	<li>Saml Buffy coat-laget i et rent 15 mL-rør, fyld med PBS til 15 mL, og spin i 10 minutter ved 250 x g i en standard vævskultur centrifuge for at indsamle PBMC.</li>
	<li>Forsigtigt pipetoff supernatanten, og resuspension af pellet ved at flimre røret. Må ikke decant, da pellet er blød og kan gå tabt. Tilsæt 2 mL ACK røde blodlegemer lysis buffer (Se tabellen over materialer) til røret for at fjerne eventuelle resterende røde blodlegemer fra PBMC. Inkube på is i 10 min.</li>
	<li>Fyld røret med PBS til 15 mL, og drej ned i 10 min ved 250 x g i en standard vævskultur centrifuge for at indsamle PBMC.</li>
	<li>Forsigtigt pipetoff supernatanten, og resuspension af pellet ved at flimre. Må ikke decant, da pellet er blød og kan gå tabt. Bemærk: På dette trin kan den rensede PBMC ændres, så den passer bedst til eksperimentet. De forskellige PBMC komponenter (trombocytter, monocytter, andre immuncelle typer) kan være udtømt eller isoleret fra PBMC efter behov. Også, PBMC selv kan udsættes for 8-MOPA, enten før eller efter punkt 4 (før eller efter plade passage — efter punkt 2 eller før punkt 5), ved at følge protokol trin 3.3 \ u 20123.8 og erstatte PBMC for yumm 1.7 celler. Dette vil afkorte den immunogeniske kapacitet af behandlingen, og i stedet fremme immun tolerance.</li>
	<li>For hver behandlingsgruppe (hver 5 eksperimentelle mus + 5 kontrolmus) skal PBMC-pillen resuspenderes i 300 μL FBS.</li>
</ol>3.8-MOP/UVA behandling af tumor celler
<ol><li>Kultur og indsamle YUMM 1.7 tumorceller som beskrevet i trin 1.2-1.3 at forberede en 8-MOPA-eksponeret tumor celle antigen kilde.</li>
	<li>Forbered 2,5 x 106 yumm 1.7 tumorceller pr. behandlingsgruppe af 5 mus. For hver behandlingsgruppe skal tumor celle pellet resuspenderes i FBS ved 2,5 x 106 celler/300 μl (~ 8,33 x 106 celler/ml).</li>
	<li>Med vævskultur hætte lamper slukket, tilsæt 8-MOP (Se tabellen over materialer) til yumm 1.7 tumor cellesuspension til en endelig 8-MOP koncentration af 100 ng/ml. Forsigtig: 8-MOP er et foto aktivatable DNA-skadeligt middel og carcinogen. Vær forsigtig, når du håndterer og dispenserer, undgå kontakt med eksponeret hud, og kassér korrekt.</li>
	<li>Bland cellerne godt, wrap celle beholderen i tin folie, og inkuleere i 20 min ved 37 °C.</li>
	<li>Pre-coat en 12-brønd vævskultur plade ved at fylde en brønd for hver behandlingsgruppe af 5 mus (2,5 x 106 yumm 1.7 tumorceller) med 1 ml FBS, og køle fyldt plade i 20 min ved 4 °C.</li>
	<li>Tænd for UVA-lyskilden for at forvarme den. Forsigtig: UVA-lys er et kræftfremkaldende stof. Når du arbejder med UVA lyskilder arbejde hurtigt og forsigtigt, beskytte huden mod eksponering, og bruge ansigt skjolde eller beskyttelsesbriller til at beskytte ansigt og øjne.</li>
	<li>Efter 20 min. skal du flytte den nedkølede 12-brønd plade (trin 3,5) til vævs kulturens hætte, fjerne FBS fra brønde og tilføje 300 μL (2,5 x 106 celler/BRØND) MOP-eksponerede tumorceller (fra trin 3,4) pr. brønd.</li>
	<li>Den celle holdige plade eksponerer den forvarmede UVA-lyskilde for total bestråling på 4 J/cm2. Bemærk: Den 8-MOP koncentration og UVA dosis er beskrevet her er kalibreret til YUMM 1.7 tumor cellelinje. En titrering af 8-MOP/UVA dosis, tilstrækkelig til at forårsage 100% tumor celledød inden for 1 uges eksponering, bør udføres for hver eksperimentel tumor cellelinje, for at bestemme effektiv drab dosis. Dette er af afgørende betydning for mus in vivo ti eksperimenter, fordi cellerne er geninvesteres retroorbitalt (trin 6,1) og dermed eventuelle ubeskadigede tumorceller kan ellers danne øjen tumorer i det behandlede dyr. Som en retningslinje, 4 \ u20128 J/cm2 af UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, er det typiske effektive område for de fleste tumorcellelinjer.</li>
	<li>Saml 8-MOPA-behandlede tumorceller fra hver brønd, hvirvlende pladen og pipettering omhyggeligt for at sikre komplet celle opsving.</li>
</ol>4. TI plade passage af celler
<ol><li>For hver behandlingsgruppe med 5 mus kombineres i ét 1,5 mL konisk rør 300 μL af den relevante PBMC (fra trin 2,11) og 300 μL af 8-MOPA-behandlede tumorceller (fra trin 3,9). Bland cellerne.</li>
	<li>Brug en 10 mL sprøjte til at fylde "indgangs"-og "exit"-sæt af TI-slanger (Se Tabel over materialer) med FBS. Åbn slange klemmerne for at fylde rørene, og luk klemmerne, når rørene er fyldt, før du frakobler sprøjten, for at fastholde FBS inde i slangen.</li>
	<li>Brug en P1000-pipette til at tilføje PBMC-og tumor celle blandingen (fra trin 4,1) til TI-pladen (Se tabellen over materialer). Hold pladen i en 45° vinkel, Anbring pipettespidsen sikkert i ti-pladens indtag, og fyld pladen langsomt, og undgå bobler.</li>
	<li>Fjern pipettespidsen fra indtaget, før pipette stemplet slippes. Pladen indeholder 450 μL; tilbage de resterende celler til 1,5 mL konisk rør.</li>
	<li>Der inkubereres FBS-fyldte slanger, den celle fyldte TI-plade og det 1,5 mL koniske rør, der indeholder de resterende celler i vævs kulturens inkubator ved 37 °C i 1 h. Efter inkubation tømmes TI slangen ved tyngdekraften og frigiver klemmerne.</li>
	<li>Brug en P1000-pipette til at fjerne celler fra TI-pladen ved at indsætte pipettespidsen med stemplet trykket ind i plade porten. Hold pladen i en 45° vinkel, og fyld pipettespidsen på P1000. Placer cellerne tilbage i deres originale 1,5 mL koniske tube.</li>
	<li>For at køre TI-pladen skal du slutte udgangs røret til pladen og fastgøre TI-pladen i det system, der kører på pladen.</li>
	<li>Brug en 1 mL sprøjte til at tegne 600 μL PBMC og tumor celle blanding fra 1,5 mL konisk rør, slippe af med eventuelle bobler i sprøjten, fastgør sprøjten til indgangsrøret med klemmen åben og fyld langsomt indtil væsken når enden af slangen.</li>
	<li>Fastgør den frie ende af indgangsrøret til TI-pladen, og Fortsæt med forsigtigt at indlæse den resterende lydstyrke. Luk indgangs klemmen.</li>
	<li>Tag 1 mL-sprøjten ud, og Tilslut indgangs slangen til sprøjtepumpen. Fastgør udgangs slangen til et rent 1,5 mL konisk rør til celle opsamling.</li>
	<li>Indstil sprøjte pumpens strømningshastighed til 0,09 mL/min, men start ikke pumpen endnu. Drej TI-pladen ~ 30° mod sprøjtens pumpe side ved hjælp af en ti-pladens løbe platform eller på anden måde (f. eks. en lille flad genstand i den ene ende af pladen).</li>
	<li>Slip forsigtigt klemmen på indgangs slangen. Start sprøjtepumpen, observere omhyggeligt, hvordan TI pladen fylder, og svirp slange eller plade efter behov, hvis eventuelle luftbobler hæmme strømmen.</li>
	<li>Når TI-pladen er helt fyldt, skal den vippes ~ 30° i modsat retning, når den tømmes. Når alle cellerne og væsken er i 1,5 mL konisk opsamlings slange, skal pumpen stoppes.</li>
	<li>For at vaske TI-pladen skal du frakoble indgangs slangen fra sprøjtepumpen, tilslutte en 1 mL sprøjte fyldt med 600 μL FBS og følge proceduren for trin 4.8 \ u 20124.9.</li>
	<li>Indstil sprøjte pumpens strømningshastighed til 0,49 mL/min, frigør indgangs klemmen, og Kør TI-pladen som beskrevet i trin 4.12 \ u 20124.13, og opsamler vasken i det samme 1,5 mL koniske rør. Svip eller tryk forsigtigt på TI-pladen hele tiden for at hjælpe med at løsne og eluere eventuelle vedsiddende celler.</li>
	<li>Drej samlingen 1,5 mL konisk rør i den stationære mikrofuge ved 250 x g i 8 min. kassér supernatanten.</li>
</ol>5. klargøring af autologt muse serum til overnight kultur medium
<ol><li>Saml blod fra 10 \ u201212 uge gamle C57BL/6J mus ved enhver institutionsmæssigt godkendt metode (f. eks. øjen blødning, hale vene blødning, kind blødning, eller Terminal udblødning ved hjerte punktering), uden nogen antikoagulantia. Det anslås, at der indsamles 1 mL blod for hver 300 μL serum. Bemærk: Man ville have brug for 300 μL serum for hver behandlingsgruppe af 5 mus i forsøget.</li>
	<li>Lad blodet størkne natten over ved 4 °C.</li>
	<li>Spin ned det koagulerede blod ved 3.000 x g i 15 min. omhyggeligt indsamle det øverste serum-holdige lag Bemærk: Serum kan anvendes med det samme til at gøre den overnight celle inkubation medium (trin 6,1), eller bevaret for fremtidige eksperimenter. For at bevare serum, fryse i aliquoter ved-20 °c.</li>
</ol>6. overnattende Co-inkubation af PBMC med antigen
<ol><li>Resuspender PBMC og tumor celle pellet (trin 4,5) i 2 mL klar RPMI med 15% autologt muse serum (fremstillet i trin 5). Plade i en steril skål med 35 mm ikke-vævskultur, og inkuperes natten over under normale vævs dyrkningsbetingelser (37 °C, 5% CO2). Bemærk: Hvis PBMC anvendes sammen med et ikke-cellulært antigen (peptid, nanopartikel, protein osv.), udelades afsnit 3 i protokollen, og der fortsættes fra punkt 2 direkte til punkt 4, hvilket tilføjer det ønskede antigen til TI-pladen-overført PBMC til overnatning Co-inkubation her i trin 6,1.</li>
	<li>På den følgende dag skal du forsigtigt fjerne alle vedsiddende celler fra bunden af skålen med en vævskultur skraber, dreje skålen, mens du skraber for at sikre en jævn celle opsamling. Saml cellerne i et 15 mL rør.</li>
	<li>Tilsæt 2 mL PBS til skålen og Gentag skrabning trin, indsamle cellerne i samme rør. Skyl 35 mm skålen med 1 mL PBS og tilsæt skylningen til det samme rør.</li>
	<li>Spin i 10 min ved 250 x g i en standard vævskultur centrifuge for at indsamle cellerne. Forsigtigt pipetoff supernatanten og resuspension af pellet ved at flimre røret. Må ikke decant, da pellet er blød og kan gå tabt.</li>
</ol>7. re-injektion af TI-behandlede celler i tumor-bærende mus
<ol><li>Spin ned autologt plasma (fremstillet i trin 2,4) ved 750 x g i 15 minutter til sediment alle partikler. Opslæb celle pillen (fra trin 6,4) i 600 μL autologt plasma eller PBS.</li>
	<li>Injicer celler ved 100 μl pr. mus i den retroorbitale plexus af passende bedøvet (f. eks. 3 \ u20125% isoflurane inhalation gas, anæstesi bekræftet af manglende Hind pote knivspids refleks) tumor bærende eksperimentelle mus. Hvis det ønskes, re-injicere kontrol tumor bærende mus med 100 μL autologt plasma alene, eller PBS.</li>
	<li>For YUMM 1.7 tumor-bærende mus, Gentag behandlingen (trin 2 – 7.2) to gange om ugen i 3 uger, for i alt 6 behandlinger. Saml og Behandl PBMC fra tumor-bærende mus ugentligt (protokol sektioner 2 \ u20124) om mandagen og torsdage, og re-infuse efter overnight inkubation (protokol afsnit 5 \ u20127) på tirsdage og fredag. Bemærk: Dette behandlingsregime blev udviklet til den specifikke vækst kinetik af YUMM 1.7 tumorer hos mus. Det kan være nødvendigt at titreres til andre tumor systemer med langsommere eller hurtigere tumorvækst rater-henholdsvis øge eller reducere antallet af behandlinger.</li>
	<li>Monitor tumorvolumen via bi-ugentlige måling-fortrinsvis på tidspunktet for terapi administration (tirsdag og fredag)-af vinkelret tumor diametre og højde ved hjælp af en caliper. Afslut eksperimentet, når kontrol tumor volumener når maksimal størrelse tilladt af institutionelle retningslinjer og protokoller.</li>
</ol>8. protokol tilpasning til behandling af Ssmå mængder humant blod
<ol><li>Tilpas protokollen til brug med humane celler ved først at isolere PBMC fra humant blod. Brug heparin som antikoagulerende, med enhver foretrukken PBMC-isolations protokol.</li>
	<li>Sørg for, at den isolerede PBMC-fraktion indeholder et fysiologisk antal blodplader for at opnå de bedste protokol resultater. Monitor trombocyttal præ-og post-PBMC isolation ved hjælp af en standard hæmatologi tæller.</li>
	<li>Hvis du bruger en menneskelig cellulær antigen kilde, skal du behandle de humane antigen celler efter de trin, der er beskrevet i punkt 3 for YUMM 1.7-celler. Der titreres med 8-MOP-og UVA-doser i overensstemmelse hermed.</li>
	<li>Udfør de trin, der er beskrevet i afsnit 4, ved hjælp af op til 3 x 107 PBMC per ti plade.</li>
	<li>Kultur PBMC natten over med cellulære/andre antigen valg, som beskrevet i afsnit 6, men erstatte 15% humant AB serum til autologt muse plasma til natten kulturmedium i trin 6,1.</li>
	<li>Brug de resulterende celler i enhver ønsket assay. For eksempel, co-kultur med antigen-reaktive T-celler til at observere antigen-specifikke T-celle respons initieret af TI-behandlede celler.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

Yale University ejer patenter, der stammer fra den dendritiske celle forskning af Prof. Richard Edelson, som er blevet licenseret til en Yale-opstartsvirksomhed, Transimmune AG. Richard Edelson og Michael Girardi er videnskabelige konsulenter til Transimmune AG, mens Olga Sobolev er en Transimmune AG medarbejder. Transimmune AG ikke har nogen nuværende kommercielle produkter, men på et samarbejde grundlag det producerer Transimmune plader, der anvendes i denne artikel. Det er muligt, at disse tre forfattere potentielt kunne drage fordel af kommercialisering af disse opdagelser i fremtiden.

Den miniaturiserede anordning og protokol beskrevet ovenfor for første gang giver mulighed for effektiv laboratorieundersøgelse af mekanismerne i ECP i mus eksperimentelle systemer, og i små humane blodprøver. Dette er et stort fremskridt; for eksempel, det gav os mulighed for at demonstrere for første gang effekten af transimmunization mod solide tumorer i en mus model 11, åbne den fremtidige mulighed for en lignende anvendelse i menneskelig onkologi.
Forud for udviklingen af den transimmunization enhed og metode, der er beskrevet her, var det umuligt fuldt ud at undersøge alle aspekter af ECP. I musemodeller, selv om 8-MOPet aspekt af behandlingen kunne replikeres noget ved at behandle celler i en Petri skål12,20, der var ingen kapacitet til at integrere i den metode, pladen passage, som har vist sig at giver dynamiske trombocytinteraktioner, som er af afgørende betydning for ECP'S fysiologiske DC-aktivering14. I humane studier, alternativt, flow komponenten var fuldt til stede, men evnen til selektivt eksponere specifikke cellulære komponenter til 8-MOPA, eller for at beskytte dem mod det, manglede21,22. Dette forhindrede den fulde forståelse af ECP mekanisme, og dens optimering for immunitet eller tolerance. Desuden er den mængde blod, der kræves for at arbejde med det kliniske ECP-apparat, stor og hæmmer den videnskabelige undersøgelse. Den miniaturiserede ECP enhed og protokol beskrevet her for første gang giver mulighed for effektiv, fuldt fleksibel og tunable laboratorie ECP modellering. Hertil kommer, at TI-pladen giver mulighed for real-time visualisering og overvågning af celle interaktioner inden for pladen ved mikroskopi.
For protokollens succes ved hjælp af både in vivo og ex vivo systemer, er det afgørende, at den behandlede PBMC indeholder monocytter, der kan aktiveres i funktionelle DCs. For at denne aktivering kan fortsætte, er det også nødvendigt at sikre, at PBMC-brøken indeholder et fysiologisk antal raske, aktivatable trombocytter, og at TI-pladens passage protokol følges nøje. For at dirigere de nyligt aktiverede DCs mod en specifik reaktivitet skal de være forsynet med antigen. Vi har konstateret, at den mest effektive metode til antigen levering for anti-cancer immunitet er overnight Co-inkubation af de nyligt aktiverede DCs med antigen-holdige 8-MOPA-eksponerede tumorceller. Dette har den ekstra fordel at være i stand til at skabe en immunogen anti-cancer respons uden at det nødvendiggør forudgående kendskab til tumor antigener, ved at tillade DCs at vælge dem. Men i tilfælde, hvor antigenet er kendt, vi havde en vis succes i ex vivo-systemer, når du bruger gratis peptider som antigener i co-inkubation. For immunogeniske anvendelser skal DCs selv beskyttes moden eksponering på 8 MOP. Endelig, i in vivo eksperimenter, er det vigtigt at arbejde med en dyremodel, der er i stand til anti-tumor immunitet. Transimmunization virker ved at skabe aktiverede, antigen-specifikke DCs, som arbejder i kroppen til at initiere medfødt og adaptiv immunrespons. Nedsat aktivitet eller mangel på NK-, CD4-eller CD8 T-celler i den behandlede mus vil påvirke protokollens effekt5,11.
Mens den protokol, der er beskrevet her, er en proof-of-princip en, der er blevet optimeret til en mus solid murinsynogene tumor model, det alligevel afslører mange muligheder. Mekanismerne i ECP i onkologi er kun lige blevet belyst, og der er stadig meget plads til bedre forståelse. Mere bredt, evnen til at generere fysiologisk aktiveret mus og humane DCs, og selektivt dirigere dem mod antigen-specifikke immunitet har mange potentielle anvendelser ud over kræft. Evnen til at gøre det samme, men i stedet dirigere DCs mod antigen-specifikke tolerance, som det foreslås af tolerizing effekten af ECP selv, har også vidtrækkende medicinske implikationer. Med denne metode, håber vi at give de værktøjer og åbne en produktiv Avenue af forskning for alle med en interesse i fysiologisk DC behandlinger.

Extracorporeal foto kemoterapi (ECP) er en etableret immunterapi, der er bredt operativt i universitetscentre over hele verden. Dens anvendelse er blevet drevet af unikke selektivitet, sikkerhed, og tovejs effekt af ECP terapi, egenskaber, som ECP deler med det fysiologisk immunsystem selv, som det ser ud til at partner. ECP er selektivt immuniserende mod de maligne celler i kutan T-celle-lymfom (ctcl)1,2, og selektivt tolerizing for målrettede antigener i transplantation, autoimmunitet, og graft-versus-Host disease (gvhd) indstillinger 3 af , 4. ecp's immunogenicitet fremhæves ved sin afhængighed af et intakt CD8 T-celle segment i ctcl5, mens specificitet afspejles i ecp's meget gunstige bivirkningsprofil, uden immunsuppression i transplantation eller GvHD-indstillinger og ingen øget opportunistisk infektions følsomhed i CTCL, hvor ikke-patogene T-celle kloner potentielt kan gå tabt sammen med de maligne T-celler.
I betragtning af den kliniske betydning af ECP, håb om, at en bedre forståelse af sine mekanismer kan udvide ECP'S terapeutiske rækkevidde til et bredere spektrum af kræft og immunologiske lidelser har stimuleret international interesse. To nationalt godkendte workshops, en National Institutes of Health (NIH) State-of-The-Science Symposium6 og en American Society for Aperesis konsensuskonference7, blev gennemført og rapporteret, med henblik på at fremskynde identifikation af de vigtigste cellulære bidragydere til ECP'S anti-cancer og tolerogene virkninger.
Til dato, på trods af talrige offentliggjorte rapporter forsøger at løse ECP'S mekanisme, to primære forhindringer har hæmmet videnskabelige fremskridt. For det første er undersøgelsen af ECP-mekanismerne i forsøgslaboratoriet blevet begrænset af manglen på en miniature-ECP-enhed, der fuldt ud afspejler ECP'S cellulære og in vivo-virkninger og gælder for dyremodeller. For det andet er dybdegående laboratorieanalyse af ECP-prøver i den kliniske indstilling blevet begrænset af den begrænsede tilgængelighed af ECP-behandlede patient immunceller, som kræver adgang til behandlingscentre, og er desuden underlagt tidspunktet for patientens infusioner, og det etiske behov for kompromisløs sæt af patient-reinfbrugt leukocytter.
For at løse de forhindringer, der hæmmer udviklingen af ECP-forskning, satte vi os for at udvikle et miniature-ECP-apparat, der mest efterligner de centrale elementer i terapien. Standard ECP behandling involverer passage af en patients leukaferese-beriget leukocytter gennem en 1 mm-tyk, ultraviolet et lys (UVA)-transparent, plastik plade6,8. I pladen udsættes leukocytterne for 8-methoxypsoralen (8-MOP), et foto-aktivatable stof, som ved UVA-eksponering transitært omdannes til en reaktiv form (8-MOPa), som er i stand til at gennemføre DNA-krydsbinding via dets bivalente bindinger til pyrimidin-baser på søster DNA-tråde9,10. Behandlede, 8-MOPA-behandlede leukocytter opsamles og returneres intravenøst til patienten.
Da ECP selv er en bi-directional terapi, immunisering i kræft og tolerizing i transplantation, autoimmunitet og GvHD indstillinger, for afklaring vi har navn lagt model ECP'S immunisering mode "transimmunization", og den tolerogene mode "transtolerization". Vi fokuserede først på transimmunization-modalitet. Vores nyligt rapporterede miniature skalerbare mus-til-mand ECP enhed, transimmunization (ti) kammer eller plade, og den tilsvarende protokol, gengive både cellulære og in vivo effekter af den menneskelige ECP enhed i en kræft indstilling11.
For at gøre transimmunization in vivo model så klinisk relevant som muligt, vi indledte immunterapi efter subkutant injicerede murinsynogene mus tumorer blev håndgribelig, og dermed teste protokollens effektivitet i etablerede kræft. På samme måde som ECP i ctcl, den proof-of-princip transimmunization protokol i yumm 1.7 model af melanom bruger perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra tumor-bærende dyr. Cellerne passerer gennem TI-pladen under strømning. Mens 8-MOPen behandling af celler i miniature kammeret er mulig, er det at foretrække at gennemføre det separat, for at sikre, at kun den ønskede celletype er udsat for 8-MOPa. Tidligere undersøgelser indikerer, at ECP'S tolerogene virkning medieres af 8-MOPA-skadede antigen-præsenterer celler12, mens den immuniserende effekt kræver 8-MOPen skade på måltumor cellerne11. I transimmunization protokol enten tumorceller, eller immunceller, kan selektivt udsættes for 8-MOPA efter behov. Da maksimering af kontakttiden mellem 8-MOPA-skadede tumorceller og ECP-induceret dendritiske celler (DC) har vist sig at øge den immunotherapeutiske kapacitet af klinisk ECP13, vi indarbejdet en overnatning Co-inkubation skridt ind i vores protokol. Efter overnatning inkubation returneres de behandlede celler til det tumor bærende dyr.
Dette system pålideligt reduceret tumorvækst og initieret specifik anti-tumor immunitet i mus med etablerede murinsynogene tumorer11, og tillod os at dissekere mekanismen af ecp's kliniske anti-tumor effektivitet. I flere undersøgelser har vi påvist, at ECP immunitet initieres gennem ex vivo trombocytaktivering i ti-pladen14,15. Aktiverede trombocytter signalerer efterfølgende monocyt-til-dendritisk celle modning14, hvilket fører til produktion af fysiologisk DCS. De nydannede monocyte-afledte DCs er i stand til at kryds præsentere internaliserede antigener fra 8-MOPA-beskadigede tumorceller for at aktivere antigen-specifikke T-celle respons16. Som foreslået tidligere12,17, dog, 8-MOPA-induceret skade af den spirende DCS selv kan modvirke eller endda vende den anti-tumor effekt11, hvilket giver en mekanistisk link til ECP tolerance.
TI-pladen er også blevet brugt til at fremstille fysiologisk aktiverede DCs fra humant PBMC. På samme måde som muse undersøgelserne er de humane TI-afledte DCs-produkter afhængige af plade passage i nærværelse af blodplader til deres generation, forekommer phenotypiske identiske med dem, der produceres i den kliniske ECP-plade, og er i stand til effektivt at behandle og Cross-præsentation af humane tumor antigener til aktivering af humane T-celler11,16.
I afdække mekanismen af ECP immunterapi, har vi derfor afdækket en metode til hurtigt at generere fysiologisk mus og menneskelige dendritiske celler af ønsket antigen specificitet, der kan funktionelt moduleret. Den innovative TI enhed og protokol har betydelig potentiel betydning inden for ECP forskning og terapi og kræft immunterapi mere bredt, og i alle andre områder med interesse i fysiologisk, funktionelle dendritiske celler i enten immuniserende eller den tolerizing modalitet. Vi håber, at denne publikation vil give dem, der har interesse i sådanne forskningsområder, de nødvendige værktøjer.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

Ekstrudorporeal foto kemoterapi (ECP) er en udbredt kræft immunterapi for kutan T-celle-lymfom (CTCL), operative i over 350 universitetscentre på verdensplan. Mens ECP'S kliniske effekt og eksemplariske sikkerhedsprofil har været drivkraften bag den udbredte anvendelse, er det fortsat en udfordring at belyse de underliggende mekanismer, til dels på grund af manglende laboratorie-ECP-model. For at overvinde denne forhindring og skabe en enkel, brugervenlig platform for ECP-forskning, udviklede vi en nedskaleret version af den kliniske ECP leukocyt-behandlingsenhed, velegnet til arbejde med både musemodeller og små humane blodprøver. Denne anordning kaldes Transimmunization (TI) kammer eller plade. I en række skelsættende eksperimenter, den miniature enhed blev brugt til at producere en cellulær vaccine, der regelmæssigt initieret terapeutisk anti-cancer immunitet i flere murinsynogene mus tumormodeller. Ved at fjerne individuelle faktorer fra det eksperimentelle system og fastslå deres bidrag til in vivo anti-tumorrespons, vi derefter belyst centrale mekanistiske førere af ECP immuniserende potentiale. Kollektivt, vores resultater afslørede, at anti-tumor effekter af ECP initieres af dendritiske celler (DC), fysiologisk genereret gennem blod monocyt interaktion med blodplader i ti-pladen, og lastet med antigener fra tumorceller, hvis apoptotiske celle døden fintitreres fint ved udsættelse for det fotoaktivatable DNA-kryds linende middel 8-methoxypsoralen og UVA-lys (8-MOPA). Når det returneres til musen, denne cellulære vaccine fører til specifikke og overførbare anti-tumor T celle immunitet. Vi efterprøvede, at TI kammer er også egnet til humant blodbehandling, producerer humane DCs fuldt sammenlignelig i aktiveringstilstand og profil til dem, der stammer fra det kliniske ECP kammer. Protokollerne præsenteret her er beregnet til ECP undersøgelser i mus og mand, kontrolleret generation af apoptotiske tumorceller med 8-MOPA, og hurtig produktion af fysiologisk menneskelige og mus monocyte-afledte DCS for en bred vifte af applikationer.

Vi har for nylig udviklet en mus-til-mand skalerbar miniature ECP enhed, TI pladen (figur 1a), og designet tilsvarende behandling protokoller. Enheden og protokollen gengiver centrale cellulære og in vivo funktioner af immuniserende ECP, kaldet "transimmunization".
Den proof-of-princip murine transimmunization protokol11 (figur 1b) består af ekstraor poreal ti plade passage af perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra tumor-bærende mus sammen med apoptotiske 8-MOPA– eksponeret tumorceller. Især TI kammer er transparent og dimensioneret til at matche standard mikroskopi slideformat, hvilket giver mulighed for nem visualisering af celle interaktioner i TI-pladen på ethvert punkt i protokollen (video 1). De TI-plade aktiverede immunceller inkurueres natten over med 8-MOPA-eksponerede apoptotiske tumorceller, hvilket letter tumor cellernes optagelse, behandling og overførsel af tumor antigener til DCS. Den følgende dag returneres den Co-inkuerede celle blanding til blodstrømmen fra det tumor bærende dyr. Kontrol dyr gennemgår identiske blod indsamlingsprocedurer, at normalisere for eventuelle virkninger af lymdepletering på tumorvækst, men i stedet modtage PBS re-infusioner. Tumor vækst i alle dyr overvåges gennem hele eksperimentet.
I undersøgelser ved hjælp af yumm 1.7 murinsynogene murine melanom model18, transimmunization protokollen blev gentaget to gange ugentligt over tre uger, for i alt seks behandlinger i hvert dyr (figur 1b). Behandlingen syntes veltolereret i alle behandlede dyr (> 100), og konsekvent viste reduktion af YUMM 1.7 tumorvækst i behandlede versus kontrol dyr, som observeret i 9 uafhængige eksperimenter udført over 2 år (figur 2a, B). Resultaterne viser kumulative tumorvækst data i transimmunization-behandlet og kontrol dyr over alle udførte eksperimenter (figur 2a), samt repræsentative tumorvækst kurver for de enkelte dyr i et eksperiment, for at give en fornemmelse af variabilitet i systemet (figur 2b).
Vi fandt, at protokollen succes kritisk afhænger af tilstedeværelsen af monocytter i den behandlede PBMC, tilstedeværelsen af blodplader i PBMC fraktion, og TI plade passage trin. Når plade passagen udelades, eller når enten blodplader eller monocytter er opbrugt fra PBMC-fraktionen, observeres den terapeutiske virkning ikke længere (figur 3a). Behandlingen kræver også tilstedeværelsen af apoptotiske tumorceller. Det er ineffektiv i fravær af enten immunceller eller en antigen kilde, eller i nærværelse af uoverensstemmende antigen, for eksempel når mus med YUMM 1.7 tumorer behandles ved hjælp af MC38 Colon karcinom celler (figur 3b). For et immuniserende udfald er det også afgørende at undgå PBMC eksponering for 8-MOPA. 8-MOPA-eksponeret PBMC ikke kun abrogat, eller måske endda omvendt, anti-tumor immunitet (figur 3c), men også hæmme immuniserende potentiale af ueksponerede celler, som i forsøget, hvor et tilsvarende antal 8-MOPA-eksponeret og 8-MOP A-beskyttet PBMC blev anvendt uden observerbar anti-tumor effekt (figur 3c).
Med humant PBMC fører TI-kammeret og transimmunization-protokollen til vellykket monocyt-aktivering til DC, der ikke kan skelnes fra celleoverfladen og intracellulære aktiverings markører fra det, der opnås ved den kliniske ECP-plade (tabel 1). Som i mus undersøgelser, DC aktivering (figur 4a) og evnen til transimmunization-genererede DCS til at behandle og præsentere antigen (figur 4b,C) kritisk afhænge af tilstedeværelsen af blodplader i PBMC, og på ti plade passage. De Transimmunization-aktiverede humane DCs kan effektivt behandle og kryds præsentere enten peptidantigener (figur 4b) eller antigener fra hele 8-MOPA-eksponerede humane tumorceller for at aktivere humane antigen-specifikke T-cellelinjer in vitro (figur 4c), i en ti-og trombocytafhængig måde (figur 4b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> Figur 1: Transimmunization (ti) kammer og protokol skemaer. A) diagram og specifikationer for behandlings kammeret til transimmunization (ti-pladen). (B) skematisk beskrivelse af transimmunization behandling eksperimentel arbejdsgang. Kort sagt, dyr podes subkutant (s.c.) med murinsynogene tumorceller; dyr med håndgribelig tumorer behandles to gange ugentligt ved blod lodtrækningen, isolation af PBMC fra blodet, PBMC flow passage gennem den autologe trombocytagede ti-plade i nærværelse af 8-MOP/UVA-behandlede tumorceller, PBMC og tumor celle Co-inkubation natten over, og injektion af cellerne intravenøst i de samme tumor bærende dyr. Tumor volumen måles under hele eksperimentet. Dette tal er blevet ændret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> Figur 2: transimmunization styrer væksten af yumm 1.7 melanom murinsynogene tumorer. (A) yumm 1.7 tumorvolumen over tid plottet for C57BL/6 mus inokuleret med 1 x 105 yumm 1.7 tumorceller, og modtager enten seks transimmunization behandlinger (sort linje), eller seks kontrolbehandlinger (grå linje). Data er kumulative over ni uafhængige eksperimenter gennemført over to år. (B) data fra en enkelt repræsentativ yumm 1.7 transimmunizaton eksperiment, med hver linje, der viser tumorvækst for en individuel mus. (A og B) "PBS kontrol" mus i alle eksperimenter blev blødte på samme tidsplan som forsøgsdyr, men fik seks sterile PBS re-infusioner. Fejllinjer repræsenterer SEM, p-værdier beregnet for hvert tidspunkt ved hjælp af Sidaks multiple sammenligningstest. * *, p = 0,0013; , s < 0,0001. Dette tal er blevet ændret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> Figur 3: Transimmunization kræver monocytter og blodplader i TI plade-bestået PBMC fraktion, samt 8-MOPa behandling af antigen-matchede tumorceller og 8-MOPen sparring af PBMC. (A) yumm 1.7 tumorvolumen over tid afbildet for C57BL/6 mus inokuleret med 1 * 105 yumm 1.7 tumorceller, og modtager enten seks transimmunization behandlinger (solide sorte linjer), seks kontrolbehandlinger (massive grå linjer), eller seks ti behandlinger hvor monocytter eller trombocytter blev udtømt fra PBMC før pladens passage trin (med henholdsvis a-CD11b og a-CD41 depleteringssæt), eller plade passagen blev udeladt (punkterede linjer). (B) tumorvolumen over tid plottet for C57BL/6 mus inokuleret med 1 x 105 yumm 1.7 tumor celler, og modtager enten seks transimmunization behandlinger (solide sorte linjer), seks kontrolbehandlinger (massive grå linjer), PBMC alene (stiplet linje), 8- MOPa-behandlet yumm 1.7 celler alene, eller ti ved hjælp af 8-MOPa-behandlede MC38 tumorceller (stiplede linjer). (C) tumorvolumen over tid afbildet for C57BL/6 mus inokuleret med 1 x 105 yumm 1.7 tumor celler, og modtager enten seks transimmunization behandlinger (solide sorte linjer), seks kontrolbehandlinger (massive grå linjer), seks ti behandlinger, hvor PBMC blev jævnt eksponeret for 8-MOPa umiddelbart før plade passagen, seks ti behandlinger, hvor PBMC blev jævnt eksponeret for 8-MOPA umiddelbart efter plade passagen, eller seks behandlinger, hvor ti-celler efter plade passagen blev blandet 1:1 med et tilsvarende antal PBMC, der er blevet jævnt eksponeret for 8-MOPA bestråling (stiplede linjer). (A, B og C) "PBS kontrol" mus i alle eksperimenter blev blødte på samme tidsplan som forsøgsdyr, men fik seks sterile PBS re-infusioner. Der gives oplysninger om repræsentative eksperimenter. Søjler repræsenterer SEM, P-værdier beregnet for hvert tidspunkt ved hjælp af Sidaks multiple sammenligning test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , s < 0,001; , s < 0,0001; NS = forskelle ikke signifikant. Dette tal er blevet ændret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> Figur 4: TI-protokollen med TI-kammer inducerer hurtigt JÆVNSTRØMS modning, unik aktiverings profil og T-celle aktiverings kapacitet i humant PBMC, afhængig af plade passage og blodplader. A. FACS analyse af de indikerede markører i CD11c+ celler blandt enten nyligt isoleret humant PBMC ("kontrol"), PBMC behandlet med ti-protokollen ("TI") eller ti-behandlet PBMC, hvor plade passagen blev udeladt, blev trombocytterne opbrugt ved hjælp af a-CD41 Bead kit før pladen passage, eller begge af ovenstående blev udført. Data opsummerer seks uafhængige eksperimenter med tre bloddonorer. Søjler repræsenterer middelværdier, mens fejllinjer repræsenterer SEM. P-værdier for hver sammenligning beregnet ved hjælp af en parret t-test. *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Paneler er blevet ændret fra11. B. trombocythæmmende eller trombocytdepleteret, ti-behandlet humant PBMC blev co-inkueret natten over med et IRRELEVANT (SIINFEKL) peptid eller med langt peptid til hoved-og hals pladecellekarcinom-associeret HPV E7-protein. PBMC blev derefter brugt til at stimulere en human CD8 T cellelinje specielt reaktiv til E7 peptid. T-celle stimulation blev målt ved IFNg-produktion efter 5 dages kultur. (C) trombocytholdige eller trombocytdepleterede, ti-behandlede humane PBMC blev co-inkuruteret natten over med 8-MOPA-behandlet hoved-og-hals pladecellekarcinom cellelinje SCC61, enten udtrykker (SCC61 HPV E6/7) eller ikke udtrykker (SCC61 ingen HPV ) de anti geniske HPV E6-og E7-proteiner19. PBMC blev derefter brugt til at stimulere en human CD8 T cellelinje specielt reaktiv til E7 peptid. T-celle stimulation blev målt ved IFNg-produktion efter 5 dages kultur. (B og C) Data viser repræsentative eksperimenter med tre replikater i hver. Søjler repræsenterer middelværdier, mens fejllinjer repræsenterer SEM. P-værdier for hver sammenligning, der beregnes ved hjælp af Sidaks multiple sammenligningstest. , s < 0,001; , s < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Markør</td>
			<td>Parameter</td>
			<td>Ubehandlet</td>
			<td>ECP-plade med TI-protokol</td>
			<td>TI-plade med TI-protokol</td>
			<td>p-værdi ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100,1 ± 42,4</td>
			<td>439,8 ± 152,5</td>
			<td>417,7 ± 152,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3,9 ± 1,1</td>
			<td>22,3 ± 7,2</td>
			<td>24,5 ± 7,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>53,3 ± 9,7</td>
			<td>51,4 ± 17,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,8 ± 1,7</td>
			<td>103,9 ± 23,4</td>
			<td>87,1 ± 17,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>Af PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54,5 ± 12</td>
			<td>721,4 ± 183,6</td>
			<td>528,7 ± 135,5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12,2 ± 1,6</td>
			<td>179,6 ± 28,5</td>
			<td>192,5 ± 25,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53,6 ± 25,7</td>
			<td>97,1 ± 31,6</td>
			<td>103,8 ± 32,8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,6 ± 0,5</td>
			<td>70,1 ± 6,7</td>
			<td>55,2 ± 8,9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,7 ± 0,4</td>
			<td>39,1 ± 7,2</td>
			<td>41,5 ± 4,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>28,0 ± 8,8</td>
			<td>35,3 ± 11,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3,6 ± 0,3</td>
			<td>124,3 ± 25,4</td>
			<td>141,8 ± 33,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (nektin 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,9 ± 1,8</td>
			<td>47,3 ± 5,2</td>
			<td>50,9 ± 9,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,1 ± 2,6</td>
			<td>2,2 ± 1,4</td>
			<td>1,8 ± 1,1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2,9 ± 1,5</td>
			<td>1,0 ± 0,4</td>
			<td>1,2 ± 0,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: ti-protokol med ti-kammer inducerer hurtigt jævnstrøms modning svarende til den, der induceres af ti-protokollen med det kliniske ECP-kammer. FACS-analyse af ændring af de indikerede markører fra tilsvarende IgG-Kontroller i levende humane CD11c + celler blandt enten nyligt isoleret PBMC ("ubehandlet"), PBMC passeret gennem den kliniske ECP-plade efter TI-protokollen ("ECP-plade med TI-protokol") og analyseres efter natten inkubation, eller PBMC behandlet med TI-protokollen ("TI-plade med protokol") og analyseres efter natten inkubation. For markører, såsom HLA-DR, hvor hele celle populationen blev ændret, udtrykkes data som ændring i gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI). For markører, hvor kun et undersæt af celler udtrykker markøren, såsom CCL2, er forskellen i procent markør-positive celler i live CD11c + PBMC i stedet repræsenteret. Data opsummerer seks uafhængige eksperimenter med tre bloddonorer. Data for hver markør udtrykkes som gnsn-alder ± standardfejl i middelværdien (SEM). P-værdier for hver sammenligning beregnet ved hjælp af parret t-test; NS = forskelle ikke signifikant. Tabellen er blevet ændret fra11.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> Video 1: levende celle billeder af trombocyttal og immuncelle interaktioner inden for TI-pladen. PBMC blev fremstillet som beskrevet i protokol afsnit 2 ovenfor og eksponeret for transimmuniserings pladen som beskrevet i punkt 4, bortset fra at den statiske inkubationsperiode i trin 4.2.3 blev reduceret fra 1 til 30 min. Under TI-protokollen blev TI-pladen, som er identisk i størrelse med et standard mikroskop-dias, monteret i et fluorescens billedbehandlingssystem, og cellerne i den blev indhyldet ved 40xforstørrelse og ved 37 °C under plade fyldningen (4.2.2 ), plade inkubation (4.2.3) og plade flow (4.3.5) etaper. Kontinuerlige billeder blev anskaffet og film produceret ved hjælp af "automatiseret scanning rutine" software. Billedteksterne under videoen angiver det stadie i protokollen, som cellerne bliver filmet på. Pile og cirkler i videoen, med de tilhørende billedtekster, påpeger de celler og områder af interesse. Den 10 μM skala bar er til stede i nederste højre hjørne i hele videoen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Den transimmunization (ti) enhed eller plade og relaterede protokoller er blevet udviklet til at replikere de vigtigste funktioner i ekstraor poreal foto kemoterapi (ECP), i en eksperimentel indstilling, giver mulighed for produktion af fysiologisk aktiveret, tunbar dendritiske blodlegemer (DCs) til kræft immunterapi.

Ny protokol til generering af fysiologisk Immunogenisk dendritiske celler

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Fysiologiske dendritiske antigen-præsenterende celler, kaldet PhDC, er immun master-switches, som indleder antigen-specifikke T-celle immunitet og tolerance. Dette papir afgrænser en effektiv metode til produktion af PhDC. Klinisk brug af dendritiske celler hæmmes af de ikke-fysiologiske cytokinmetoder, der anvendes til at fremstille dem.Vores metode overvinder dette problem via effektiv trombocyt signalering af monocyt-til-DC konvertering hos mennesker og mus. Disse PhDC er ikke afhængige af cytokin betingelser utilgængelige in vivo, så de kan generere potente kliniske anti-tumor T-celle reaktioner hos både mennesker og mus med etablerede kræftformer. Arts-uafhængige trombocyt initiering af monocyt-til-phDC modning har bred eksperimentel anvendelighed.PhDC tillade dissektion af dendritisk celle fysiologi, lette induktion af terapeutisk anti-cancer immunitet over for immunogene kræftformer, og tilbyde løfte om personlig antimikrobiel vaccination. Dette eksperimentelle system er nyt, og flere aspekter af det, såsom belægning af plastkammeret, tumorcellebehandling med 8-MOP/UVA, flowbetingelser og frigivelse af monocytter er bedst visuelt repræsenteret. At demonstrere proceduren vil være Eve Robinson, en tekniker fra mit laboratorium.For at indsamle perifere blodmonukleare celler, først oprettet en 15-milliliter rør med fire milliliter lymfocyt isolation medium pr fem til 10 mus blødte. Derefter langsomt lag blod indsamlet fra tumor-bærende mus på toppen af mediet. Drej cellerne ved 1, 000-til 1, 500 gange-G i 20 minutter for at adskille PBM'er fra røde blodlegemer.Ved afslutningen af centrifugering, indsamle det øverste plasma lag, forlader 0,5 milliliter resterende over buffy pels, og opbevares på fire grader Celsius til senere brug. Dernæst indsamle buffy pels lag i en ren 15-milliliter rør fyldt med PBS til 15 milliliter, og spin på 250-gange-G i en standard væv kultur centrifuge i 10 minutter for at indsamle PBMC. Ved afslutningen af centrifugering, omhyggeligt pipette off supernatant og svirp røret til at resuspend pellet.Derefter tilsættes to milliliter ACK røde blodlegemer lysis buffer til røret for at fjerne eventuelle resterende røde blodlegemer fra PBMC. Inkuber PBMC på is i 10 minutter. Fyld røret med PBS til 15 milliliter, og drej ned ved 250 gange G i en standard vævskultur centrifuge i 10 minutter for at indsamle PBMC.Pipetter forsigtigt supernatanten af og svirp røret for at løsne pellet. Opsplitet pellet i 300 mikroliter af FBS. For at forberede YUMM1.7 tumorceller pr behandlingsgruppe, først resuspend tumor celle pellet i FBS på 2,5 millioner celler pr 300 mikroliter.Med væv kultur hætte lys slukket, tilføje 8-methoxypsoralen for en endelig koncentration på 100 nanogram per milliliter til YUMM1.7 tumor celle suspension. Dernæst blandes cellerne, pak cellebeholderen i folie og inkuberes ved 37 grader Celsius i 20 minutter. For at forcoate en 12-brønd vævskulturplade tilsættes en milliliter FBS til en brønd for hver behandlingsgruppe på fem mus og opbevares i køleskab ved fire grader Celsius i 20 minutter.Efter 20 minutter, under en vævskultur hætte, fjerne FBS fra brøndene, og tilsæt 300 mikroliter af methoxypsoralen-eksponerede tumorceller per brønd. Udsæt derefter den celleholdige plade for den forvarmte ultraviolette en lyskilde til total bestråling af fire joule pr. kvadratcentimeter. At indsamle 8-methoxypsoralen/UVA-behandlede tumorceller fra hver brønd, hvirvle pladen og pipette omhyggeligt for at sikre fuldstændig cellegendannelse.For at udføre transimmunisering plade passage for hver behandling gruppe af fem mus, kombinere 300 mikroliter af de relevante PBMC og 300 mikroliter af 8-methoxypsoralen/UVA-behandlede tumorceller i en 1,5-milliliter konisk rør og bland cellerne. Åbn derefter indgangen og udgangsslangklemmerne på TI-pladen. Brug en 10-milliliter sprøjte til at fylde TI slangen med FBS, lukke klemmer som slangen er fyldt for at bevare FBS inde i slangen.Afbryd sprøjten. Anfør en P1000 pipettespids sikkert ind i TI-pladeindtaget. Hold pladen i en 45-graders vinkel og fyld pladen langsomt med PBMC og tumorcelleblanding, undgå bobler.Fjern pipettespidsen fra indtaget, før pipettestempset slippes. De resterende celler returneres til det koniske rør på 1,5 milliliter. Inkuber den FBS-fyldte slange, den cellefyldte TI-plade og det koniske 1,5 milliliterrør, der indeholder de resterende celler i vævskulturkubvøsen ved 37 grader Celsius i en time.Efter inkubationen slippes klemmerne og Tømme TI-slangen med tyngdekraften. Sæt derefter en P1000 pipettespids ind med stemplet trykket ned i pladeporten for at fjerne cellerne fra TI-pladen. Hold pladen i en vinkel på 45 grader, og fyld P1000-pipettespidsen.Placer cellerne tilbage i deres oprindelige 1,5-milliliter koniske rør. For at køre TI-pladen skal du tilslutte udgangsrøret til pladen og fastgøre TI-pladen ind i det plader kørende system. Dernæst ved hjælp af en en-milliliter sprøjte, udarbejde disse 600 mikroliter af PBMC og tumor celle mix fra 1,5-milliliter konisk rør.Fastgør sprøjten til indgangsrøret med klemmen åben, og fyld langsomt, indtil væsken når enden af slangen. Fastgør den frie ende af indgangsrøret til TI-pladen, og fortsæt forsigtigt med at lægge den resterende lydstyrke. Luk indgangsklemmen, når du er færdig.Afrul en millilitersprøjten, og tilslut indgangsslangen til sprøjtepumpen. Fastgør udgangsslangen til et rent 1,5 milliliter konisk rør til cellesamling. Juster sprøjtepumpens strømningshastighed til 0,09 milliliter i minuttet.Vip TI-pladen ca. 30 grader mod sprøjtepumpesiden ved hjælp af en TI-plade, der kører platformen. Slip forsigtigt klemmen på indgangsslangen. Start sprøjtepumpen, og understÃ nge, hvordan TI-pladen fyldes.Når TI-pladen er helt fyldt, vippes den ca. 30 grader i den modsatte retning, når den tømmes. Når alle cellerne i væsken er i det koniske 1,5 milliliteropsamlingsrør, skal pumpen stoppes. For at vaske TI-pladen skal du tage indgangsslangen ud af sprøjtepumpen og slutte den til en en millilitersprøjt fyldt med 600 mikroliter FBS.Fyld, indtil FBS er fuldt lastet. Afbryd derefter sprøjten og fastgør slangen til sprøjtepumpen. Juster sprøjtepumpens strømningshastighed til 0,49 milliliter i minuttet.Slip indgangsklemmen, og kør TI-pladen, og opsaml vasken i det samme koniske rør på 1,5 milliliter. Svirp eller bank forsigtigt på TI-pladen hele tiden for at hjælpe med at løsne og elutere eventuelle klæbende celler, når pladen tømmes. Tag samlingen 1,5 milliliter konisk rør ud af TI-pladeopsætningen.Drej opsamlingsrøret i bænkepladens mikrofuge ved 250 gange G i otte minutter, og kassér supernatanten. For at udføre natten co-inkubation af PBMC med antigen, først resuspend pbmc og tumor celle pellet i to milliliter klar RPMI suppleret med 15% autolog mus serum. Derefter plade celler i en 35-millimeter ikke-væv-kultur behandlet steril skål, og inkubere natten over under standard væv kultur betingelser.Den følgende dag, omhyggeligt løsrive eventuelle klæbende celler fra bunden af skålen med en væv kultur skraber. Drej skålen, mens skrabning for at sikre jævn cellesamling. Cellerne opsamls i et 15-milliliterrør.Tilsæt to milliliter PBS til skålen, og gentag skrabetrinnet, der samler cellerne i samme rør. Skyl 35-millimeter skålen med en milliliter PBS, og tilsæt skylningen til samme rør. Spin ved 250 gange-G i en standard vævskultur centrifuge i 10 minutter for at indsamle cellerne.Forsigtigt pipette off supernatant, derefter svirp røret til at resuspend pellet. Behandlingen viste reduktion af YUMM1.7 tumorvækst i mere end 100 behandlede versus kontrol mus, som observeret i den kumulative tumorvækst data af ni uafhængige eksperimenter udført over to år. De repræsentative tumorvækstkurver for de enkelte dyr i et eksperiment giver en følelse af variation i systemet.Når enten monocytter eller blodplader er forarmet fra PBMC fraktion, eller når pladepassagen udelades, observeres den terapeutiske virkning ikke længere. Behandlingen er ineffektiv i mangel af enten immunceller eller et antigen kilde, eller i overværelse af et uoverensstemmende antigen, såsom YUMM1.7 tumorer behandlet ved hjælp af MC38 kolon karcinom celler. For en immunisering resultat, Er det også afgørende at undgå PBMC eksponering for 8-methoxypsoralen.FACS-analyse af ændringen af de angivne markører fra tilsvarende IgG-kontroller i humane CD11c+celler blandt enten nyisolerede PBMC, TI-behandlet PBMC, TI-behandlet PBMC uden pladepassagen, forarmede blodplader før pladepassagen eller begge ovenstående viste, at DC-aktivering afhænger af tilstedeværelsen af blodplader i PBMC og af TI-pladepassagen. De TI-aktiverede humane DC'er kan effektivt behandle og krydsforsive enten peptidantigener eller antigener fra hele 8-methoxypsoralen-eksponerede humane tumorceller for at aktivere humane antigenspecifikke T-cellelinjer i in vitro-assays på en TI- og trombosafhængig måde. Specificiteten af T-celleresponser afhænger af kilden til de forarbejdede antigener.Når inducere anti-cancer immunitet, apoptose af hver kræftcelle linje skal titreres for at maksimere immunogenicitet. Da induceret immunitet vil være specifik for immunisering antigener, detaljeret dissektion af hvert system vil være muligt. Hver eksperimentel eller klinisk kræft, og hver antimikrobiel respons, vil være entydigt informativ.Hver enkelt human kræft har sin egen vifte af tumor-specifikke antigener. PhDC udføre den nødvendige sortering og præsentation af tumor antigener, uden at kræve deres forudgående laboratorieidentifikation. Vær opmærksom på, at 8-MOP og UVA lys er kræftfremkaldende.Brug passende beskyttelsesudstyr, og følg sikkerhedsprocedurerne ved håndtering af 8-MOP, og når der arbejdes med UVA-lyskilder.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering af Mouse Lung dendritiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Fremstilling af tumorantigen-loaded dendritiske celler til immunterapi

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolering og immunfarvning Lymfocytter og dendritiske celler fra murine Peyerske plaks

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generation af en ny dendritisk-celle vaccine ved hjælp af melanom og squamous cancer stamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Capture bakterier ved Transinfection fra dendritiske celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generering af Umodne, Modne og tolerogeniske dendritiske celler med forskellige Metabolic fænotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...