Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Ce travail a été appuyé par NIH-NCI spore Grant 1 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center support Grant 3 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); la bourse de formation de l’Institut médical Howard Hughes (A. Vassall); et la Fondation cardiaque de New York (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Le soutien partiel a été fourni par R01 CA196660-01 à M. Bosenberg.
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Robert Tigelaar pour son mentorat, ses conseils et ses connaissances expérimentales. Nous remercions nos collègues de la Fraunhofer IBMT, en particulier le Dr Thorsten Knoll, pour avoir développé et fourni la chambre TI équivalente à l’ECP. Nicholas THEODOSAKIS a gentiment aidé avec les étapes initiales des expériences YUMM. Nous remercions nos donneurs de sang bénévoles, Inger Christensen et son personnel professionnel au centre de traitement de Yale ECP pour obtenir de l’aide en matière d’approvisionnement en sang bénévole. Dr. Wendell Yarbrough et le Dr Natalia Issaeva aimablement partagé avec nous les lignées cellulaires SCC61 et SCC61-E6/7. Pour l’assistance technique sur le projet, nous remercions le Dr Julia Lewis pour les conseils du protocole FACS, et E. menet, G. Tokmoulina, C. cote à Yale FACS Core. Des images de film de cellules dans la plaque de TI ont été acquises avec l’aide de Felix Rivera-Molina, PhD, département de biologie cellulaire et Yale CINEMA Imaging Center, école de médecine de Yale. La production cinématographique a été supervisée par Andrew Osborne, producteur vidéo senior, Bureau des communications, Yale School of Medicine.

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

L’Université de Yale détient des brevets provenant de la recherche sur les cellules dendritiques du Prof. Richard Edelson qui ont été autorisés à une société de démarrage de Yale, Transimmune AG. Richard Edelson et Michael Girardi sont des consultants scientifiques de Transimmune AG, tandis qu’Olga Sobolev est une employée de Transimmune AG. Transimmune AG n’a pas de produits commerciaux courants, mais sur une base collaborative, il produit les plaques Transimmune utilisées dans cet article. Il est possible que ces trois auteurs puissent potentiellement bénéficier de la commercialisation de ces découvertes à l’avenir.

Le dispositif miniaturisé et le protocole décrits ci-dessus pour la première fois permettent une étude efficace des mécanismes de l’ECP dans les systèmes expérimentaux de souris et dans les petits échantillons de sang humain. C’est une grande avance; par exemple, il nous a permis de démontrer pour la première fois l’efficacité de la transimmunization contre les tumeurs solides dans une souris modèle 11, ouvrant la possibilité future d’une application similaire en oncologie humaine.
Avant le développement du dispositif et de la méthode de transimmunization décrits ici, il était impossible de mener une enquête complète sur tous les aspects de l’ECP. Dans les modèles de souris, bien que le 8-MOPun aspect de la thérapie pourrait être répliqué quelque peu en traitant les cellules dans une boîte de Petri12,20, il n’y avait pas de capacité à intégrer dans la méthode le passage de la plaque, qui a été montré à fournir des interactions plaquettaires dynamiques qui sont d’une importance cruciale pour l’activation physiologique de l’ECP14. Dans les études humaines, alternativement, le composant d’écoulement était entièrement présent, mais la capacité d’exposer sélectivement des composants cellulaires spécifiques à 8-MOPa, ou pour les protéger de lui, était manquant21,22. Cela a empêché la compréhension complète du mécanisme ECP, et son optimisation pour l’immunité ou la tolérance. De plus, la quantité de sang nécessaire pour travailler avec l’appareil clinique ECP est importante, ce qui entrave l’enquête scientifique. Le dispositif et le protocole ECP miniaturisés décrits ici pour la première fois permettent une modélisation de laboratoire ECP efficace, entièrement flexible et accordable. En outre, la plaque TI permet la visualisation en temps réel et la surveillance des interactions cellulaires dans la plaque par microscopie.
Pour le succès du protocole à l’aide de systèmes in vivo et ex vivo, il est essentiel que le PBMC traité contienne des monocytes qui peuvent être activés en DCs fonctionnels. Pour que cette activation se poursuive, il est également nécessaire de s’assurer que la fraction PBMC contient un nombre physiologique de plaquettes saines et activables, et que le protocole de passage de la plaque TI est suivi de près. Afin de diriger les DCs nouvellement activés vers une réactivité spécifique, ils doivent être fournis avec l’antigène. Nous avons constaté que la méthode la plus efficace de délivrance d’antigène pour l’immunité anticancéreuse est la co-incubation du jour au lendemain des DCs nouvellement activées avec des cellules tumorales à 8 MOPAexposées à l’antigène. Cela a l’avantage supplémentaire d’être capable de créer une réponse anti-cancéreuse immunogénique sans nécessiter de connaissances préalables sur les antigènes tumoraux, en permettant aux DCs de les sélectionner. Cependant, dans les cas où l’antigène est connu, nous avons eu un certain succès dans les systèmes ex vivo lors de l’utilisation de peptides libres comme antigènes dans la co-incubation. Pour les applications immunogéniques, les contrôleurs de la protection doivent eux-mêmes être protégés contre l’exposition 8-MOPA . Enfin, dans les expériences in vivo, il est important de travailler avec un modèle animal capable de l’immunité anti-tumorale. La transimmunization fonctionne en créant des DCs activés, spécifiques à l’antigène, qui travaillent dans le corps pour initier des réponses immunitaires innées et adaptatives. Une altération de l’activité ou l’absence de cellules NK, CD4 ou de T-T dans la souris traitée aura une incidence sur l’efficacité du protocole5,11.
Bien que le protocole décrit ici est une preuve de principe qui a été optimisé pour un modèle de tumeur syngénique solide de souris, il révèle néanmoins de nombreuses possibilités. Les mécanismes de l’ECP en oncologie sont seulement élucidés, et il y a encore beaucoup de place pour une meilleure compréhension. Plus largement, la capacité de générer des contrôleurs de la souris et de l’humain activés physiologiquement, et de les orienter sélectivement vers l’immunité spécifique à l’antigène a de nombreuses applications potentielles au-delà du cancer. La capacité de faire la même chose, mais plutôt de diriger les contrôleurs de domaine vers la tolérance spécifique à l’antigène, comme le suggère l’efficacité tolérante de l’ECP lui-même, a également de vastes implications médicales. Avec cette méthode, nous espérons fournir les outils et ouvrir une avenue productive de la recherche pour tous ceux qui ont un intérêt dans les thérapies de DC physiologiques.

La photochimiothérapie extracorpovraie (ECP) est une immunothérapie établie qui est largement opérante dans les centres universitaires dans le monde entier. Son utilisation a été tirée par la sélectivité unique, la sécurité, et l’efficacité bidirectionnelle de la thérapie ECP, traits que ECP partage avec le système immunitaire physiologique lui-même avec lequel il semble partenaire. ECP est immunisé sélectivement contre les cellules malignes dans le lymphome T cutané (CTCL)1,2, et tolérant sélectivement pour les antigènes ciblés dans la transplantation, l’autoimmunité, et les paramètres de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) 3 les trois , 4. l’immunogénicité de l’ECP est soulignée par sa dépendance à l’encontre d’un compartiment intact de cellules T de la CTCL5, tandis que la spécificité est reflétée par le profil de réaction indésirable très favorable de l’ECP, sans suppression immunitaire hors cible dans la transplantation ou Les paramètres de GvHD, et aucune susceptibilité d’infection opportuniste accrue dans CTCL, où les clones de cellules T non-pathogènes pourraient être perdus avec les cellules T malignes.
Compte tenu de l’importance clinique de l’ECP, l’espoir qu’une meilleure compréhension de ses mécanismes pourrait élargir la portée thérapeutique de l’ECP à un éventail plus large de cancers et de troubles immunologiques a stimulé l’intérêt international. Deux ateliers sanctionnés à l’échelle nationale, un symposium sur l’état de la science6 de l’Institut national de la santé (NIH) et une conférence de consensus de la société américaine pour l’aphérèse7ont été menés et signalés, dans le but d’accélérer le l’identification des principaux contributeurs cellulaires aux effets anti-cancer et tolérogènes de l’ECP.
À ce jour, malgré de nombreux rapports publiés tentant de s’attaquer au mécanisme de l’ECP, deux obstacles majeurs ont entravé les progrès scientifiques. Premièrement, l’étude des mécanismes de l’ECP dans le cadre du laboratoire expérimental a été limitée par l’absence de dispositif ECP miniature qui reflétait pleinement les effets cellulaires et in vivo de l’ECP et s’appliquait aux modèles animaux. Deuxièmement, l’analyse en laboratoire approfondie des échantillons d’ECP dans le milieu clinique a été restreinte par la disponibilité limitée des cellules immunitaires traitées par ECP, qui nécessitent l’accès aux centres de traitement, et sont en outre soumises au calendrier de la les infusions du patient, et le besoin éthique d’ensembles sans compromis de leucocytes réinjectée par le patient.
Pour résoudre les obstacles entravant les progrès de la recherche sur les ECP, nous avons mis au point un appareil miniature ECP qui imiterait le plus fidèlement les éléments clés de la thérapie. Le traitement standard de l’ECP implique le passage des leucocytes enrichis par la leukaphérèse d’un patient par une plaque de plastique transparente de 1 mm d’épaisseur, une lumière ultraviolette (UVA),6,8. Dans la plaque, les leucocytes sont exposés au 8-méthoxypsoralen (8-MOP), un agent photoactivable qui, à l’exposition aux UVA, est converti de façon transitoire en une forme réactive (8-MOPa), capable de relier l’ADN via sa liaison bivalente à des bases de pyrimidine sur soeur ADN brins9,10. Les leucocytes traités à8 MOP ont été collectés et retournés par voie intraveineuse au patient.
Puisque l’ECP lui-même est une thérapie bidirectionnelle, immunisant dans le cancer et tolérant dans les paramètres de transplantation, d’auto-immunité et de GvHD, pour des éclaircissements nous avons nommé le mode de vaccination du modèle ECP «transimmunization», et le mode tolérogénique «transtolerization». Nous nous sommes d’abord concentrés sur la modalité de transimmunization. Notre dispositif d’ECP de souris à homme évolutif miniaturisé récemment rapporté, la chambre ou la plaque de transimmunization (TI), et le protocole correspondant, reproduisent à la fois les effets cellulaires et in vivo du dispositif ECP humain dans un milieu cancéreux11.
Afin de rendre le modèle de transimmunization in vivo aussi cliniquement pertinent que possible, nous avons initié l’immunothérapie après que les tumeurs syngéniques de souris synthétisées par voie sous-cutanée se sont devenues palpables, testant ainsi l’efficacité du protocole dans le cancer établi. De même que dans la CTCL, le protocole de transimmunization de la preuve de principe dans le modèle YUMM 1.7 du mélanome utilise des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant d’animaux porteurs de tumeurs. Les cellules sont transmises par la plaque de TI sous le flux. Alors que le 8-MOPun traitement des cellules dans la chambre miniature est possible, il est préférable de le conduire séparément, pour s’assurer que seul le type de cellule désiré est exposé à 8-MOPa. Des études antérieures indiquent que l’effet tolérogène de l’ECP est médié par des cellules de 8-MOPa-présentant des antigènes blessés12, alors que l’effet immunisant nécessiteune lésion de 8-MOP de cellules tumorales cibles11. Dans le protocole de transimmunization, soit les cellules tumorales, soit les cellules immunitaires, peuvent être exposées sélectivement à 8-MOPA au besoin. Étant donné que la maximisation du temps de contact entre les cellules tumorales de 8-MOPa-blessées et les cellules dendritiques induites par l’ECP (DC) a été montrée pour améliorer significativement la capacité immunothérapeutique du PCE13clinique, nous avons incorporé une nuit étape de co-incubation dans notre protocole. Après une incubation de nuit, les cellules traitées sont retournées à l’animal porteur de tumeurs.
Ce système a réduit de façon fiable la croissance tumorale et a initié une immunité anti-tumorale spécifique chez les souris avec des tumeurs syngéniques établies11, et nous a permis de disséquer le mécanisme de l’efficacité clinique anti-tumorale de l’ECP. Dans plusieurs études, nous avons démontré que l’immunité aux ECP est initiée par l’activation plaquettaire ex vivo dans la plaque de TI14,15. Les plaquettes activées signalent ensuite la maturation des cellules monocytes-dendritiques14, conduisant à la production de DCS physiologiques. Les nouveaux DCs dérivés des monocytes sont capables de croiser les antigènes internalisés des cellules tumorales endommagées par le 8-MOP pour activer les réponses des lymphocytes T spécifiques àl'antigène16. Comme on l’a suggéré précédemment12,17, cependant, 8-MOPA-induit des dommages de la DCS naissante eux-mêmes peuvent contre-agir ou même inverser l’effet anti-tumoral11, fournissant un lien mécaniste à la tolérance de l’ECP.
La plaque TI a également été utilisée pour produire des DCs activés physiologiquement à partir de PBMC humain. De même que pour les études sur la souris, les DCs dérivées de TI humaines dépendent du passage de plaques en présence de plaquettes pour leur génération, apparaissent phénotypiquement identiques à celles produites dans la plaque clinique ECP, et sont capables de traiter efficacement et antigènes tumoraux humains croisés pour l’activation des lymphocytes T humains11,16.
En découvrant le mécanisme de l’immunothérapie ECP, nous avons donc découvert une méthode pour générer rapidement la souris physiologique et les cellules dendritiques humaines de la spécificité de l’antigène désiré, qui peuvent être modulées de façon fonctionnelle. Le dispositif et le protocole TI innovants ont une importance potentielle substantielle dans les domaines de la recherche et de la thérapie et de l’immunothérapie du cancer de l’ECP plus largement, et dans tout autre domaine présentant un intérêt pour les cellules dendritiques physiologiques et fonctionnelles, soit dans la vaccination, soit dans la modalité tolérante. Nous espérons que cette publication fournira les outils nécessaires à ceux qui s’intéressent à ces domaines de recherche.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

La photochimiothérapie extracorpovraie (ECP) est une immunothérapie du cancer largement utilisée pour le lymphome T cutané (CTCL), opérant dans plus de 350 centres universitaires dans le monde entier. Alors que l’efficacité clinique et le profil de sécurité exemplaire de l’ECP ont entraîné son utilisation généralisée, l’élucidation des mécanismes sous-jacents est resté un défi, en partie en raison de l’absence d’un modèle de laboratoire ECP. Pour surmonter cet obstacle et créer une plate-forme simple et conviviale pour la recherche ECP, nous avons développé une version réduite du dispositif de traitement des leucocytes de l’ECP clinique, adapté pour le travail avec les deux modèles de souris, et les petits échantillons de sang humain. Ce dispositif est appelé la chambre de Transimmunization (TI), ou la plaque. Dans une série d’expériences marquantes, le dispositif miniaturisé a été utilisé pour produire un vaccin cellulaire qui a régulièrement initié l’immunité thérapeutique anticancéreuse dans plusieurs modèles de tumeurs syngéniques de souris. En supprimant les facteurs individuels du système expérimental et en vérifiant leur contribution à la réponse anti-tumorale in vivo , nous avons ensuite élucidé les principaux moteurs mécanistes du potentiel immunisant des ECP. Collectivement, nos résultats ont révélé que les effets anti-tumoraux de l’ECP sont initiés par les cellules dendritiques (DC), générées physiologiquement par l’interaction des monocytes sanguins avec les plaquettes dans la plaque TI, et chargées avec des antigènes de cellules tumorales dont la cellule apoptotique la mort est finement titrés par exposition à l’agent de réticulation de l’ADN photoactivable 8-méthoxypsoralen et la lumière UVA (8-MOPA). Lorsqu’il est retourné à la souris, ce vaccin cellulaire conduit à une immunité spécifique et transférable de cellules T anti-tumorales. Nous avons vérifié que la chambre TI est également appropriée pour le traitement du sang humain, produisant des DCs humains entièrement comparables dans l’état d’activation et le profil à ceux dérivés de la chambre clinique ECP. Les protocoles présentés ici sont destinés à des études d’ECP chez la souris et l’homme, la génération contrôlée de cellules tumorales apoptotiques avec 8-MOPA, et la production rapide de DCS humains et de souris dérivées de monocyte pour une variété d’applications.

Nous avons récemment développé un appareil ECP miniature évolutif de la souris à l’homme, la plaque TI (figure 1a) et conçu des protocoles de traitement correspondants. L’appareil et le protocole reproduisent les principales caractéristiques cellulaires et in vivo de la vaccination des ECP, appelées «transimmunization».
Le protocole de transimmunization murin11 (figure 1b) de la preuve de principe consiste en un passage de la plaque extracorporelle TI de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir de souris porteuses de tumeurs ainsi que d’apoptotiques 8-MOPA– exposés cellules tumorales. En particulier, la chambre TI est transparente et dimensionnée pour correspondre au format standard de la glissière de microscopie, ce qui permet une visualisation aisée des interactions cellulaires au sein de la plaque TI à n’importe quel point du protocole (vidéo 1). Les cellules immunitaires activées par la TI-plate sont incubées pendant la nuit avec les cellules tumorales apoptotiquesAexposées à 8 MOP, facilitant l’absorption des cellules tumorales, le traitement et le transfert d’antigènes tumoraux aux DCS. Le jour suivant, le mélange de cellules co-incubées est retourné dans le flux sanguin de l’animal porteur de tumeurs. Les animaux témoins subissent des procédures de prélèvement de sang identiques, pour normaliser les effets de la lymphodéplétion sur la croissance tumorale, mais reçoivent au lieu de cela des réinfusions de PBS. La croissance tumorale chez tous les animaux est surveillée tout au long de l’expérience.
Dans des études utilisant le mélanome de murin syngénique de la Yumm 1.7, modèle18, le protocole de transimmunization a été répété deux fois par semaine sur trois semaines, pour un total de six traitements chez chaque animal (figure 1b). La thérapie est apparue bien tolérée chez tous les animaux traités (> 100), et a constamment montré une réduction de la croissance tumorale de YUMM 1.7 chez les animaux traités versus témoins, comme observé dans 9 expériences indépendantes menées sur 2 ans (figure 2a, B). Les résultats montrent des données cumulatives de croissance tumorale chez les animaux traités par la transimmunization et témoins sur toutes les expériences réalisées (figure 2a), ainsi que des courbes de croissance de tumeurs représentatives pour les animaux individuels au sein d’une expérience, pour donner un sens de la variabilité du système (figure 2b).
Nous avons constaté que le succès du protocole dépend de façon critique de la présence de monocytes dans le PBMC traité, de la présence de plaquettes dans la fraction PBMC et de l’étape de passage de la plaque TI. Lorsque le passage de la plaque est omis, ou lorsque les plaquettes ou les monocytes sont épuisés de la fraction PBMC, l’effet thérapeutique n’est plus observé (figure 3A). Le traitement nécessite également la présence de cellules tumorales apoptotiques. Il est inefficace en l’absence des cellules immunitaires ou d’une source d’antigène, ou en présence d’antigène mal apparié, par exemple lorsque des souris porteuses de tumeurs YUMM 1.7 sont traitées à l’aide de cellules du carcinome du côlon MC38 (figure 3b). Pour un résultat immunisant, il est également essentiel d’éviter l’exposition au PBMC àla8-MOP A. 8-MOPa-exposé PBMC non seulement abrogate, ou peut-être même inverser, immunité anti-tumorale (figure 3C), mais aussi inhiber le potentiel immunisant des cellules non exposées, comme dans l’expérience où un nombre égal de 8-MOPA-exposés et 8-MOP Les PBMC protégés par un aont été utilisés sans effet antitumoral observable (figure 3C).
Avec le PBMC humain, la chambre de TI et le protocole de transimmunization conduisent à une activation réussie des monocytes dans le courant continu, indiscernable par la surface cellulaire et les marqueurs d’activation intracellulaire de celui obtenu par la plaque clinique ECP (tableau 1). Comme dans les études de souris, l’activation DC (figure 4a) et la capacité des DCS générés par la transimmunization de traiter et de présenter l’antigène (figure 4b,C) dépendent de façon critique de la présence de plaquettes dans le PBMC, et sur le passage de la plaque TI. Le DCs humain activé par la Transimmunization peut traiter et croiser efficacement des antigènes peptidiques (figure 4b) ou des antigènes de cellules tumorales humaines entières de 8-MOPa, pour activer des lignées cellulaires T spécifiques à l’antigène humain dans in vitro (figure 4C), de façon TI et dépendante des plaquettes (figure 4b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> Figure 1: schémas de chambre et de protocole de Transimmunization (TI). A) schéma et spécifications de la chambre de traitement de la transimmunization (plaque TI). B) Description schématique du processus expérimental de traitement de la transimmunization. Brièvement, les animaux sont inoculés par voie sous-cutanée (s.c.) avec des cellules tumorales syngéniques; les animaux avec des tumeurs palpables sont traités deux fois par semaine par prélèvement sanguin, l’isolement du PBMC par le sang, le passage du flux de PBMC à travers la plaque autologue de TI revêtue de plaquettes en présence de cellules tumorales traitées à 8 MOP/UVA, de PBMC et de co-incubation de cellules tumorales pendant la nuit, et réinjection des cellules par voie intraveineuse dans les mêmes animaux porteurs de tumeurs. Le volume de tumeur est mesuré tout au long de l’expérience. Ce chiffre a été modifié à partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> Figure 2: la Transimmunization contrôle la croissance des tumeurs syngéniques du mélanome de YUMM 1.7. (A) volume de tumeur Yumm 1.7 au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (ligne noire), ou six traitements de contrôle (ligne grise). Les données sont cumulatives sur neuf expériences indépendantes menées sur deux ans. (B) les données d’un seul représentant Yumm 1.7 transimmunizaton expérience, avec chaque ligne montrant la croissance tumorale pour une souris individuelle. (A et B) Les souris «PBS Control» dans toutes les expériences ont été saignées sur le même calendrier que les animaux expérimentaux, mais ont reçu six réinfusions stériles de PBS. Les barres d’erreur représentent SEM, valeurs de p calculées pour chaque point de temps en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> Figure 3: la transimmunization nécessite des monocytes et des plaquettes dans la fraction PBMC de la plaque TI, ainsi quele traitement 8-MOP de cellules tumorales appariées par l’antigène et de 8-MOPa épargnant de PBMC. (A) volume tumoral Yumm 1.7 au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 * 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), ou six traitements TI Lorsque des monocytes ou des plaquettes ont été épuisés du PBMC avant l’étape de passage de la plaque (en utilisant respectivement les kits de déplétion a-CD11b et a-CD41), ou le passage de la plaque a été omis (lignes pointillées). (B) volume tumoral au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), PBMC seul (ligne pointillée), 8- MOPa-traitée Yumm 1.7 cellules seules, ou TI en utilisant 8-MOPa-traités MC38 cellules tumorales (lignes pointillées). (C) volume tumoral au fil du temps tracé pour les souris C57BL/6 inoculées avec 1 x 105 Yumm 1.7 cellules tumorales, et recevant soit six traitements de transimmunization (lignes noires solides), six traitements de contrôle (lignes grises solides), six traitements TI où Les PBMC ont été exposés uniformément à la 8-MOPa immédiatement avant le passage de la plaque, six traitements de TI où les PBMC ont été uniformément exposés à la 8-MOP a immédiatement après le passage de la plaque, ou six traitements où les cellules TI après le passage dela plaque ont été mélangées 1:1 avec un nombre égal de PBMC qui ont été uniformément exposés à 8-MOPA irradiation (lignes pointillées). (A, B et C) Les souris «PBS Control» dans toutes les expériences ont été saignées sur le même calendrier que les animaux expérimentaux, mais ont reçu six réinfusions stériles de PBS. Des données sont fournies pour des expériences représentatives. Les barres représentent SEM, valeurs P calculées pour chaque point de temps en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = différences non significatives. Ce chiffre a été modifié à partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> Figure 4: le protocole TI avec la chambre TI induit rapidement la maturation DC, le profil d’activation unique et la capacité d’activation des cellules T dans le PBMC humain, dépendant du passage de la plaque et des plaquettes. A. FACS analyse des marqueurs indiqués dans les cellules CD11c+ parmi les PBMC humains fraîchement isolés («témoins»), les PBMC traités avec le protocole TI («TI») ou le PBMC traité parti où le passage de la plaque a été omis, les plaquettes ont été épuisées en utilisant le Kit de billes a-CD41 avant le passage de la plaque, ou les deux ci-dessus ont été effectuées. Les données résument six expériences indépendantes avec trois donneurs de sang. Les barres représentent les valeurs moyennes, tandis que les barres d’erreur représentent SEM. valeurs de P pour chaque comparaison calculée à l’aide du test t apparié; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Les panneaux ont été modifiés à partir de11. B. les PBMC humains traités à l’aide de plaquettes ou à l’épuisement des plaquettes ont été co-incubés pendant la nuit avec un peptide non pertinent (SIINFEKL), ou avec un peptide long pour la protéine HPV E7 associée au carcinome spinocellulaire de la tête et du cou. Le PBMC a ensuite été utilisé pour stimuler une lignée de cellules T humaine de 5 à 5 spécifiquement réactive au peptide E7. La stimulation des cellules T a été mesurée par la production d’IFNg après 5 jours de culture. Cles PBMC humains traités aux plaquettes ou à l’épuisement des plaquettes ont été co-incubés pendant la nuit avec une lignée cellulaire de carcinome squameux à 8 MOP A traitée àlatête et au cou SCC61, exprimant (SCC61 HPV E6/7) ou n’exprimant pas (SCC61 pas de HPV ) les protéines anti-HPV E6 et E7 antigéniques19. Le PBMC a ensuite été utilisé pour stimuler une lignée de cellules T humaine de 5 à 5 spécifiquement réactive au peptide E7. La stimulation des cellules T a été mesurée par la production d’IFNg après 5 jours de culture. (B et C) Les données montrent des expériences représentatives avec trois répétitions dans chacune. Les barres représentent les valeurs moyennes, tandis que les barres d’erreur représentent SEM. valeurs P pour chaque comparaison calculée en utilisant le test de comparaisons multiples de Sidak; , p < 0,001; , p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>marqueur</td>
			<td>paramètre</td>
			<td>non traité</td>
			<td>Plaque ECP avec protocole TI</td>
			<td>Plaque TI avec protocole TI</td>
			<td>valeur de p ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>100,1 ± 42,4</td>
			<td>439,8 ± 152,5</td>
			<td>417,7 ± 152,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3,9 ± 1,1</td>
			<td>22,3 ± 7,2</td>
			<td>24,5 ± 7,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>53,3 ± 9,7</td>
			<td>51,4 ± 17,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>10,8 ± 1,7</td>
			<td>103,9 ± 23,4</td>
			<td>87,1 ± 17,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>PLAUR</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>54,5 ± 12</td>
			<td>721,4 ± 183,6</td>
			<td>528,7 ± 135,5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>12,2 ± 1,6</td>
			<td>179,6 ± 28,5</td>
			<td>192,5 ± 25,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>53,6 ± 25,7</td>
			<td>97,1 ± 31,6</td>
			<td>103,8 ± 32,8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,6 ± 0,5</td>
			<td>70,1 ± 6,7</td>
			<td>55,2 ± 8,9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,7 ± 0,4</td>
			<td>39,1 ± 7,2</td>
			<td>41,5 ± 4,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>28,0 ± 8,8</td>
			<td>35,3 ± 11,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>3,6 ± 0,3</td>
			<td>124,3 ± 25,4</td>
			<td>141,8 ± 33,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (nectine 2)</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>10,9 ± 1,8</td>
			<td>47,3 ± 5,2</td>
			<td>50,9 ± 9,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>10,1 ± 2,6</td>
			<td>2,2 ± 1,4</td>
			<td>1,8 ± 1,1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ IFM</td>
			<td>2,9 ± 1,5</td>
			<td>1,0 ± 0,4</td>
			<td>1,2 ± 0,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1: le protocole TI avec chambre TI induit rapidement une maturation DC équivalente à celle induite par le protocole TI avec la chambre clinique ECP. L’analyse FACS du changement des marqueurs indiqués des contrôles IgG correspondants dans les cellules humaines vivantes de CD11c + parmi les PBMC fraîchement isolés («non traités»), le PBMC passe par la plaque clinique de l’ECP à la suite du protocole TI («plaque ECP avec protocole TI») et analysés après une incubation de nuit ou un PBMC traité avec le protocole TI («plaque TI avec protocole») et analysé après une incubation de nuit. Pour les marqueurs, tels que HLA-DR, où l’ensemble de la population cellulaire a été modifié, les données sont exprimées en tant que variation de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI). Pour les marqueurs où seul un sous-ensemble de cellules expriment le marqueur, tel que CCL2, la différence dans les cellules positives de marqueur de pourcentage de CD11c + PBMC en direct est à la place représentée. Les données résument six expériences indépendantes avec trois donneurs de sang. Les données pour chaque marqueur sont exprimées en tant qu’erreur normale de l’âge ± de la moyenne (SEM). Valeurs de P pour chaque comparaison calculée à l’aide d’un test t apparié; NS = différences non significatives. Le tableau a été modifié à partir de11.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> Vidéo 1: imagerie cellulaire en direct des interactions plaquettaires et des cellules immunitaires au sein de la plaque TI. Les PBMC ont été préparés comme décrit dans la section 2 du protocole ci-dessus et exposés à la plaque de transimmunization comme décrit dans la section 4, sauf que la période d’incubation statique à l’étape 4.2.3 a été réduite de 1 h à 30 min. Au cours du protocole TI, la plaque TI, qui est de taille identique à une glissière de microscope standard, a été installée dans la phase de maintien de la glissière d’un système d’imagerie par fluorescence et les cellules à l’intérieur ont été imagées à un grossissement de 40x et à 37 ° c pendant le remplissage de la plaque (4.2.2 ), l’incubation de plaques (4.2.3) et le débit des plaques (4.3.5). Des images continues ont été acquises et des films ont été produits à l’aide du logiciel «routine de numérisation automatisée». Les légendes sous la vidéo indiquent l’étape du protocole sur lequel les cellules sont filmées. Les flèches et les cercles dans la vidéo, avec les légendes associées, soulignent les cellules et les zones d’intérêt. La barre d’échelle de 10 μM est présente dans le coin inférieur droit tout au long de la vidéo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Le dispositif de transimmunization (TI) ou la plaque et les protocoles connexes ont été élaborés pour reproduire les principales caractéristiques de la photochimiothérapie extracorporeuse (ECP), dans un contexte expérimental, permettant la production de cellules dendritiques activables physiologiquement activées et réglables cellules (DCs) pour l’immunothérapie du cancer.

Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Les cellules physiologiques présentant des antigènes dendritiques, appelés PhDC, sont les commutateurs immunitaires qui initient l’immunité et la tolérance des cellules T spécifiques aux antigènes. Cet article délimite une méthode efficace pour la production de PhDC. L’utilisation clinique des cellules dendritiques est entravée par les méthodes de cytokine non physiologiques utilisées pour les produire.Notre méthode surmonte ce problème grâce à une signalisation plaquettquettique efficace de la conversion monocyte-à-DC chez l’homme et la souris. Ces PhDC ne dépendent pas des conditions de cytokine indisponibles in vivo, ainsi elles peuvent générer des réponses cliniques puissantes de cellule T d’antitumoral chez les humains et les souris avec les cancers établis. L’initiation de plaquettes indépendantes des espèces de la maturation monocyte-à-PhDC a une grande applicabilité expérimentale.PhDC permet la dissection de la physiologie cellulaire dendritique, facilite l’induction de l’immunité thérapeutique anticancéreuse aux cancers immunogènes, et offre la promesse pour la vaccination antimicrobienne personnalisée. Ce système expérimental est nouveau, et de multiples aspects de celui-ci tels que le revêtement de la chambre en plastique, le traitement des cellules tumorales avec 8-MOP / UVA, les conditions d’écoulement, et la libération de monocytes sont mieux représentés visuellement. Eve Robinson, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour recueillir les cellules mononucléaires périphériques de sang, installez d’abord un tube de 15 millilitres avec quatre millilitres de milieu d’isolement de lymphocyte par cinq à 10 souris saignées. Puis couchez lentement le sang prélevé sur des souris tumorales sur le dessus du milieu. Faites tourner les cellules à 1000 à 1500 fois G pendant 20 minutes pour séparer les PBMCs des globules rouges.À la fin de la centrifugation, recueillir la couche plasmatique supérieure, laissant 0,5 millilitres restant au-dessus de la couche buffy, et stocker à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, recueillir la couche de pelage buffy dans un tube propre de 15 millilitres rempli de PBS à 15 millilitres, et tourner à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir le PBMC. À la fin de la centrifugation, retirer soigneusement le supernatant et faire glisser le tube pour résuspendre la pastille.Ajouter ensuite deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge ACK au tube pour éliminer les globules rouges restants du PBMC. Incuber le PBMC sur la glace pendant 10 minutes. Remplissez le tube de PBS à 15 millilitres, et tournez vers le bas à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir le PBMC.Retirer délicatement le supernatant et faire glisser le tube pour desserrer la pastille. Resuspendez la pastille en 300 microlitres de FBS. Pour préparer yumm1.7 cellules de tumeur par groupe de traitement, dépensez d’abord la pastille de cellules de tumeur dans FBS à 2.5 millions de cellules par 300 microlitres.Avec les lumières de capot de culture de tissu éteintes, ajoutez 8-methoxypsoralen pour une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre à la suspension de cellules de tumeur de YUMM1.7. Ensuite, mélangez les cellules, enveloppez le récipient cellulaire dans du papier d’aluminium et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour pré-enrober une plaque de culture tissulaire de 12 puits, ajouter un millilitre de FBS à un puits pour chaque groupe de traitement de cinq souris, et réfrigérer l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Après 20 minutes, sous un capot de culture tissulaire, retirer FBS des puits, et ajouter 300 microlitres de cellules tumorales exposées au méthoxypsoralène par puits. Exposez ensuite la plaque contenant des cellules à l’ultraviolet préchauffé Une source de lumière pour une irradiation totale de quatre joules par centimètre carré. Pour recueillir les cellules tumorales traitées à 8 méthoxypsoralen/UVA de chaque puits, faites pivoter soigneusement la plaque et la pipette pour assurer une récupération complète des cellules.Pour effectuer le passage de plaque de transimmunisation pour chaque groupe de traitement de cinq souris, combinez 300 microlitres du PBMC approprié et 300 microlitres des cellules tumorales 8-methoxypsoralen/UVA-traitées dans un tube conique de 1,5 millilitre et mélangez les cellules. Ensuite, ouvrez les pinces de tubes d’entrée et de sortie de la plaque TI. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour remplir le tube TI avec FBS, fermant les pinces pendant que le tube est rempli pour retenir FBS à l’intérieur du tube.Déconnectez la seringue. Placez une pointe de pipette P1000 solidement dans la prise de plaque TI. Tenez la plaque à un angle de 45 degrés et remplissez la plaque lentement avec PBMC et mélange de cellules tumorales, en évitant les bulles.Retirez la pointe pipette de l’admission avant de libérer le piston pipette. Retourner les cellules restantes dans le tube conique de 1,5 millilitre. Incubez le tube rempli de FBS, la plaque TI remplie de cellules et le tube conique de 1,5 millilitre contenant les cellules restantes dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après l’incubation, relâchez les pinces et videz le tube TI par gravité. Puis insérez une pointe de pipette P1000 avec le piston déprimé dans le port de plaque pour enlever les cellules de la plaque TI. Tenez la plaque à un angle de 45 degrés et remplissez la pointe de pipette P1000.Remettre les cellules dans leur tube conique original de 1,5 millilitre. Pour faire fonctionner la plaque TI, connectez le tube de sortie à la plaque et fixez la plaque TI dans le système de fonctionnement des plaques. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, dessinez ces 600 microlitres de PBMC et le mélange de cellules tumorales à partir du tube conique de 1,5 millilitre.Fixez la seringue au tube d’entrée avec la pince ouverte, et remplissez lentement jusqu’à ce que le liquide atteigne l’extrémité du tube. Fixez l’extrémité libre du tube d’entrée à la plaque TI et continuez à charger doucement le volume restant. Fermez la pince d’entrée une fois terminée.Détachez la seringue d’un millilitre et connectez le tube d’entrée à la pompe à seringues. Fixez le tube de sortie sur un tube conique propre de 1,5 millilitre pour la collecte cellulaire. Réglez le débit de la pompe à seringues à 0,09 millilitres par minute.Inclinez la plaque TI à environ 30 degrés vers le côté de la pompe à seringues à l’aide d’une plate-forme de course de plaque TI. Relâchez soigneusement la pince sur le tube d’entrée. Démarrez la pompe à seringues, en observant attentivement comment la plaque TI se remplit.Une fois que la plaque TI est complètement remplie, inclinez-la d’environ 30 degrés dans la direction opposée au fur et à mesure qu’elle se vide. Lorsque toutes les cellules du liquide se trouvent dans le tube de collecte conique de 1,5 millilitre, arrêtez la pompe. Pour laver la plaque TI, déconnectez le tube d’entrée de la pompe à seringues et connectez-le à une seringue d’un millilitre remplie de 600 microlitres de FBS.Remplir jusqu’à ce que FBS soit complètement chargé. Déconnectez ensuite la seringue et fixez le tube à la pompe à seringues. Réglez le débit de la pompe à seringues à 0,49 millilitres par minute.Relâchez la pince d’entrée et exécutez la plaque TI, en recueillant le lavage dans le même tube conique de 1,5 millilitre. Feuilletez ou appuyez doucement sur la plaque TI pendant tout le temps pour aider à détacher et à élucider les cellules adhérentes au fur et à mesure que la plaque se vide. Déconnectez le tube conique de 1,5 millilitre de la configuration de la plaque TI.Faire tourner le tube de collecte dans le microfuge benchtop à 250 fois-G pendant huit minutes et jeter le surnatant. Pour effectuer la co-incubation du jour au lendemain de PBMC avec l’antigène, résuspendez d’abord le PBMC et la pastille de cellules de tumeur dans deux millilitres de RPMI clair complété avec le sérum autologue de souris de 15%. Puis plaquez les cellules dans un plat stérile traité non tissulaire de 35 millimètres et incubez pendant la nuit dans des conditions standard de culture tissulaire.Le lendemain, détachez soigneusement les cellules adhérentes du fond du plat à l’aide d’un grattoir de culture tissulaire. Faire pivoter le plat tout en grattant pour assurer une collecte cellulaire même. Recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres.Ajouter deux millilitres de PBS au plat, et répéter l’étape de grattage, la collecte des cellules dans le même tube. Rincer le plat de 35 millimètres avec un millilitre de PBS et ajouter le rinçage au même tube. Tournez à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir les cellules.Retirer délicatement le supernatant, puis feuilleter le tube pour réutiliser la pastille. La thérapie a montré la réduction de la croissance de tumeur de YUMM1.7 dans plus de 100 souris traitées contre témoins, comme observé dans les données cumulatives de croissance de tumeur de neuf expériences indépendantes menées sur deux ans. Les courbes représentatives de croissance tumorale pour les animaux individuels au sein d’une expérience fournissent un sentiment de variabilité dans le système.Lorsque les monocytes ou les plaquettes sont épuisés de la fraction PBMC, ou lorsque le passage de la plaque est omis, l’effet thérapeutique n’est plus observé. Le traitement est inefficace en l’absence des cellules immunitaires ou d’une source d’antigène, ou en présence d’un antigène dépareillé, tel que les tumeurs YUMM1.7 traitées utilisant des cellules mc38 de carcinome de deux points. Pour un résultat immunisant, il est également essentiel d’éviter l’exposition de PBMC au 8-methoxypsoralen.L’analyse facs du changement des marqueurs indiqués des contrôles IgG correspondants dans les cellules humaines CD11c+, soit parmi les PBMC fraîchement isolés, le PBMC traité par TI, le PBMC traité par TI sans passage de plaque, les plaquettes épuisées avant le passage de la plaque, ou les deux ci-dessus, a montré que l’activation du DC dépend de la présence de plaquettes dans le PBMC et du passage de la plaque TI. Les CD humains activés par TI peuvent traiter et inter-présenter efficacement des antigènes peptidiques, ou des antigènes de cellules tumorales humaines entières exposées à 8 méthoxypsoralène pour activer les lignées de cellules T spécifiques aux antigènes humains dans des analyses in vitro d’une manière dépendante du TI et du plaquette. La spécificité des réponses des cellules T dépend de la source des antigènes traités.Lors de l’induction de l’immunité anticancéreuse, l’apoptose de chaque lignée de cellules cancéreuses doit être titrée pour maximiser l’immunogénicité. Puisque l’immunité induite sera spécifique aux antigènes immunisants, la dissection détaillée de chaque système sera possible. Chaque cancer expérimental ou clinique, et chaque réponse antimicrobienne, sera particulièrement instructif.Chaque cancer humain a sa propre gamme d’antigènes spécifiques à la tumeur. Le PhDC effectue le tri et la présentation nécessaires des antigènes tumoraux, sans nécessiter leur identification préalable en laboratoire. S’il vous plaît garder à l’esprit que la lumière 8-MOP et UVA sont cancérigènes.Utilisez l’équipement de protection approprié et suivez les procédures de sécurité lors de la manipulation 8-MOP et lorsque vous travaillez avec des sources de lumière UVA.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Recherche

Immunologie et infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...