Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

העבודה הזאת נתמכת על ידי NIH-NCI מלגת נבג 1 P50 CA121974 (ר. אדלסון, מ. ג'יררדי); NIH מרכז סרטן תמיכה גרנט 3 P30 CA16359-28S1 (ר. אדלסון, מ. ג'יררדי); הכשרת המכון הרפואי הווארד יוז (א. ואסהכל); וקרן הלב של ניו יורק (ר. אדלסון, א. ונטורה, א. איזלדאין). תמיכה חלקית סופק על ידי R01 CA196660-01 ל M. Bosenberg.
המחברים מודים לדוקטור רוברט טינאלאר על ההדרכה, ההדרכה והתובנה הניסיונית שלו. אנו מודים לעמיתינו בפראונהופר IBMT, במיוחד ד ר ת'ורסטן קנול, לפיתוח ולאספקת תא TI המקביל לECP. ניקולס תאוסקיס באדיבות עזר בשלבים הראשוניים של הניסויים הללו. אנו מודים לתורמים דם המתנדבים שלנו, לנגר כריסטנסן ולצוות המקצועי שלה במרכז הטיפול של אוניברסיטת ייל, לקבלת עזרה מתנדבת ברכישת דם. ד ר ונדל יארברו וד ר נטליה ישאבה שיתפו באדיבות איתנו את SCC61 ו-SCC61-E6/7 קווי התא. לקבלת סיוע טכני בפרויקט, אנו מודים ד ר ג'וליה לואיס על העצה פרוטוקול FACS, ו-E. Menet, ג ' טומולינה, ג ' קוט ב ליבה FACS של ייל. תמונות של התאים בתוך לוחית ה-TI נרכשו בעזרתם של פליקס ריברה-מולינה, PhD, מחלקת ביולוגיה של התא ומרכז הדמיה של הקולנוע ייל, בית הספר לרפואה של ייל. הפקת הסרטים בהשגחת אנדרו אוסבורן, מפיקת וידאו בכירה, משרד התקשורת, בית הספר לרפואה של ייל.

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

באוניברסיטת ייל מחזיקה פטנטים הנובעים מחקר התא הדנדריטי של פרופ ' ריצ'רד אדלסון, שהיו בעלי רישיון לחברת סטארט-up של ייל, מעבר לחברה. ריצ'רד אדלסון ומייקל גיררדי הם יועצים מדעיים לטרנסימאונה AG, ואילו אולגה סובבולב היא עובדת מובימאונה AG. לטרנזימל AG אין מוצרים מסחריים עדכניים, אולם על בסיס שיתופי הוא מייצר את לוחיות הארעיות המשמשות במאמר זה. ייתכן ששלושת המחברים האלה יוכלו להפיק תועלת ממיסחור של תגליות אלה בעתיד.

התקן המזעור והפרוטוקול המתוארים לעיל מאפשרים חקירת מעבדה יעילה של מנגנונים של ECP במערכות הניסוי של העכבר ובדגימות דם קטנות של בני אדם. זוהי מקדמה גדולה; למשל, זה איפשר לנו להדגים בפעם הראשונה את היעילות של ארעיות נגד גידולים מוצקים במודל העכבר 11, פתיחת האפשרות העתידית של יישום דומה באונקולוגיה אנושית.
לפני התפתחותה של התקן הארעיות והשיטה המתוארים כאן, לא ניתן היה לחקור באופן מלא את כל ההיבטים של ECP. בדגמי העכבר, למרות שהמגב של הטיפול יכול להיות משוכפל במידה מסוימת על-ידי טיפול בתאים בצלחת פטרי12,20, לא היתה יכולת להשתלב בשיטה שמעבר הצלחת, אשר הוכח ל ספק אינטראקציות טסיות דם דינאמיות החשובות באופן ביקורתי עבור הפעלת DC הפיסיולוגית של ECP14. במחקרים אנושיים, לחילופין, רכיב הזרימה היה נוכח במלואו, אך היכולת לחשוף באופן סלקטיבי רכיבים סלולאריים מסוימים ל-8-למגב, או להגן עליהם מפני זה, היה חסר21,22. זה מנע את ההבנה המלאה של מנגנון ECP, והאופטימיזציה שלה לחסינות או סובלנות. בנוסף, כמות הדם הדרושה לעבודה עם מנגנון ה-ECP הקליני היא חקירה מדעית גדולה ומתעבדת. התקן ECP במזעור והפרוטוקול המתואר כאן בפעם הראשונה מאפשר מידול מעבדה יעילה, גמישה לחלוטין וגמיש מאוד. בנוסף, לוח TI מאפשר הדמיה בזמן אמת וניטור של אינטראקציות תאים בתוך הצלחת על ידי מיקרוסקופ.
עבור ההצלחה של הפרוטוקול באמצעות הן במערכות vivo ו ex vivo, זה קריטי כי PBMC מטופלים מכילים מונוציטים שניתן להפעיל בקרי Dc תפקודית. כדי להמשיך בהפעלה זו, יש צורך גם להבטיח ששבר ה-PBMC מכיל מספר פיזיולוגי של טסיות בריאות, הפעלה, ושפרוטוקול מעבר הלוח של TI מלווה בקפדנות. על מנת לכוון את בקרי התחום החדשים שהופעלו כלפי פעילות חוזרת ספציפית, הם חייבים להיות מסופקים עם אנטיגן. מצאנו כי השיטה היעילה ביותר של משלוח אנטיגן עבור חסינות נגד סרטן היא לילה שיתוף דגירה של DCs המופעל לאחרונה עם אנטיגן המכיל8-מגב תאים סרטניים חשופים. זה יש את היתרון הנוסף של היכולת ליצור התגובה אנטי סרטניים חיסוני מבלי לחייב את הידע הקודם של אנטיגנים הגידול, על ידי התרת DCs לבחור אותם. עם זאת, במקרים שבהם האנטיגן ידוע, היתה לנו הצלחה מסוימת במערכות vivo ex כאשר משתמשים בפפטידים בחינם כאנטיגנים בתוך הדגירה המשותף. עבור יישומים אימונוגניים, בקרי התחום עצמם צריכים להיות מוגנים מ-8-לטאטא חשיפה. לבסוף, ב vivo ניסויים, חשוב לעבוד עם מודל חיה כי הוא מסוגל חסינות נגד הגידול. ארעיות יצירות על ידי יצירת מופעל, אנטיגן ספציפי DCs, אשר עובד בגוף ליזום תגובות החיסונית מולדת ואדפטיבית. פעילות לקויה או חוסר של התאים NK, CD4, או CD8 T בעכבר המטופל ישפיע על יעילות הפרוטוקול5,11.
בעוד הפרוטוקול המתואר כאן הוא הוכחה של עקרון אחד, כי כבר אופטימיזציה עבור מודל גידול מוצק של העכבר הסינגנטי, זה בכל זאת חושף הזדמנויות רבות. המנגנונים של ECP באונקולוגיה רק מובהר, ויש עדיין מקום רב להבנה משופרת. באופן כללי יותר, את היכולת ליצור עכבר מופעל באופן מבחינה פיזיולוגית ו-Dc אנושי, ו להפנות אותם בצורה סלקטיבית לכיוון החסינות אנטיגן ספציפי יש יישומים פוטנציאליים רבים מעבר לסרטן. היכולת לעשות את אותו הדבר, אבל במקום זאת להפנות את DCs לכיוון עמידות ספציפית אנטיגן, כפי שהוצע על ידי היעילות הטולריזינג של ECP עצמו, יש גם השלכות רפואיות רחב-טווח. עם שיטה זו, אנו מקווים לספק את הכלים ולפתוח שדרת פורה של מחקר עבור כל אדם עם עניין של הטיפולים הפיזיולוגיים DC.

(ECP) הוא טיפול חיסוני מבוסס שהוא פעיל נרחב במרכזים אוניברסיטאיים ברחבי העולם. השימוש בו מונע על ידי יעילות מיוחדת של בסלקטיביות, בטיחות וכיוונית של טיפול ECP, תכונות שמניות ECP עם המערכת החיסונית הפיסיולוגית עצמה, שאליה היא מופיעה כשותפה. ECP הוא באופן סלקטיבי החיסון נגד תאים ממאירים בתוך לימפומה cell עורית (ctcl)1,2, ו טולריזינג סלקטיבי עבור אנטיגנים ממוקדים בהשתלה, חסינות אוטומטית, והשתל-מול-מארח הגדרות (gvhd) ההגדרות מיכל שלוש , 4. המערכת החיסונית של ECP מודגשת על-ידי התלות שלו על תא תא CD8 T שלמים ב CTCL5, בעוד הפרט משתקף על ידי הפרופיל של ECP מאוד לוואי תגובה, ללא דיכוי החיסון מחוץ למטרה בהשתלה או הגדרות GvHD, ולא מוגברת הרגישות לדלקת אופורטוניסטי ב CTCL, שבו שיבוטים שאינם פתוגניים תא T יכול להיות איבד יחד עם תאים T ממאירים.
בהתחשב בחשיבות הקלינית של ה-ECP, התקווה כי הבנה טובה יותר של מכנייותיה עשויה להרחיב את ההישג הטיפולי של ה-ECP בספקטרום רחב יותר של סרטן והפרעות בהפרעות פיזיולוגיות. שתי סדנאות מורשה לאומית, מכון לבריאות ארצי (NIH) סימפוזיון המדינה-המדע6 והחברה האמריקנית לכנס הקונצנזוס של apheresis7, נערכו ודווחו, במטרה לזרז את ה זיהוי של התורמים הסלולריים העיקריים להשפעות האנטי-סרטניים והטולוגניים של ECP.
עד כה, למרות דיווחים רבים שפורסמו בניסיון לטפל במנגנון של ECP, שני מכשולים ראשוניים התשבו בהתקדמות מדעית. ראשית, חקירת מנגנוני ה-ECP בהגדרת המעבדה הניסיונית הוגבלה על-ידי חוסר התקן ECP זעיר שישקף במלואו את הסלולר של ECP ובהשפעות vivo, ויחולו על דגמי בעלי חיים. שנית, ניתוח מעבדה מעמיק של דגימות ECP בהגדרה הקלינית הוגבלה על ידי הזמינות המוגבלת של תאי החיסון של המטופל מעובד ECP, אשר דורשים גישה למרכזי טיפול, וכפופים בנוסף לעיתוי ה של המטופל, והצורך המוסרי לערכות ללא פשרות של לוקיציטים מטופלים.
כדי לפתור את המכשולים המחקשים את ההתקדמות של מחקר ECP, יצאנו לפתח מכשיר ECP זעיר שיהיה מקרוב ביותר לחקות את המרכיבים העיקריים של הטיפול. הטיפול הסטנדרטי של ECP כרוך במעבר של לוקיהרזיס של החולה-לוקיולוציטים מועשר באמצעות 1 מ"מ-עבה, אולטרה סגול אור (מיטת)-שקוף, צלחת פלסטיק6,8. בצלחת, הלוקוציטים חשופים ל 8-מתיונין (8-מגב), סוכן צילום-פעילות אשר על-ידי חשיפה מגונה הוא המרה באופן מחודש לטופס תגובתי (8-מגב), מסוגל לחצות את ה-DNA באמצעות הכריכה הביונטית שלה כדי לבסס את הפיברילין על . האחיות די. אן. איי9,10 מעובד, 8-מגב מטופלים לוקיציטים נאספים ומוחזרים באופן מידי למטופל.
מאז ECP עצמו הוא טיפול דו-כיווני, החיסונים בסרטן וטולריזינג בהשתלה, חסינות עצמית והגדרות GvHD, עבור הבהרה יש לנו בשם מודל החיסון של ECP המודל "ארעיות", ואת המצב הטולארוגניים "ההמרה". התמקדנו לראשונה במודאליות של הטרנזיזציה. התקן ה-ECP של העכבר לאדם שדווח לאחרונה על מזעור מיניאטורי, החדר או הלוח המקביל, והפרוטוקול המתאים, משכפל הן את vivo הסלולר והן את ההשפעות של התקן ה-ECP האנושי בהגדרת סרטן11.
על מנת להפוך את הארעיות במודל vivo כמו הרלוונטי קלינית ככל האפשר, אנו יזמו את הטיפול חיסוני לאחר תת-עורי הוזרק גידולים בעכבר syngeneic הפך מוחשי, ובכך בדיקת יעילות הפרוטוקול בסרטן הוקמה. בדומה לECP ב-CTCL, הפרוטוקול החד החסין בפני העיקרון של מלנומה משתמש בתאי דם היקפיים (PBMC) מבעלי חיים לגידול. התאים עוברים דרך הצלחת TI בזרימה. בעוד ששמונה -מנקה טיפול בתאים בתאי המיניאטורות אפשרי, עדיף לנהל אותו בנפרד, כדי לוודא שרק סוג התא הרצוי נחשף למגבשל8. מחקרים מוקדמים יותר מצביעים על כך שהאפקט הטולגניים של הECP מתווך על-ידי התאים המכילים 8-למגב המציג בתאיהגוף12, בעוד שאפקט החיסונים דורש 8-למגב פציעה של תאים סרטניים מטרה11. בפרוטוקול הארעיות או בתאי הגידול, או בתאים החיסוניים, ניתן לחשוף באופן סלקטיבי ל-8 -מגב לפי הצורך. מאז למקסם את הזמן של מגע בין 8-למגב תאים סרטניים ותאי הדנדריטים המושרה (DC) הוכח לשפר באופן משמעותי את היכולת החיסונית של ECP קליני13, אנו משולבים לילה שלב הדגירה המשותף לפרוטוקול שלנו. לאחר הדגירה הלילה, התאים המטופל מוחזרים לחיה נושאת הגידול.
מערכת זו מופחתת באופן אמין צמיחת הגידול ויזמה חסינות מסוימת נגד הגידול בעכברים עם גידולים syngeneic הוקמה11, ואיפשר לנו לנתח את המנגנון של היעילות הקלינית אנטי סרטניים של ECP. בכמה מחקרים הדגמנו כי חסינות ECP הוא יזם דרך הפעלת טסיות vivo לשעבר בלוח TI14,15. טסיות מופעל לאחר מכן לאותת התבגרות תא מונוציט-to-דנדריטי14, המוביל לייצור DCs הפיזיולוגי. בקרי הבית החדש שנוצר מונוציט הנגזרים מסוגלים להצליב בהווה אנטיגניםהפניל1 מ 8-למגב תאים סרטניים כדי להפעיל את התגובות הספציפיות לאנטיגן T16. כפי שהוצע בעבר12,17, עם זאת,8-מגב המושרה נזק של בקרי התחום המתהווה עצמם יכולים נגד לפעול או אפילו להפוך את האפקט נגד הגידול11, מתן קישור מכניסטי לסובלנות ECP.
לוחית TI השתמשה גם כדי לייצר בקרי Dc המופעלות מבחינה פיזיולוגית מ-PBMC אנושי. בדומה ללימודי העכבר, בקרי ה-TI האנושיים שלהם תלויים במעבר הצלחת בנוכחות טסיות עבור הדור שלהם, מופיעים פנופנסטים זהים לאלה המיוצרים בצלחת ה-ECP הקליני, והם מסוגלים לעבד ביעילות ו הצגת החוצה אנטיגנים הגידול האנושי להפעלה של תאים האדם T11,16.
בחשיפת המנגנון של טיפול חיסוני ECP, גילינו אפוא שיטה להפקת במהירות העכבר הפיזיולוגי ותאים הדנדריטים של האדם באופן מומלץ, כי ניתן לאפנן מבחינה פונקציונלית. התקן TI החדשני והפרוטוקול יש חשיבות פוטנציאלית משמעותית בתחומים של מחקר ECP וטיפול חיסוני סרטן באופן נרחב יותר, ובכל שדה אחר עם עניין פיזיולוגית, תאים דנדריטים פונקציונלי בחיסון או המודריזציה. אנו מקווים שפרסום זה יספק את הכלים הנחוצים לבעלי עניין בתחומי מחקר כאלה.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

כימותרפיה לצילום (ECP) הוא חיסוני סרטן נפוץ בשימוש עבור לימפומה cell תא T (CTCL), פעיל מעל 350 מרכזים אוניברסיטאיים ברחבי העולם. בעוד שהיעילות הקלינית ופרופיל הבטיחות למופת של ECP הניעו את השימוש הנרחב בו, ההסבר של המנגנונים הבסיסיים נותר אתגר, באופן חלקי בשל חוסר מודל ECP במעבדה. כדי להתגבר על מכשול זה וליצור פלטפורמה פשוטה וידידותית למשתמש למחקר ECP, פיתחנו גרסה מצומצמת של המכשיר לעיבוד לוקיציט הקליני, המתאים לעבודה עם מודלים לעכבר ולדגימות דם קטנות של בני אדם. התקן זה מגדיר את החדר של "טרנסימוניזציה" (TI), או את הצלחת. בסדרה של ניסויים בציון דרך, המכשיר המזעור שימש כדי לייצר חיסון הסלולר שיזם באופן קבוע חסינות נגד סרטן הטיפולית בכמה מודלים הגידול בעכבר syngeneic. על-ידי הסרת גורמים בודדים מהמערכת הניסיונית וברור את תרומתם לתגובה בvivo נגד הגידול, לאחר מכן הובהר מנהלי מפתח המכונה החיסון ECP הפוטנציאל. באופן קולקטיבי, התוצאות שלנו התגלו כי ההשפעות נגד הגידול של ECP הם ביוזמת תאים דנדריטים (DC), שנוצר פיזיולוגית באמצעות אינטראקציה דם מונוציט עם טסיות בצלחת TI, טעונים עם אנטיגנים מתאי הגידול אשר התא האפוטוטיק שלו המוות הוא מאוד מושפע מחשיפה לסוכן ה-DNA המקשר בין האדם לבין מתיונין והאור המוקשה (8-סמרטוט). כאשר חזר אל העכבר, זה החיסון הסלולרי מוביל לחסינות מסוים להעברה אנטי סרטניים T. אנו מאומתים כי תא TI מתאים גם לעיבוד דם אנושי, הפקת בקרי מניות אנושיים באופן מלא במצב הפעלה ופרופיל לאלה הנגזרים מתאי ה-ECP הקליני. הפרוטוקולים המוצגים כאן מיועדים ללימודי ECP בעכבר ובאדם, הדור מבוקר של תאים סרטניים האפוטוטיים עם 8-מגב, והפקה מהירה של בקרי התחום הפיזיולוגיים של האדם והעכבר מונוציט עבור מגוון יישומים.

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

התקן (TI) המכשיר או הלוח הקשורים הפרוטוקולים פותחו כדי לשכפל את התכונות העיקריות של כימותרפיה לחילוץ (ECP), בהגדרה ניסיונית, המאפשר ייצור של המופעל מבחינה פיזיולוגית, הדנדריטים הניתנים להפעלה תאים (DCs) עבור חיסוני סרטן.

הפרוטוקול הרומן ליצירת תאי הדנדריטים הפיזיוגניים האימונולוגיים

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

תאים פיזיולוגיים המציגים אנטיגן, הנוקטים PhDC, הם מתגי המאסטר החיסוניים היוזמים חסינות וסובלנות של תאי T ספציפיים לאנטיגן. מאמר זה מתיעד שיטה יעילה לייצור PhDC. שימוש קליני בתאים דנדריטיים נפגע על ידי שיטות ציטוקינות לא פיזיולוגיות המשמשות לייצורם.השיטה שלנו מתגברת על בעיה זו באמצעות איתות טסיות דם יעיל של המרת מונוציטים ל DC בבני אדם ועכברים. PhDC אלה אינם תלויים במצבי ציטוקין לא זמין vivo, כך שהם יכולים ליצור תגובות חזקות נגד גידולים קליניים T תאים בבני אדם ועכברים עם סרטן הוקמה. חניכת טסיות דם עצמאית למינים של התבגרות מונוציטים לדוקטורט יש יש ישימות ניסיונית רחבה.PhDC להתיר ניתוח של פיזיולוגיה של תאים דנדריטיים, להקל אינדוקציה של חסינות אנטי סרטנית טיפולית לסרטן אימונוגני, ולהציע הבטחה לחיסון מיקרוביאלית אישית. מערכת ניסיונית זו היא חדשנית, היבטים רבים של זה כגון ציפוי של תא הפלסטיק, טיפול בתא הגידול עם 8-MOP / UVA, תנאי זרימה, ושחרור של מונוציטים מיוצגים בצורה הטובה ביותר מבחינה ויזואלית. הדגימה של ההליך תהיה איב רובינסון, טכנאית מהמעבדה שלי.כדי לאסוף תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים, הגדר תחילה צינור 15 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של מדיום בידוד לימפוציטים לכל חמישה עד עשרה עכברים דיממו. ואז לאט דם שכבה שנאסף מעכברים נושאי גידול על גבי המדיום. סובב את התאים ב- 1, 000 ל- 1, 500 פעמים-G במשך 20 דקות כדי להפריד את המחשבים לתאי דם אדומים.בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את שכבת הפלזמה העליונה, משאיר 0.5 מיליליטר שנותרו מעל מעיל באפי, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, לאסוף את שכבת מעיל באפי לתוך צינור נקי 15 מיליליטר מלא PBS ל 15 מיליליטר, ולסובב ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמה סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את PBMC. בסוף הצנטריפוגה, בזהירות pipette את supernatant ולהעיף את הצינור כדי לעכל מחדש את גלולה.לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של חיץ תות תות שדה אדום ACK לצינור כדי להסיר את כל תאי הדם האדומים שנותרו מן PBMC. הדגירה PBMC על הקרח במשך 10 דקות. מלא את הצינור עם PBS ל 15 מיליליטר, ולסובב למטה ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמה סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את PBMC.בזהירות pipette את supernatant ולהעיף את הצינור כדי לשחרר את גלולה. תן שימוש חוזר לכדור ב-300 מיקרוליטרים של FBS. כדי להכין YUMM1.7 תאים סרטניים לכל קבוצת טיפול, תחילה resuspend גלולת תא הגידול ב- FBS ב 2.5 מיליון תאים לכל 300 microliters.עם אורות מכסה המנוע של תרבות הרקמות כבויים, הוסף 8-methoxypsoralen לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר להשעיה תא הגידול YUMM1.7. לאחר מכן, מערבבים את התאים, עוטפים את מיכל התא בנייר כסף, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי לצפות מראש צלחת תרבות רקמות 12 היטב, להוסיף מיליליטר אחד של FBS ל באר אחת עבור כל קבוצת טיפול של חמישה עכברים, ומקררים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.לאחר 20 דקות, מתחת למכסה המנוע של תרבות הרקמה, הסר את FBS מה בארות, והוסף 300 מיקרוליטרים של תאים סרטניים שנחשפו למתוקסיפסאורלן לכל באר. לאחר מכן חשוף את הלוח המכיל את התא לאולטרה סגול מחומם מראש מקור אור להקרנה מוחלטת של ארבעה joules לס"מ מרובע. כדי לאסוף תאים סרטניים 8-methoxypsoralen / UVA מטופלים מכל באר, מערבולת את הצלחת ואת פיפטה בזהירות כדי להבטיח התאוששות התא מלא.כדי לבצע מעבר צלחת טרנסאימוניזציה עבור כל קבוצת טיפול של חמישה עכברים, לשלב 300 microliters של PBMC המתאים 300 microliters של 8-methoxypsoralen / UVA שטופלו בתאי גידול בצינור חרוט 1.5 מיליליטר ולערבב את התאים. לאחר מכן, פתח את מהדקי צינורות הכניסה והיציאה של צלחת TI. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי למלא את צינורות TI עם FBS, סגירת המהדקים כמו צינורות מלא כדי לשמור על FBS בתוך הצינור.נתק את המזרק. מניחים טיפ פיפטה P1000 בבטחה לתוך צריכת צלחת TI. החזק את הצלחת בזווית של 45 מעלות ומלא את הצלחת לאט עם PBMC ותערובת תאים סרטניים, הימנעות בועות.הסר את קצה פיפטה מן הצריכה לפני שחרור הבוכנה פיפטה. החזר את התאים הנותרים לצינור חרוט 1.5 מיליליטר. חממה צינורות מלא FBS, צלחת TI מלא תאים, ואת הצינור חרוט 1.5 מיליליטר המכיל את התאים הנותרים באינקובטור תרבות הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, שחררו את המהדקים ורוקנו את צינורות TI בכוח הכבידה. לאחר מכן הכנס קצה פיפטה P1000 עם הבוכנה מדוכאת לתוך יציאת הצלחת כדי להסיר את התאים מצלחת TI. החזק את הצלחת בזווית של 45 מעלות ומלא את קצה פיפטה P1000.שים תאים בחזרה לתוך הצינור המקורי שלהם 1.5 מיליליטר חרוט. כדי להפעיל את לוחית ה- TI, חבר את צינור היציאה לצלחת ואבטח את לוחית ה- TI למערכת ריצת הלוח. לאחר מכן, באמצעות מזרק מיליליטר אחד, לצייר את אלה 600 microliters של PBMC ותערובת תאים סרטניים מצינור חרוט 1.5 מיליליטר.חבר את המזרק לצינור הכניסה עם המהדק פתוח, ולאט לאט למלא עד נוזל מגיע לסוף הצינור. חבר את הקצה החופשי של צינור הכניסה לצלחת TI והמשך לטעון בעדינות את אמצעי האחסון הנותר. סגור את מהדק הכניסה בסיום.נתק את המזרק המיליליטרי וחבר את צינורות הכניסה למשאבת המזרק. אבטחו את צינור היציאה לצינור חרוט נקי של 1.5 מיליליטר לאיסוף תאים. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.09 מיליליטר לדקה.הטה את צלחת TI כ-30 מעלות לכיוון צד משאבת המזרק באמצעות פלטפורמת ריצה של לוח TI. שחררו בזהירות את המהדק על צינורות הכניסה. התחל את משאבת המזרק, תוך התבוננות בזהירות כיצד צלחת TI מתמלאת.לאחר צלחת TI מלא לחלוטין, להטות אותו כ 30 מעלות בכיוון ההפוך כפי שהוא מתרוקן. כאשר כל התאים בנוזל נמצאים בצינור איסוף חרוט 1.5 מיליליטר, לעצור את המשאבה. כדי לשטוף את צלחת TI, לנתק את צינורות הכניסה ממשאבת המזרק, ולחבר אותו מזרק אחד מיליליטר מלא 600 microliters של FBS.מלא עד ש- FBS ייטען במלואו. לאחר מכן נתק את המזרק והצמד את הצינור למשאבת המזרק. כוונן את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.49 מיליליטר לדקה.שחרר את מהדק הכניסה, ולהפעיל את צלחת TI, איסוף לשטוף באותו צינור חרוט 1.5 מיליליטר. לחץ או הקש על צלחת TI בעדינות כל הזמן כדי לסייע בניתוק ו eluting כל התאים חסידים כמו הלוח מתרוקן. נתק את האוסף צינור חרוט 1.5 מיליליטר מהגדרת לוח TI.סובבו את צינור האיסוף במיקרופוגה על הספסל ב-250 פעמים במשך שמונה דקות והשליכו את העל-טבעי. כדי לבצע דגירה שותף לילה של PBMC עם אנטיגן, תחילה להשתמש מחדש את PBMC ואת גלולת תא הגידול בשני מיליליטר של RPMI ברור בתוספת 15% סרום עכבר אוטולוגי. ואז תאי צלחת בצלחת סטרילית שאינה רקמות 35 מ"מ שטופלו, ו דגירה לילה בתנאים סטנדרטיים של תרבות רקמות.ביום שלמחר, בזהירות לנתק את כל התאים חסידים מתחתית המנה עם מגרד תרבות רקמות. סובב את המנה תוך כדי גירוד כדי להבטיח איסוף תאים שווה. לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר.מוסיפים שני מיליליטר של PBS לצלחת, וחוזרים על שלב הגירוד, אוספים את התאים לאותו צינור. שוטפים את המנה 35 מילימטר עם מיליליטר אחד של PBS, ומוסיפים את לשטוף לאותו צינור. לסובב ב 250 פעמים G בצנטריפוגה תרבות רקמות סטנדרטית במשך 10 דקות כדי לאסוף את התאים.בזהירות פיפטה את supernatant, ולאחר מכן להעיף את הצינור כדי לעכל מחדש את גלולה. הטיפול הראה ירידה של צמיחת הגידול YUMM1.7 ביותר מ -100 עכברים מטופלים לעומת עכברי בקרה, כפי שנצפה בשנת הגידול המצטבר של תשעה ניסויים עצמאיים שנערכו במשך שנתיים. עקומות הגידול הייצוגיות לבעלי חיים בודדים בניסוי אחד מספקות תחושה של שונות במערכת.כאשר מונוציטים או טסיות דם מתרוקנים מהשבר PBMC, או כאשר מעבר צלחת מושמט, האפקט הטיפולי אינו נצפה עוד. הטיפול אינו יעיל בהיעדר תאי החיסון או מקור אנטיגן, או בנוכחות אנטיגן לא תואם, כגון גידולים YUMM1.7 שטופלו בתאי קרצינומה של המעי הגס MC38. לקבלת תוצאה חיסונית, זה גם קריטי כדי למנוע חשיפה PBMC 8-methoxypsoralen.ניתוח FACS של שינוי סמנים שצוינו מפקדי IgG תואמים בתאי CD11c + אנושיים בין PBMC מבודד טרי, PBMC שטופלו TI, PBMC שטופלו TI ללא מעבר טסיות, טסיות דם מרוקנות לפני מעבר טסיות הדם, או שניהם לעיל, הראו כי הפעלת DC תלויה בנוכחות טסיות דם ב- PBMC, ועל מעבר טסיות TI. מחשבי ה-DCs האנושיים המופעלים על-ידי TI יכולים לעבד ולהציג ביעילות אנטיגנים פפטידים, או אנטיגנים מתאי גידול אנושיים שלמים שנחשפו על-ידי 8 מתוקסיפסורלן כדי להפעיל קווי תאי T ספציפיים לאנטיגן אנושיים במבחנות חוץ-חוץ-זיונות באופן תלוי TI וטסיות דם. הספציפיות של תגובות תאי T תלויה במקור האנטיגנים המעובדים.כאשר גרימת חסינות נגד סרטן, אפופטוזיס של כל קו תאים סרטניים חייב להיות titrated כדי למקסם את האימונוגניות. מכיוון שחסינות המושרה תהיה ספציפית לחיסון אנטיגנים, יתאפשר ניתוח מפורט של כל מערכת. כל סרטן ניסיוני או קליני, וכל תגובה מיקרוביאלית, יהיה אינפורמטיבי באופן ייחודי.לכל סרטן אנושי יש מערך משלו של אנטיגנים ספציפיים לגידול. הדוקטורט מבצע את המיון וההצגה הדרושים של אנטיגנים סרטניים, ללא צורך בזיהוי המעבדה הקודם שלהם. אנא זכור כי 8-MOP ואור UVA הם חומרים מסרטנים.השתמש בציוד מגן מתאים ובצע נהלי בטיחות בעת טיפול ב- 8-MOP ובעבודה עם מקורות אור UVA.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...