Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-NCI spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center støtte Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); i Howard Hughes Medical Institute trenings fellesskap (A. Vassall); og NY CARDIAC Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Delvis støtte ble levert av R01 CA196660-01 til M. Bosenberg.
Forfatterne er takknemlige for Dr. Robert Tigelaar for hans veiledning, veiledning og eksperimentell innsikt. Vi takker våre kolleger på Fraunhofer IBMT, spesielt Dr. Thorsten haugen, for utvikling og gi ECP-ekvivalent TI kammer. Nicholas Theodosakis vennlig hjalp med innledende stadier av vi eksperimenter. Vi takker våre frivillige blodgivere, Inger Christensen og hennes profesjonelle medarbeidere ved Yale ECP Treatment Center for å få hjelp med frivillige blod anskaffelser. Dr. Wendell Yarbrough og Dr. Natalia Issaeva vennlige delte med oss SCC61 og SCC61-E6/7 cellelinjer. For teknisk assistanse på prosjektet, vi takker Dr. Julia Lewis for FACS protokollen råd, og E. menet, G. Tokmoulina, C. Cote på Yale FACS Core. Film bilder av celler i TI-platen ble anskaffet ved hjelp av Felix Rivera-Molina, PhD, Dept of Cell Biology og Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Filmproduksjon ble overvåket av Andrew Osborne, senior video Producer, Office of Communications, Yale School of Medicine.

Alle musen metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Yale Universitet, inne avtale med det nasjonal institutter av dyr Healthcare retningslinjene. Alle menneskelige studier ble utført med blod donert av friske frivillige, med skriftlig informert samtykke. Human blod studier ble utført i samsvar med anerkjente etiske retningslinjer (f. eks, erklæringen av Helsinki, CIOMS, Belmont Report, US Common regel), og ble godkjent av Yale Human Investigational Review Board under Protokollnummer 0301023636.
Merk: Følgende er protokollen som beskriver transimmunization for anti-tumor behandling av mus syngeneic svulster.
1. Syngeneic vi 1,7 tumor implantation
<ol><li>Følg etablerte protokoller til implantatet syngeneic svulster i flanken av mus som passer til tumor cellelinjen av interesse. Merk: Protokollen nedenfor beskriver vi 1.7 C57BL/6 Mouse melanom tumor modell. VI 1.7 melanom celler ble vennlig levert av Dr. Bosenberg, Yale18.</li>
	<li>
Tine en frossen alikvot av celler og bruke celler etter en celle passasje. Kultur ferske tint vi 1.7 celler i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s næringsstoff blanding F-12 medium (DMEM/F12), supplert med 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin/Streptomycin, og 1% ikke-essensielle aminosyrer, under standard forhold til vevs kulturen (37 ° c, 5% CO2).
	<ol>
<li>Samle vi 1,7 celler ved 60 \ u201270% samløpet ved å legge nok Trypsin-EDTA for å dekke bunnen av cellen kultur plate eller kolbe (f. eks, 4 mL for en T75 kolbe).</li>
		<li>Hvile cellen kulturen fartøy for romtemperatur for 3 \ u20124 min, mildt tapping på bunnen eller sider av fartøyet noen ganger å hjelpe løsne cellene.</li>
		<li>Tilsett 1 mL av fosterets storfe serum (FBS) per 4 mL Trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) for å stoppe reaksjonen når de fleste cellene er løsrevet. Samle cellene ved pipettering inn i en 15 mL konisk rør. Skyll flasken med fosfat-bufret saltvann (PBS) og tilsett skylling i samme prøvetakingsrør. Fyll røret til 15 mL med PBS.</li>
		<li>Ta ut en liten alikvot og telle cellene.</li>
		<li>Spinn ned i 10 min på 250 x g i en standard vev kultur sentrifuger å samle tumorceller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend vi 1,7 celler i PBS ved tetthet på 1 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Injiser 1 x 105 vi 1.7 tumorceller subkutant i 100 ΜL av PBS i høyre flanken av mottaker 4 til 6-ukers-gamle vill type mannlige C57BL/6J mus, anesthetized henhold til institusjonelle retningslinjer (f. eks 3 \ u20125% isoflurane inhalant gass, anestesi bekreftes av mangel på hind Paw klype refleks).</li>
	<li>Monitor tumor volum via bi-ukentlige målinger av vinkelrett tumor diametere og høyde ved hjelp av en tykkelse. Beregn vi 1.7 (tumor volum som tumor lengde x bredde x høyde)/2.</li>
	<li>Initiere transimmunization terapi når svulster blir bare håndgripelig; for vi 1.7 svulster, er dette vanligvis dag 7 \ u201210 innlegg svulst implantation.</li>
</ol>2. innsamling av perifert blod mononukleære celler for Transimmunization
<ol><li>Samle 100 \ u2012150 μL av blod fra hver tumor-bærende mus via kinn blø.</li>
	<li>Som blod blir samlet inn, basseng blod fra hver mus behandling gruppe (hver 5 eksperimentelle mus + 5 kontroll mus) i en enkelt 15 mL rør som inneholder 5 000 U/mL heparin. Bruk 10 μL av 10% heparin per 100 μL blod innsamlet. Merk: Bland røret ofte under innsamling for å unngå blodpropp. Mens kontroll tumor-bærende mus kan bli blødde samtidig som den eksperimentelle mus, for å sikre like forhold med behandling gruppen, "kontroll" blod kan enten kastes, eller kombinert med blod i behandlingen gruppen for å gi ytterligere eksperimentell PBMC for behandling gruppen, etter etterforskerne ' skjønn.</li>
	<li>Sett opp 1 15 mL rør med 4 mL lymfocytter isolasjons medium (se tabell over materialer) per 5 \ u201210 mus blødde. Langsomt lag blod (samlet fra tumor-bærende mus) på toppen av mediet. Spinn cellene i 20 min ved 1000 \ u20121, 500 x g for å skille PBMC fra røde blodlegemer.</li>
	<li>På slutten av sentrifugering, samle den øverste plasma laget, slik at ~ 0,5 mL gjenværende over Buffy coat, og lagre ved 4 °C for senere bruk (trinn 7,1).</li>
	<li>Samle Buffy coat laget i en ren 15 mL tube, fyll med PBS til 15 mL, og spinn for 10 min på 250 x g i en standard vev kultur sentrifuger å samle PBMC.</li>
	<li>Pipet forsiktig av supernatanten, og resuspend pellet ved å sveipe røret. Ikke Dekanter, da pellet er myk og kan gå tapt. Tilsett 2 mL ACK rød blod cellelyse Rings buffer (se tabell over materialer) til røret for å fjerne eventuelle gjenværende røde blodlegemer fra PBMC. Ruge på isen i 10 min.</li>
	<li>Fyll røret med PBS til 15 mL, og spinn ned i 10 min på 250 x g i en standard vev kultur sentrifuge å samle PBMC.</li>
	<li>Pipet forsiktig av supernatanten, og resuspend pellet ved å sveipe. Ikke Dekanter, da pellet er myk og kan gå tapt. Merk: På dette trinnet, renset PBMC kan endres som best passer eksperimentet. De ulike PBMC-komponentene (blodplater, monocytter, andre typer immunceller) kan tømmes eller isoleres fra PBMC etter behov. Også, PBMC selv kan utsettes for 8-MOPPA, enten før eller etter § 4 (før eller etter plate passasje-etter § 2 eller før § 5), ved å følge protokollen trinn 3.3 \ u 20123.8 og erstatte PBMC for vi 1.7 celler. Dette vil avkorte immunogenic kapasitet av behandlingen, og i stedet fremme immun toleranse.</li>
	<li>For hver behandlingsgruppe (hver 5 eksperimentelle mus + 5 kontroll mus), resuspend PBMC pellet i 300 μL FBS.</li>
</ol>3.8-MOPP/UVA behandling av tumor celler
<ol><li>Kultur og samle vi 1,7 tumorceller som beskrevet i trinn 1.2 – 1.3 for å forberede en 8-MOPPA-eksponert tumor celle antigen kilde.</li>
	<li>Forbered 2,5 x 106 vi 1,7 tumorceller per behandlingsgruppe på 5 mus. For hver behandlingsgruppe resuspend tumor celle pellet i FBS ved 2,5 x 106 celler/300 μL (~ 8,33 x 106 celler/ml).</li>
	<li>Med vev kultur hette lysene av, tilsett 8-MOPP (se tabell over materialer) til vi 1,7 tumor celle suspensjon for en endelig 8-mopp konsentrasjon av 100 ng/ml. Forsiktig: 8-Mop er et photoactivatable DNA-ødeleggende middel og kreftfremkallende. Vær forsiktig når du håndterer og dispenser, unngå kontakt med eksponert hud og kast den på riktig måte.</li>
	<li>Bland cellene godt, Pakk cellen beholderen i tinn folie, og ruge for 20 min ved 37 °C.</li>
	<li>Pre-coat en 12-brønn vev kultur plate ved å fylle en brønn for hver behandling gruppe på 5 mus (2,5 x 106 vi 1.7 tumorceller) med 1 ml FBS, og kjøle fylte plate for 20 min ved 4 °C.</li>
	<li>Slå på UVA lyskilde for å pre-varme den. Forsiktig: UVA-lys er et kreftfremkallende stoff. Når du arbeider med UVA lyskilder arbeide raskt og forsiktig, beskytte huden mot eksponering, og bruke ansiktsskjermer eller briller for å beskytte ansikt og øyne.</li>
	<li>Etter 20 min, flytte nedkjølt 12-brønn plate (trinn 3,5) til vevet kulturen hette, fjerne FBS fra brønner, og tilsett 300 μL (2,5 x 106 celler/BRØNN) mopp-eksponert tumorceller (fra trinn 3,4) per brønn.</li>
	<li>Utsett cellen som inneholder platen til den pre-varmet UVA lyskilde for total bestråling av 4 J/cm2. Merk: Konsentrasjonen på 8 MOPP og UVA-dosen som beskrives her, kalibreres for vi 1.7 tumor cellelinje. En titrering av 8-MOPP/UVA dose, tilstrekkelig til å forårsake 100% tumor celle død innen 1 uke etter eksponering, bør utføres for hver eksperimentell tumor cellelinje, for å fastslå effektiv drap dose. Dette er kritisk viktig for mus in vivo TI eksperimenter, fordi cellene er reinjisert retro-orbitally (trinn 6,1) og dermed eventuelle uskadet tumorceller kan ellers danne øye svulster i det behandlede dyret. Som en retningslinje, 4 \ u20128 J/cm2 av UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-Mop, er det typiske effektive området for de fleste tumor cellelinjer.</li>
	<li>Samle 8-MOPPA-behandlet tumorceller fra hver brønn, virvlende platen og pipettering nøye for å sikre fullstendig celle utvinning.</li>
</ol>4. TI plate passering av celler
<ol><li>For hver behandlingsgruppe på 5 mus, Kombiner i ett 1,5 mL konisk rør 300 μL av riktig PBMC (fra trinn 2,11) og 300 μL av 8-MOPA-behandlede tumorceller (fra trinn 3,9). Bland cellene.</li>
	<li>Bruk en sprøyte på 10 mL for å fylle inn "inngangs"-og "exit"-settene til TI-slangen (se Tabell med materialer) med FBS. Åpne slangen klemmer å fylle rørene, og lukke klemmer når rørene er fylt før frakobling av sprøyten, for å beholde FBS inne i slangen.</li>
	<li>Bruk en P1000-pipette for å legge til PBMC-og tumor celle blanding (fra trinn 4,1) til TI-platen (se tabell over materialer). Hold platen ved en 45° vinkel, plasser pipette spissen trygt inn i ti plate inntaket, og fyll platen langsomt, unngå bobler.</li>
	<li>Fjern dråpe spissen fra inntaket før du slipper pipette stempelet. Platen rommer 450 μL; returnere de resterende cellene til 1,5 mL konisk rør.</li>
	<li>Ruge den FBS slangen, cellen-fylte TI plate, og 1,5 mL konisk rør som inneholder de resterende cellene i vevs kulturen inkubator ved 37 °C for 1 h. Etter inkubasjons, Tøm TI slangen ved tyngdekraften, slippe klemmene.</li>
	<li>Bruk en P1000 pipette til å fjerne celler fra TI-platen ved å sette inn pipette spissen med stempelet deprimert inn i plate porten. Hold platen i en 45° vinkel og fyll P1000 pipette spissen. Plasser cellene tilbake i sin opprinnelige 1,5 mL konisk slange.</li>
	<li>Hvis du vil kjøre TI-platen, kobler du avslutnings slangen til platen og fester TI-platen inn i platen som kjører systemet.</li>
	<li>Bruk en 1 mL sprøyte, tegn opp 600 μL av PBMC og tumor celle blanding fra 1,5 mL konisk rør, bli kvitt eventuelle bobler i sprøyten, fest sprøyten til inngangs røret med klemmen åpen og langsomt fyll til væsken når enden av slangen.</li>
	<li>Fest den frie enden av inngangs røret til TI-platen og Fortsett å laste inn gjenværende volum. Lukk inngangs klemmen.</li>
	<li>Løsne sprøyten på 1 mL og koble inngangs slangen til sprøyte pumpen. Fest utgangsslangen til en ren 1,5 mL konisk slange for celle oppsamling.</li>
	<li>Juster sprøyte pumpens strømningshastighet til 0,09 mL/min, men ikke start pumpen ennå. Vipp TI-platen ~ 30° mot sprøyte pumpe siden ved hjelp av en ti-plate som kjører plattform eller andre midler (f.eks. et lite flatt objekt under den ene enden av platen).</li>
	<li>Løsne klemmen forsiktig på inngangs slangen. Start sprøyten pumpen, observere nøye hvordan TI platen fyller, og flick rør eller plate som nødvendig bør noen luftbobler hindre flyten.</li>
	<li>Når TI platen er helt fylt, vipper den ~ 30° i motsatt retning som den tømmer. Når alle cellene og væsken er i 1,5 mL konisk oppsamlings rør, stopp pumpen.</li>
	<li>For å vaske TI-platen, koble fra inngangs slangen fra sprøyte pumpen, kople til en 1 mL sprøyte fylt med 600 μL FBS, og Følg fremgangsmåten for trinn 4.8 \ u 20124.9.</li>
	<li>Juster sprøyte pumpens strømningshastighet til 0,49 mL/min, løsne inngangs klemmen, og Kjør TI-platen som beskrevet i trinn 4.12 \ u 20124.13, samle vask i samme 1,5 mL konisk rør. Sveip eller trykk TI-platen forsiktig hele tiden, for å hjelpe til med å løsne og tent eventuelle tilhenger celler.</li>
	<li>Snurr samlingen 1,5 mL konisk rør i stasjonære microfuge ved 250 x g i 8 min. kast supernatanten.</li>
</ol>5. utarbeidelse av autologous Mouse serum for overnatting kultur medium
<ol><li>Samle blod fra 10 \ u201212 uke gamle C57BL/6J mus av noen institusjonelt godkjent metode (f. eks øye blø, hale blodåre blø, kinn blø, eller Terminal blø ut av CARDIAC punktering), uten antikoagulanter. Estimat oppsamling 1 mL blod for hver 300 μL av serum. Merk: En ville trenge 300 μL av serum for hver behandlingsgruppe på 5 mus i eksperimentet.</li>
	<li>Tillat blodpropp over natten ved 4 ° c.</li>
	<li>Snurr ned koagulert blod på 3 000 x g i 15 min. nøye samle den øverste serum som inneholder lag Merk: Serum kan brukes umiddelbart for å gjøre over natten cellen inkubasjons medium (trinn 6,1), eller bevart for fremtidige eksperimenter. For å bevare serum, fryse i alikvoter ved-20 ° c.</li>
</ol>6. overnight co-inkubasjons av PBMC med antigen
<ol><li>Resuspend den PBMC og tumor celle pellet (trinn 4,5) i 2 mL klar RPMI med 15% autologous mus serum (utarbeidet i trinn 5). Plate i en 35 mm ikke-vev-kultur behandlet steril parabol, og ruge over natten under standard vev kultur forhold (37 ° c, 5% CO2). Merk: Hvis PBMC blir brukt med et ikke-Cellular antigen (peptid, nanopartikkel, protein, etc.), utelater § 3 i protokollen, og gå videre fra del 2 direkte til § 4, legge til ønsket antigen til TI plate-bestått PBMC for overnight co-inkubasjons her i Trinn 6,1.</li>
	<li>På neste dag, forsiktig løsne eventuelle tilhenger celler fra bunnen av fatet med en vev kultur skraper, roterende fatet mens skraping å sikre jevn celle samling. Samle cellene i et 15 mL rør.</li>
	<li>Tilsett 2 mL PBS til parabolen og gjenta skraping trinn, samle cellene i samme rør. Skyll den 35 mm parabolen med 1 mL PBS og tilsett skyll i samme slange.</li>
	<li>Spin for 10 min på 250 x g i en standard vev kultur sentrifuger å samle cellene. Pipet forsiktig av supernatanten og resuspend pellet ved å sveipe røret. Ikke Dekanter, da pellet er myk og kan gå tapt.</li>
</ol>7. re-injeksjon av TI-behandlede celler i tumor-bærende mus
<ol><li>Spin Down autologous plasma (fremstilt i trinn 2,4) ved 750 x g i 15 min til sediment noen partikler. Resuspend celle pellet (fra trinn 6,4) i 600 μL av autologous plasma eller PBS.</li>
	<li>Injiser celler på 100 μL per mus inn i retro-orbital plexus av hensiktsmessig anesthetized (f. eks 3 \ u20125% isoflurane inhalant gass, anestesi bekreftes av mangel på hind Paw klype refleks) tumor bærende eksperimentelle mus. Hvis ønskelig, re-injisere kontroll svulst peiling mus med 100 μL av autologous plasma alene, eller PBS.</li>
	<li>For vi 1.7 tumor-bærende mus, gjenta behandlingen (trinn 2 – 7.2) to ganger i uken i 3 uker, for totalt 6 behandlinger. Samle og behandle PBMC fra tumor-bærende mus ukentlig (protokoll seksjoner 2 \ u20124) på mandager og torsdager, og re-sette mot etter over natten inkubasjons (protokoll seksjoner 5 \ u20127) på tirsdager og fredager. Merk: Dette behandlingsregimet ble utviklet for den spesifikke vekst Kinetics på vi 1,7 svulster hos mus. Det må kanskje være titrert for andre tumor systemer med langsommere eller raskere tumor vekstrater-henholdsvis øke eller redusere antall behandlinger.</li>
	<li>Monitor tumor volum via bi-ukentlig måling-fortrinnsvis på tidspunktet for behandling administrasjon (tirsdag og fredag)-av vinkelrett tumor diametere og høyde ved hjelp av en tykkelse. Avslutte eksperimentet når kontroll tumor volumer nå maksimal størrelse tillates av institusjonelle retningslinjer og protokoller.</li>
</ol>8. protokoll tilpasning for behandling av Ssmall volumer av humant blod
<ol><li>Tilpass protokollen for bruk med menneskelige celler ved først å isolere PBMC fra humant blod. Bruk heparin som en anti-koagulere, med hvilken som helst foretrukket PBMC isolasjons protokoll.</li>
	<li>Sørg for at den isolerte PBMC-fraksjonen inneholder et fysiologiske antall blodplater, for best mulig protokoll resultater. Overvåk blodplatetellinger før og etter PBMC-isolering ved hjelp av en hvilken som helst standard hematologi teller.</li>
	<li>Hvis du bruker en human Cellular antigen kilde, behandle den menneskelige antigen cellene følge trinnene som er beskrevet i avsnitt 3 for vi 1.7 celler. Titrere 8-MOPP og UVA-doser tilsvarende.</li>
	<li>Utfør plate trinnene som er beskrevet i avsnitt 4, med opptil 3 x 107 PBMC per ti-plate.</li>
	<li>Kultur PBMC over natten med Cellular/andre antigen av valget, som beskrevet i § 6, men erstatning 15% humant AB serum for autologous mus plasma for natten kultur medium i trinn 6,1.</li>
	<li>Bruk de resulterende cellene i enhver ønsket analysen. For eksempel co-kultur med antigen-reaktive T-celler til å observere antigen-spesifikke T celle responser initiert av TI-behandlede celler.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

Yale University eier patenter avledet fra dendrittiske celle forskning av prof. Richard Edelson som har blitt lisensiert til en Yale oppstart selskap, Transimmune AG. Richard Edelson og Michael Girardi er vitenskapelige konsulenter til Transimmune AG, mens Olga Sobolev er en Transimmune AG ansatt. Transimmune AG har ikke noen aktuelle kommersielle produkter, men på et samarbeids grunnlag det produserer Transimmune platene som brukes i denne artikkelen. Det er mulig at disse tre forfatterne kan potensielt ha nytte av kommersialisering av disse funnene i fremtiden.

Den miniatyriserte enheten og protokollen som er beskrevet ovenfor for første gang tillate effektiv laboratorie undersøkelse av mekanismer av ECP i mus eksperimentelle systemer, og i små menneskelige blodprøver. Dette er et stort fremskritt; for eksempel, tillot det oss å demonstrere for første gang effekten av transimmunization mot solide svulster i en mus modell 11, åpne fremtidige muligheten for en lignende anvendelse i menneskelig onkologi.
Før utviklingen av transimmunization enheten og metoden beskrevet her, var det umulig å fullt undersøke alle aspekter av ECP. I musemodeller, selv om 8-moppen aspekt av terapien kan bli kopiert noe ved å behandle celler i en Petri parabolen12,20, var det ingen kapasitet til å integrere i metoden platen passasjen, som har vist seg å gi dynamiske blodplater interaksjoner som er kritisk viktig for ECP fysiologiske DC aktivering14. I menneskelige studier, alternativt, var flyten komponenten fullt til stede, men evnen til å selektivt utsette bestemte cellulære komponenter til 8-MOPPA, eller for å beskytte dem fra det, manglet21,22. Dette hindret full forståelse av ECP-mekanismen, og dens optimalisering for immunitet eller toleranse. I tillegg er mengden av blod som kreves for å arbeide med det kliniske ECP-apparatet stor, hindrer vitenskapelig undersøkelse. Den miniatyriserte ECP-enheten og protokollen som beskrives her for første gang, tillater effektiv, fullstendig fleksibel og tunable laboratorie ECP-modellering. I tillegg gir TI-platen for sanntids visualisering og overvåking av celle interaksjoner i platen ved mikroskopi.
For at protokollen skal lykkes med både in vivo-og ex vivo-systemer, er det avgjørende at de behandlede PBMC inneholder monocytter som kan aktiveres i funksjonelle DCs. For denne aktivisering å fortsette, det er en likeledes på krevd å sikre det PBMC brøk behersker en fysiologiske antallet av rask, activatable blodplater, og det det TI plate passasje protokollen er føle etter undersøke saken grundig. For å dirigere de nylig aktiverte DCs mot en spesifikk reaktivitet, må de leveres med antigen. Vi har funnet at den mest effektive metoden for antigen levering for anti-kreft immunitet er natten co-inkubasjons av den nylig aktiverte DCs med antigen-inneholdende 8-MOPPA-eksponert tumorceller. Dette har den ekstra fordelen av å kunne skape en immunogenic anti-kreft respons uten nødvendiggjør tidligere kjennskap til tumor antigener, ved å la DCs å velge dem. Men i tilfeller der antigen er kjent, hadde vi en viss suksess i ex vivo-systemer når du bruker gratis peptider som antigener i co-inkubasjons. For immunogenic programmer bør DCs selv beskyttes fra 8-MOPPen eksponering. Til slutt, in in vivo eksperimenter, er det viktig å arbeide med en dyr modell som er i stand til anti-tumor immunitet. Transimmunization fungerer ved å opprette aktiverte, antigen-spesifikke DCs, som arbeider i kroppen til å initiere medfødt og adaptive immunresponser. Nedsatt aktivitet eller mangel på NK, CD4, eller CD8 T celler i den behandlede musen vil påvirke protokollen ' s effekt5,11.
Mens protokollen beskrevet her er en proof-of-prinsippet en som har blitt optimalisert for en mus solid syngeneic tumor modell, avslører det likevel mange muligheter. Mekanismene for ECP i onkologi er bare bare å være belyst, og det er fortsatt mye rom for bedre forståelse. Videre forstand, evnen til å generere fysiologisk aktivert mus og menneskelige DCs, og å selektivt henvise dem mot antigen-spesifikke immunitet har mange potensielle applikasjoner utover kreft. Muligheten til å gjøre det samme, men i stedet direkte DCs mot antigen-spesifikk toleranse, som er foreslått av tolerizing effekten av ECP selv, har også omfattende medisinske implikasjoner. Med denne metoden, håper vi å gi verktøy og åpne en produktiv Avenue av forskning for alle med interesse for fysiologiske DC terapier.

Ekstrakorporal photochemotherapy (ECP) er en etablert immunterapi som er viden operative i universitets sentre over hele verden. Bruken har vært drevet av unike selektivitet, sikkerhet, og toveis effekt av ECP terapi, trekk som ECP aksjer med fysiologiske immunsystem seg selv som det ser ut til å samarbeide. ECP er selektivt immuniserer mot ondartede celler i hud T celle lymfom (CTCL)1,2, og selektivt tolerizing for målrettet antigener i transplantasjon, autoimmunitet, og pode-versus-host sykdom (GvHD) innstillinger 3 andre priser , 4. The IMMUNOGENISITET av ECP er fremhevet av sin avhengighet av en intakt CD8 T celle KUPÉ i CTCL5, mens spesifisitet gjenspeiles av ECP er svært gunstig bivirkning profil, med ingen off-Target immun bekjempelse i transplantasjon eller GvHD innstillinger, og ingen økt opportunistiske infeksjon mottakelighet i CTCL, der ikke-patogene T celle kloner kan potensielt gå tapt sammen med den ondartede T celler.
Gitt den kliniske betydningen av ECP, håper at bedre forståelse av sine mekanismer kan utvide ECP terapeutiske rekkevidden til et bredere spekter av kreft og Immunologic lidelser har stimulert internasjonal interesse. To nasjonalt sanksjonert workshops, en National Institutes of Health (NIH) State-of-The-Science Symposium6 og en American Society for aferese konsensus konferanse7, ble gjennomført og rapportert, med sikte på å akselerere identifisering av de viktigste cellulære bidragsyterne til ECP ' s anti-kreft og tolerogenic effekter.
Hittil, til tross for tallrike publiserte rapporter forsøker å adresse ECP ' s mekanisme, to primære hindringer har hindret vitenskapelige fremskritt. For det første, granskning av ECP mekanismer i eksperimentell laboratoriet innstillingen er begrenset av mangelen på miniatyr ECP enhet som ville fullt reflekterer ECP ' s Cellular og in vivo effekter, og være gjeldende for dyremodeller. Dernest, grundig laboratorieanalyse av ECP-prøver i den kliniske innstillingen har blitt begrenset av den begrensede tilgjengeligheten av ECP-behandlede pasient immunceller, som krever tilgang til behandlingssentre, og er i tillegg underlagt tidspunktet for pasientens infusjoner, og det etiske behovet for kompromissløs sett med pasient-misjonsønsket leukocytter.
For å løse hindringene som hindrer utviklingen av ECP-forskning, satte vi ut for å utvikle en miniatyr ECP-apparat som ville nærmest etterligne de viktigste elementene i terapien. Standard ECP-behandling innebærer passering av en pasients leukaferese-beriket leukocytter gjennom en 1 mm-tykk, ultrafiolett en lys (UVA)-gjennomsiktig, plast plate6,8. I platen, er de leukocytter eksponert for 8-methoxypsoralen (8-MOPP), en foto-activatable agent som ved UVA-eksponering er midlertidig konvertert til en reaktiv form (8-MOPPa), i stand til DNA kryss-linking via sin bivalent binding til pyrimidin baser på søster DNA tråder9,10. Behandlet, er 8-MOPPA-behandlet leukocytter samlet inn og returnert intravenøst til pasienten.
Siden ECP i seg selv er en bi-retningsbestemt terapi, immuniserer i kreft og tolerizing i transplantasjon, autoimmunitet og GvHD innstillinger, for avklaring vi har kalt modellen ECP ' s immunisering modus "transimmunization", og tolerogenic modus "transtolerization". Vi først fokuserte på transimmunization modalitet. Vår nylig rapporterte miniatyriserte skalerbar mus-til-mann ECP-enhet, transimmunization (TI) kammer eller plate, og den tilsvarende protokollen, reprodusere både cellulære og in vivo effekter av den menneskelige ECP-enheten i en kreft innstilling11.
For å gjøre transimmunization in vivo-modellen så klinisk relevant som mulig, startet vi immunterapi etter subkutant injisert syngeneic mus svulster ble håndgripelig, og dermed teste protokollen effekt i etablert kreft. Tilsvarende til ECP i CTCL, den proof-of-prinsippet transimmunization protokollen i vi 1.7-modellen av melanom bruker perifere blod mononukleære celler (PBMC) fra svulst bær ende dyr. Cellene føres gjennom TI-platen underflyt. Mens 8-MOPPen behandling av celler i miniatyr kammeret er mulig, er det best å gjennomføre det separat, for å sikre at bare den ønskede celletypen er eksponert for 8-moppA. Tidligere studier tyder på at ECP ' s tolerogenic effekt er mediert av 8-MOPPA-skadde antigen-presentere celler12, mens immuniserer effekten krever 8-moppen skade på målet tumorceller11. I transimmunization protokollen enten tumorceller, eller immunceller, kan selektivt utsettes for 8-MOPPA etter behov. Siden maksimere tidspunktet for kontakt mellom 8-MOPPA-skadde tumorceller og ECP-indusert dendrittiske celler (DC) har vist å betydelig forsterke den immunotherapeutic kapasiteten til klinisk ECP13, innlemmet vi en overnatting inkubasjons skritt inn i vår protokoll. Etter over natten inkubasjons, de behandlede cellene er returnert til tumor bærende dyr.
Dette systemet pålitelig redusert tumor vekst og igangsatt spesifikke anti-tumor immunitet i mus med etablerte syngeneic svulster11, og tillot oss å analysere mekanismen av ECP ' s kliniske anti-tumor effekt. I flere studier har vi vist at ECP immunitet er initiert gjennom ex vivo blodplate aktivering i ti plate14,15. Aktiverte blodplater deretter signalisere monocytt-til-dendrittiske celle modning14, som fører til produksjon av fysiologiske DCS. De nyopprettede monocytt DCs er i stand til å krysse-presentere internalisert antigener fra 8-MOPPA-skadet tumorceller å aktivere antigen-spesifikke T celle svar16. Som foreslått tidligere12,17, men 8-MopA-indusert skade av den begynnende DCS selv kan motvirke handling eller reversere anti-tumor effekt11, som gir en mekanistisk link til ECP toleranse.
TI-platen har også blitt brukt til å produsere fysiologisk aktiverte DCs fra humant PBMC. Tilsvarende til musen studier, menneskelige TI-avledede DCs er avhengig av plate-passasje i nærvær av blodplater for sin generasjon, vises phenotypically identisk med disse produsert i klinisk ECP plate, og er i stand til effektivt prosessering og Cross-presentere menneskelige svulst antigener for aktivering av menneskelig T celler11,16.
I avdekke mekanismen for ECP immunterapi, har vi derfor avdekket en metode for raskt å generere fysiologiske mus og menneskelige dendrittiske celler av ønsket antigen spesifisitet, som kan funksjonelt modulert. Den innovative TI enheten og protokollen har betydelig potensiell betydning innen ECP forskning og terapi og kreft immunterapi mer generelt, og i alle andre felt med interesse for fysiologiske, funksjonelle dendrittiske celler i enten immuniserer eller tolerizing modalitet. Vi håper at denne publikasjonen vil gi de nødvendige verktøyene til de med interesse for slike forskningsområder.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

Ekstrakorporal photochemotherapy (ECP) er en mye brukt kreft immunterapi for hud T celle lymfom (CTCL), operative i over 350 universitets sentre over hele verden. Mens ECP ' s kliniske effekt og eksemplarisk sikkerhetsprofil har drevet sin utbredt bruk, elucidation av de underliggende mekanismene har vært en utfordring, delvis på grunn av mangel på en laboratorium ECP modell. For å overvinne denne hindringen og skape en enkel, brukervennlig plattform for ECP-forskning, utviklet vi en skalert ned-versjon av den kliniske ECP-leukocytter, som er egnet for arbeid med både musemodeller og små humane blodprøver. Denne enheten kalles Transimmunization (TI) kammer, eller plate. I en rekke landemerke eksperimenter, den miniatyriserte enheten ble brukt til å produsere en mobilnettet vaksine som jevnlig igangsatt terapeutiske anti-kreft immunitet i flere syngeneic mus tumor modeller. Ved å fjerne enkelte faktorer fra det eksperimentelle systemet og konstatere deres bidrag til in vivo anti-tumor respons, vi da belyst sentrale mekanistisk førere av ECP immuniserer potensiale. Kollektivt, våre resultater avdekket at anti-tumor effekter av ECP er initiert av dendrittiske celler (DC), fysiologisk generert gjennom blod monocytt interaksjon med blodplater i TI plate, og lastet med antigener fra tumorceller som apoptotisk celle døden er fint titrert ved eksponering for photoactivatable DNA kryss-linking agent 8-methoxypsoralen og UVA-lys (8-MOPPA). Når tilbake til musa, denne cellulære vaksinen fører til bestemte og overførbare anti-tumor T-celle immunitet. Vi bekreftet at TI kammeret er også egnet for menneskelig blod behandling, produsere menneskelige DCs fullt sammenlignbare i aktiveringstilstand og profil til de som stammer fra den kliniske ECP kammeret. Protokollene som presenteres her er ment for ECP-studier i mus og mann, kontrollert generering av apoptotisk tumorceller med 8-MOPPA, og rask produksjon av fysiologiske menneskelig og mus monocytt-avledede DCS for en rekke applikasjoner.

Vi har nylig utviklet en mus-til-mann skalerbar miniatyr ECP enhet, TI plate (figur 1a), og utformet tilsvarende behandling protokoller. Apparatet og protokollen avbilde nøkkel Cellular og inne vivo vise egenskaper av immuniserer ECP, betegnet "transimmunization".
Den proof-of-prinsippet murine transimmunization protokoll11 (figur 1B) består av ekstrakorporal ti plate passasje av perifere blod mononukleære celler (PBMC) fra tumor-bærende mus sammen med apoptotisk 8-moppA-eksponert tumorceller. Spesielt er TI-kammeret transparent og dimensjonert for å matche standard mikroskopi lysbilde format, noe som åpner for enkel visualisering av celle interaksjoner innenfor TI-platen på et hvilket som helst punkt i protokollen (Video 1). TI-plate-aktiverte immunceller er inkubert over natten med 8-MOPPA-eksponert apoptotisk tumorceller, tilrettelegge tumor celle opptak, prosessering, og overføring av tumor antigener til DCS. Den påfølgende dagen blir den inkubert celle blandingen returnert til blodstrømmen til tumor bærende dyret. Kontroll dyr gjennomgår identiske blodprøvetakings prosedyrer, å normalisere for noen effekter av lymphodepletion på tumor vekst, men i stedet få PBS re-infusjoner. Tumor vekst i alle dyr overvåkes gjennom hele eksperimentet.
I studier ved hjelp av vi 1.7 syngeneic murine melanom modell18, transimmunization protokollen ble gjentatt to ganger ukentlig over tre uker, for totalt seks behandlinger i hvert dyr (figur 1B). Terapien dukket godt tolerert i alle dyr behandlet (> 100), og konsekvent viste reduksjon på vi 1.7 tumor vekst i behandlet versus kontroll dyr, som observert i 9 uavhengige eksperimenter gjennomført over 2 år (figur 2a, B). Resultatene viser kumulativ tumor vekst data i transimmunization og kontroll dyr over alle eksperimenter utført (figur 2a), samt representative tumor vekst kurver for enkelte dyr i ett eksperiment, for å gi en følelse variasjon i systemet (fig.2b).
Vi fant at protokollen suksess kritisk avhenger av tilstedeværelsen av monocytter i den behandlede PBMC, tilstedeværelsen av blodplater i PBMC brøkdel, og TI plate passasje trinn. Når plate passasje utelates, eller når enten blodplater eller monocytter er utarmet fra PBMC brøkdel, er den terapeutiske effekten ikke lenger observert (figur 3a). Behandlingen krever også tilstedeværelsen av apoptotisk tumorceller. Det er ineffektivt i fravær av enten immunceller eller et antigen kilde, eller i nærvær av feilaktige antigen, for eksempel når mus bærende vi 1,7 svulster behandles ved hjelp MC38 kolon kreftceller (figur 3b). For et immuniserer utfall er det også viktig å unngå PBMC eksponering til 8-MOPPA. 8-MOPA-eksponert PBMC ikke bare oppheve, eller muligens også omvendt, anti-tumor immunitet (figur 3c), men også hemme immuniserer potensialet i ueksponerte celler, som i forsøket der et likt antall 8-moppA-eksponert og 8-mopp En-beskyttet PBMC ble brukt uten Observer anti-tumor effekt (figur 3c).
Med human PBMC, det TI kammeret og det transimmunization protokollen føre til heldig monocytt aktivisering i DC, skille ut av cellen overflate og intracellulære aktivisering markører fra det oppnådd av det klinisk ECP plate (tabell 1). Som i mus studier, DC aktivering (figur 4a) og evnen til transimmunization-genererte DCS å behandle og presentere antigen (figur 4b,C) kritisk avhengig av tilstedeværelsen av blodplater i PBMC, og på ti plate passasje. Den Transimmunization-aktiverte menneskelige DCs effektivt kan behandle og kryss-presentere enten peptid antigener (figur 4b), eller antigener fra hele 8-moppA-eksponert menneskelige tumorceller, for å aktivere Human antigen-spesifikke T cellelinjer i in vitro analyser (figur 4c), i en ti-og blodplate avhengig måte (figur 4b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> Figur 1: Transimmunization (ti) kammer og protokoll skjemaer. (A) diagram og spesifikasjoner av transimmunization behandlings KAMMER (ti plate). (B) skjematisk beskrivelse av transimmunization behandling eksperimentell arbeidsflyt. Kort, dyr er inokulert subkutant (SC) med syngeneic tumorceller; dyr med håndgripelig svulster behandles to ganger ukentlig ved blodprøve, isolering av PBMC fra blod, PBMC Flow passasje gjennom autologous blodplater-belagt TI plate i nærvær av 8-MOPP/UVA-behandlede tumorceller, PBMC og tumor celle co-inkubasjons over natten, og Re-injeksjon av cellene intravenøst i samme svulst bærende dyr. Tumor volum måles gjennom hele eksperimentet. Dette tallet er endret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> Figur 2: Transimmunization kontroller veksten av vi 1.7 melanom syngeneic svulster. (A) vi 1.7 tumor volum over tid PLOTTET for C57BL/6 mus inokulert med 1 x 105 vi 1.7 tumorceller, og mottar enten seks transimmunization behandlinger (svart linje), eller seks kontroll behandlinger (grå linje). Dataene er kumulative over ni uavhengige eksperimenter gjennomført over to år. (B) data fra en enkelt representant vi 1.7 transimmunizaton eksperiment, med hver linje som viser tumor vekst for en individuell mus. (A og B) "PBS kontroll" mus i alle eksperimenter ble blødde på samme timeplan som forsøksdyr, men fikk seks sterile PBS re-infusjoner. Feilfelt representerer SEM, p-verdier beregnet for hvert tids punkt ved hjelp av Sidak ' s Multiple sammenligninger test; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Dette tallet er endret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> Figur 3: Transimmunization krever monocytter og blodplater i TI plate-passerte PBMC brøkdel, samt 8-MOPPen behandling av antigen-matchet tumorceller og 8-moppen sparing av PBMC. (A) vi 1.7 tumor volum over tid PLOTTET for C57BL/6 mus inokulert med 1 * 105 vi 1.7 tumorceller, og mottar enten seks transimmunization behandlinger (solid svarte linjer), seks kontroll behandlinger (solid grå linjer), eller seks ti behandlinger der monocytter eller blodplater ble tømt fra PBMC før plate passasje trinn (ved hjelp av a-CD11b og a-CD41 utarmet kits, henholdsvis), eller plate passasje ble utelatt (stiplede linjer). (B) tumor volum over tid PLOTTET for C57BL/6 mus inokulert med 1 x 105 vi 1.7 tumor celler, og mottar enten seks transimmunization behandlinger (solid svarte linjer), seks kontroll behandlinger (solid grå linjer), PBMC alene (stiplet linje), 8- MOPPa-behandlet vi 1.7 celler alene, eller ti ved hjelp av 8-moppA-behandlet MC38 tumorceller (stiplede linjer). (C) tumor volum over tid PLOTTET for C57BL/6 mus inokulert med 1 x 105 vi 1.7 tumor celler, og mottar enten seks Transimmunization behandlinger (solid svarte linjer), seks kontroll behandlinger (solid grå linjer), seks ti behandlinger der PBMC ble jevnt eksponert for 8-MOPPA umiddelbart før tallerken passasje, seks ti behandlinger der PBMC var jevnt eksponert for 8-moppA umiddelbart etter plate passasje, eller seks behandlinger hvor ti celler etter plate passasje ble blandet 1:1 med et likt antall PBMC som har blitt jevnt eksponert for 8-MOPPen bestråling (prikkete linjer). (A, B og C) "PBS kontroll" mus i alle eksperimenter ble blødde på samme timeplan som forsøksdyr, men fikk seks sterile PBS re-infusjoner. Data er gitt for representative eksperimenter. Barer representerer SEM, P-verdier beregnet for hvert tidspunkt ved hjelp Sidak ' s Multiple sammenligninger test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = forskjeller ikke signifikant. Dette tallet er endret fra11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> Figur 4: TI-protokollen med TI kammer raskt induserer DC modning, unik aktiverings profil, og T celle aktivering kapasitet i menneskelige PBMC, avhengig av plate passasje og blodplater. A. FACS analyse av de indikerte markører i CD11c+ celler blant enten fersk isolert menneskelig PBMC ("kontroll"), PBMC behandlet med TI protokollen ("ti"), eller ti-behandlet PBMC der plate passasje ble utelatt, blodplater ble tømt ved hjelp av a-CD41 perle Kit før plate passasje, eller begge av de ovennevnte ble utført. Data oppsummerer seks uavhengige eksperimenter med tre blodgivere. Stolper representerer middelverdier, mens feil stolper representerer SEM. P-verdier for hver sammenligning beregnet ved hjelp av sammenkoblede t-test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Paneler har blitt endret fra11. B. blodplater som inneholder eller blodplater utarmet ti-behandlet humant PBMC var co-inkubert over natten med en IRRELEVANT (SIINFEKL) peptid, eller med lang peptid for hode-og-nakke plateepitelkreft-assosiert HPV E7 protein. Den PBMC ble deretter brukt til å stimulere en menneskelig CD8 T cellelinje spesielt reaktive til E7 peptid. T celle stimulering ble målt ved IFNg produksjon etter 5 dager med kultur. (C) blodplater som inneholder eller blodplater utarmet ti-behandlet humant PBMC var co-inkubert over natten med 8-moppA-behandlet hode-og nakke plateepitel celle kreftcelle linje SCC61, enten uttrykker (SCC61 HPV E6/7) eller ikke UTTRYKKE (SCC61 ingen HPV ) antigen HPV E6 og E7 proteiner19. Den PBMC ble deretter brukt til å stimulere en menneskelig CD8 T cellelinje spesielt reaktive til E7 peptid. T celle stimulering ble målt ved IFNg produksjon etter 5 dager med kultur. (B og C) Data viser representative eksperimenter med tre replikerer i hver. Stolper representerer middelverdier, mens feil stolper representerer SEM. P-verdier for hver sammenligning beregnet ved hjelp av Sidak ' s Multiple sammenligninger test; , p < 0,001; , p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Markør</td>
			<td>Parameteren</td>
			<td>Ubehandlet</td>
			<td>ECP-plate med TI-protokoll</td>
			<td>TI-plate med TI-protokoll</td>
			<td>p-verdi ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100,1 ± 42,4</td>
			<td>439,8 ± 152,5</td>
			<td>417,7 ± 152,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3,9 ± 1,1</td>
			<td>22,3 ± 7,2</td>
			<td>24,5 ± 7,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>53,3 ± 9,7</td>
			<td>51,4 ± 17,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,8 ± 1,7</td>
			<td>103,9 ± 23,4</td>
			<td>87,1 ± 17,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54,5 ± 12</td>
			<td>721,4 ± 183,6</td>
			<td>528,7 ± 135,5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12,2 ± 1,6</td>
			<td>179,6 ± 28,5</td>
			<td>192,5 ± 25,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53,6 ± 25,7</td>
			<td>97,1 ± 31,6</td>
			<td>103,8 ± 32,8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,6 ± 0,5</td>
			<td>70,1 ± 6,7</td>
			<td>55,2 ± 8,9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,7 ± 0,4</td>
			<td>39,1 ± 7,2</td>
			<td>41,5 ± 4,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>28,0 ± 8,8</td>
			<td>35,3 ± 11,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3,6 ± 0,3</td>
			<td>124,3 ± 25,4</td>
			<td>141,8 ± 33,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (nectin 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,9 ± 1,8</td>
			<td>47,3 ± 5,2</td>
			<td>50,9 ± 9,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,1 ± 2,6</td>
			<td>2,2 ± 1,4</td>
			<td>1,8 ± 1,1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2,9 ± 1,5</td>
			<td>1,0 ± 0,4</td>
			<td>1,2 ± 0,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: ti-protokoll med ti-kammer induserer raskt DC-modning som tilsvarer den indusert av ti-protokollen med det kliniske ECP-kammeret. FACS analyse av endring av de indikerte markører fra tilsvarende IgG-kontroller i levende menneskelige CD11c + celler blant enten fersk isolert PBMC ("ubehandlet"), PBMC passerte gjennom klinisk ECP plate etter TI-protokollen ("ECP plate med TI-protokollen") og analysert følgende over natten inkubasjons, eller PBMC behandlet med TI protokollen ("TI plate med protokollen") og analysert følgende over natten inkubasjons. For markører, for eksempel HLA-DR, der hele celle populasjonen ble endret, uttrykkes data som endring i gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI). For markører der bare et delsett av celler uttrykker merket, for eksempel CCL2, er forskjellen i prosent markør positive celler av levende CD11c + PBMC i stedet representert. Data oppsummerer seks uavhengige eksperimenter med tre blodgivere. Data for hver markør uttrykkes som gjennomsnitt-alder ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). P-verdier for hver sammenligning beregnet ved hjelp av sammenkoblede t test; NS = forskjeller ikke signifikant. Tabellen er endret fra11.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> Video 1: Live celle avbildning av blodplater og immun celle interaksjoner i TI-platen. PBMC ble fremstilt som beskrevet i protokoll del 2 ovenfor og eksponert for transimmunization platen som beskrevet i avsnitt 4, bortsett fra at den statiske inkubasjonsperioden i trinn 4.2.3 ble redusert fra 1 t til 30 min. Under TI-protokollen, var TI plate, som er identisk i størrelse til en standard mikroskop lysbilde, montert inn i lysbildet holder stadium av en fluorescens Imaging system og cellene i den ble avbildet ved 40x forstørrelse og ved 37 ° c under plate fylling (4.2.2 ), plate inkubasjons (4.2.3) og plate strømnings (4.3.5) etapper. Kontinuerlige bilder ble anskaffet og filmer produsert ved hjelp av "automatisert skanning rutine" programvare. Bildetekstene under videoen angir stadiet i protokollen som cellene blir filmet på. Piler og sirkler i videoen, med tilhørende bildetekster, peker ut cellene og områdene av interesse. Skala linjen på 10 μM er til stede i nedre høyre hjørne i hele videoen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Transimmunization (TI) enhet eller plate og relaterte protokoller er utviklet for å gjenskape de viktigste funksjonene i ekstrakorporal photochemotherapy (ECP), i en eksperimentell setting, slik at for produksjon av fysiologisk aktivert, tunable dendrittiske celler (DCs) for kreft immunterapi.

Novel protokoll for generering fysiologiske immunogenic dendrittiske celler

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Fysiologiske dendrittiske antigen-presentere celler, kalt PhDC, er immun master-brytere som initierer antigen-spesifikke T celle immunitet og toleranse. Dette papiret avgrenser en effektiv metode for produksjon av PhDC. Klinisk bruk av dendrittiske celler er hindrer av de ikke-fysiologiske cytokin metodene som brukes til å produsere dem.Vår metode overvinner dette problemet via effektiv blodplatesignalering av monocytt-til-dc-konvertering hos mennesker og mus. Disse PhDC er ikke avhengig av cytokin forhold utilgjengelig in vivo, slik at de kan generere potente kliniske anti-tumor T celleresponser hos både mennesker og mus med etablerte kreftformer. Artsuavhengig blodplateinitiering av monocytt-til-PhDC modning har bred eksperimentell anvendelighet.PhDC tillater disseksjon av dendrittisk cellefysiologi, letter induksjon av terapeutisk anti-kreft immunitet mot immunogene kreftformer, og tilbyr løfte om personlig antimikrobiell vaksinasjon. Dette eksperimentelle systemet er nytt, og flere aspekter av det som belegg av plastkammeret, tumorcellebehandling med 8-MOP / UVA, strømningsforhold og frigjøring av monocytter er best visuelt representert. Å demonstrere prosedyren vil være Eve Robinson, en tekniker fra laboratoriet mitt.For å samle perifere blod mononukleære celler, først sette opp en 15-milliliter rør med fire milliliter av lymfocytt isolasjon medium per fem til 10 mus blødde. Deretter sakte lag blod samlet fra tumorbærende mus på toppen av mediet. Spinn cellene på 1, 000-til 1, 500 ganger-G i 20 minutter for å skille PBMCene fra røde blodlegemer.På slutten av sentrifugering, samle det øverste plasmalaget, slik at 0,5 milliliter igjen over buffy pels, og lagre på fire grader Celsius for senere bruk. Deretter samler du det buffy coat-laget i et rent 15-milliliter rør fylt med PBS til 15 milliliter, og spinner ved 250 ganger-G i en standard vevskultur sentrifuge i 10 minutter for å samle PBMC. På slutten av sentrifugering, forsiktig pipette av supernatant og knipse røret for å gjenopplive pellet.Deretter legger du til to milliliter ACK røde blodlegemer lysis buffer til røret for å fjerne eventuelle gjenværende røde blodlegemer fra PBMC. Inkuber PBMC på is i 10 minutter. Fyll røret med PBS til 15 milliliter, og spinn ned på 250 ganger-G i en standard vevskultur sentrifuge i 10 minutter for å samle PBMC.Pipetten forsiktig av det overnaturlige og knips røret for å løsne pelleten. Resuspend pellet i 300 mikroliter av FBS. For å forberede YUMM1.7 tumorceller per behandlingsgruppe, må du først gjenopplive tumorcellepelleten i FBS ved 2,5 millioner celler per 300 mikroliter.Med vev kultur hette lys av, legge 8-metoksypsoralen for en endelig konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter til YUMM1.7 tumor celle suspensjon. Bland deretter cellene, pakk cellebeholderen i folie og inkuber ved 37 grader Celsius i 20 minutter. For å pre-coat en 12-brønns vev kultur plate, tilsett en milliliter FBS til en brønn for hver behandlingsgruppe på fem mus, og kjøle platen på fire grader Celsius i 20 minutter.Etter 20 minutter, under en vevskulturhette, fjern FBS fra brønnene, og legg til 300 mikroliter metoksypsoralenksponerte tumorceller per brønn. Utsett deretter den celleholdige platen for den forvarmede ultrafiolette En lyskilde for total bestråling av fire joler per kvadratcentimeter. For å samle 8-metoksypsoralen / UVA-behandlet tumorceller fra hver brønn, virvle platen og pipetten nøye for å sikre fullstendig cellegjenoppretting.For å utføre transimmuniseringsplatepassasje for hver behandlingsgruppe på fem mus, kombinere 300 mikroliter av de aktuelle PBMC- og 300 mikroliter med 8-metoksypsoralen/UVA-behandlede tumorceller i et konisk rør på 1,5 milliliter og bland cellene. Deretter åpner du inngangen og utgangsrørklemmene på TI-platen. Bruk en 10-milliliter sprøyte til å fylle TI-slangen med FBS, og lukke klemmene etter hvert som slangen er fylt for å beholde FBS inne i slangen.Koble fra sprøyten. Plasser en P1000 pipettespiss godt inn i TI-plateinntaket. Hold platen i en 45-graders vinkel og fyll platen sakte med PBMC og tumorcelleblanding, unngå bobler.Fjern pipettespissen fra inntaket før pipettestempelet slippes ut. Returner de resterende cellene til det koniske røret på 1,5 milliliter. Inkuber fbs-fylte rør, den cellefylte TI-platen og det koniske røret på 1,5 milliliter som inneholder de gjenværende cellene i vevskulturinkubatoren ved 37 grader Celsius i en time.Etter inkubasjon, slipp klemmene og tøm TI-slangen ved tyngdekraften. Sett deretter inn en P1000 pipettespiss med stempelet trykket inn i plateporten for å fjerne cellene fra TI-platen. Hold platen i en 45-graders vinkel og fyll P1000 pipettespissen.Plasser celler tilbake i det opprinnelige koniske røret på 1,5 milliliter. For å kjøre TI-platen, koble utgangsrøret til platen og fest TI-platen inn i platesystemet. Deretter, ved hjelp av en en-milliliter sprøyte, trekke opp de 600 mikroliter av PBMC og tumor celle blanding fra 1,5-milliliter konisk rør.Fest sprøyten til inngangsrøret med klemmen åpen, og fyll langsomt til væsken når enden av slangen. Fest den frie enden av inngangsrøret til TI-platen og fortsett å laste det gjenværende volumet forsiktig. Lukk inngangsklemmen når du er ferdig.Ta av en milliliter sprøyte og koble inngangsslangen til sprøytepumpen. Fest utgangsslangen til et rent konisk rør på 1,5 milliliter for cellesamling. Juster sprøytepumpestrømningshastigheten til 0,09 milliliter per minutt.Vipp TI-platen ca. 30 grader mot sprøytepumpesiden ved hjelp av en TI-plateløpsplattform. Slipp klemmen forsiktig på inngangsslangen. Start sprøytepumpen, og følg nøye med på hvordan TI-platen fylles.Når TI-platen er helt fylt, vipp den ca. 30 grader i motsatt retning når den tømmes. Når alle cellene i væsken er i det koniske oppsamlingsrøret på 1,5 milliliter, stopp pumpen. For å vaske TI-platen, koble inngangsslangen fra sprøytepumpen, og koble den til en en milliliter sprøyte fylt med 600 mikroliter FBS.Fyll til FBS er fullastet. Koble deretter fra sprøyten og fest slangen til sprøytepumpen. Juster sprøytepumpestrømningshastigheten til 0,49 milliliter per minutt.Slipp inngangsklemmen, og kjør TI-platen, samle vasken i samme 1,5-milliliter konisk rør. Knips eller bank ti platen forsiktig hele tiden for å hjelpe til med å løsne og eluting noen tilhengerceller som platen tømmer. Koble oppsamlingen 1,5 milliliter konisk rør fra TI-plateoppsettet.Spinn oppsamlingsrøret i mikrofusjonen på benkplaten ved 250 ganger-G i åtte minutter og kast det overnaturlige. For å utføre overnattingsinkubasjon av PBMC med antigen, må pbmc- og tumorcellepelleten om natten brukes til å bruke pbmc- og tumorcellepellet i to milliliter klar RPMI supplert med 15 % autolog musserum. Deretter plateceller i en 35-millimeter ikke-vev-kultur behandlet steril rett, og inkubere over natten under standard vev kultur forhold.På neste dag, forsiktig koble eventuelle tilhengere celler fra bunnen av parabolen med en vev kultur skrape. Roter parabolen mens du skraper for å sikre jevn cellesamling. Samle cellene i et 15-milliliter rør.Tilsett to milliliter PBS i parabolen, og gjenta skraptrinnet, samle cellene i samme rør. Skyll 35-millimetersfatet med ett milliliter PBS, og tilsett skyllingen til samme rør. Spinn ved 250 ganger-G i en standard vevskultur sentrifuge i 10 minutter for å samle cellene.Pipette forsiktig av supernatanten, og knips deretter røret for å bruke pelleten på igjen. Terapien viste reduksjon av YUMM1,7 tumorvekst i mer enn 100 behandlede versus kontrollmus, som observert i de kumulative tumorvekstdataene for ni uavhengige eksperimenter utført over to år. De representative tumorvekstkurvene for individuelle dyr i ett eksperiment gir en følelse av variasjon i systemet.Når enten monocytter eller blodplater er utarmet fra PBMC-brøken, eller når platepassasjen utelates, observeres ikke den terapeutiske effekten lenger. Behandlingen er ineffektiv i fravær av enten immunceller eller en antigenkilde, eller i nærvær av et mismatchet antigen, som YUMM1.7 svulster behandlet ved hjelp av MC38 kolonkarsinomceller. For et immuniserende utfall er det også viktig å unngå PBMC-eksponering for 8-metoksypsoralen.FACS analyse av endring av de angitte markører fra tilsvarende IgG-kontroller i menneskelige CD11c + celler blant enten nyisolerte PBMC, TI-behandlet PBMC, TI-behandlet PBMC uten platepassasje, utarmet blodplater før platepassasje, eller begge de ovennevnte, viste at DC-aktivering avhenger av tilstedeværelsen av blodplater i PBMC, og på TI platepassasje. DE TI-aktiverte menneskelige DCene kan effektivt behandle og kryss-presentere enten peptid antigener, eller antigener fra hele 8-metoksypsoralen-eksponerte menneskelige tumorceller for å aktivere humane antigenspesifikke T-cellelinjer i in vitro-analyser på en TI-og blodplateavhengig måte. Spesifisitet av T-celleresponser er avhengig av kilden til de behandlede antigenene.Ved indusering av anti-kreft immunitet, apoptose av hver kreftcellelinje må titreres for å maksimere immunogenisitet. Siden indusert immunitet vil være spesifikk for immuniserende antigener, vil detaljert disseksjon av hvert system være mulig. Hver eksperimentell eller klinisk kreft, og hver antimikrobiell respons, vil være unikt informativ.Hver enkelt menneskelig kreft har sitt eget utvalg av tumorspesifikke antigener. PhDC utfører nødvendig sortering og presentasjon av tumorantigener, uten å kreve deres tidligere laboratorieidentifikasjon. Vær oppmerksom på at 8-MOP og UVA lys er kreftfremkallende stoffer.Bruk egnet verneutstyr og følg sikkerhetsprosedyrer ved håndtering av 8-MOP og når du arbeider med UVA-lyskilder.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Utarbeidelse av Tumor Antigen-lastet Moden dendrittiske celler for Immunterapi

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolere og farging Lymfocytter og dendrittiske celler fra Murine Peyer er Patches

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generering av en ny dendritisk cellevaksine ved hjelp av melanom og squamous kreft stamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T celler Capture Bakterier av Transinfection fra dendrittiske celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generering av umoden, moden og tolerogene dendrittiske celler med ulik Metabolsk fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...