Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Centro Oncológico NIH support Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); la beca de capacitación del Howard Hughes Medical Institute (A. Vassall); y la Fundación del corazón de Nueva York (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). El apoyo parcial fue proporcionado por r01 CA196660-01 a M. Bosenberg.
Los autores están agradecidos al Dr. Robert Tigelaar por su tutoría, orientación y perspicacia experimental. Agradecemos a nuestros colegas de Fraunhofer IBMT, especialmente al Dr. Thorsten Knoll, por el desarrollo y la prestación de la cámara de TI equivalente al ECP. Nicholas Theodosakis amablemente ayudó con las etapas iniciales de los experimentos de YUMM. Agradecemos a nuestros donantes voluntarios de sangre, Inger Christensen y su personal profesional en el centro de tratamiento de la ECP de Yale por ayuda con la adquisición de sangre voluntaria. El Dr. Wendell Yarbrough y la Dra. Natalia Issaeva amablemente compartieron con nosotros las líneas celulares SCC61 y SCC61-E6/7. Para obtener asistencia técnica sobre el proyecto, agradecemos al Dr. Julia Lewis por el Consejo del protocolo FACS, y a E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote en Yale FACS Core. Las imágenes cinematográficas de las células dentro de la placa TI fueron adquiridas con la ayuda de Felix Rivera-Molina, PhD, Dept de biología celular y Yale CINEMA Imaging Center, escuela de medicina de Yale. La producción cinematográfica fue supervisada por Andrew Osborne, Senior video Producer, oficina de comunicaciones, escuela de medicina de Yale.

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

La Universidad de Yale posee patentes derivadas de la investigación de células dendríticas del Prof. Richard Edelson que han sido licenciadas a una empresa start-up de Yale, Transimmune AG. Richard Edelson y Michael Girardi son consultores científicos de Transimmune AG, mientras que Olga Sobolev es una empleada de Transimmune AG. Transimmune AG no tiene ningún producto comercial actual, sin embargo, de forma colaborativa, produce las placas Transimmune utilizadas en este artículo. Es posible que estos tres autores puedan beneficiarse potencialmente de la comercialización de estos descubrimientos en el futuro.

El dispositivo miniaturizado y el protocolo descrito anteriormente por primera vez permiten una investigación de laboratorio eficiente de los mecanismos de ECP en sistemas experimentales de ratón, y en muestras de sangre humana pequeñas. Este es un gran avance; por ejemplo, nos permitió demostrar por primera vez la eficacia de la transimmunización contra tumores sólidos en un modelo de ratón 11, abriendo la posibilidad futura de una aplicación similar en oncología humana.
Antes del desarrollo del dispositivo de transimmunización y el método descrito aquí, era imposible investigar completamente todos los aspectos del ECP. En los modelos de ratón, aunque el 8-MOP un aspecto de la terapia podría ser replicadoun poco por el tratamiento de las células en una placa de Petri12,20, no había capacidad para integrar en el método el pasaje de la plancha, que se ha demostrado que proporcionar interacciones plaquetarias dinámicas que son críticamente importantes para la activación de DC fisiológica de ECP14. En estudios en humanos, alternativamente, el componente de flujo estaba completamente presente, pero la capacidad de exponer selectivamente componentes celulares específicos a 8-MOP a, o para protegerlos de él, faltaba21,22. Esto impidió la comprensión completa del mecanismo de ECP, y su optimización para la inmunidad o tolerancia. Además, la cantidad de sangre necesaria para trabajar con el aparato clínico del ECP es grande, dificultando la investigación científica. El dispositivo y el protocolo ECP miniaturizado descritos aquí por primera vez permiten un modelado ECP de laboratorio eficiente, totalmente flexible y ajustable. Además, la placa TI permite la visualización y monitorización en tiempo real de las interacciones celulares dentro de la placa mediante microscopía.
Para el éxito del protocolo utilizando tanto sistemas in vivo como ex vivo, es fundamental que el PBMC tratado contenga monocitos que puedan activarse en controladores de dominio funcionales. Para que esta activación continúe, también es necesario asegurarse de que la fracción PBMC contiene un número fisiológico de plaquetas sanas y activables, y que el protocolo de pasaje de la placa TI se sigue estrechamente. Con el fin de dirigir los controladores de dominio recién activados hacia una reactividad específica, deben proporcionarse con antígeno. Hemos encontrado que el método más eficiente de la entrega de antígeno para la inmunidad contra el cáncer es la coincubación durante la noche de los controladores de dominio recién activados concélulas tumorales de 8-MOP que contienen antígeno. Esto tiene la ventaja añadida de ser capaz de crear una respuesta contra el cáncer inmunogénica sin necesidad de conocimiento previo de los antígenos del tumor, permitiendo que los DCs seleccionarlos. Sin embargo, en los casos en que se conoce el antígeno, tuvimos cierto éxito en los sistemas ex vivo cuando se utilizan péptidos libres como antígenos en la co-incubación. Para aplicaciones inmunogénicas, los controladores de dominio propios deben protegerse de 8-MOPuna exposición. Por último, en experimentos in vivo, es importante trabajar con un modelo animal que sea capaz de inmunidad antitumoral. La transimmunización funciona mediante la creación de controladores de dominio activados, específicos del antígeno, que trabajan en el cuerpo para iniciar respuestas inmunes innatas y adaptativas. La alteración de la actividad o la falta de las células NK, CD4 o CD8 en el ratón tratado afectará la eficacia del protocolo5,11.
Si bien el protocolo descrito aquí es una prueba de principio que se ha optimizado para un modelo de tumor singénico sólido de ratón, sin embargo, revela muchas oportunidades. Los mecanismos de ECP en oncología sólo están siendo elucidados, y todavía hay mucho espacio para una mejor comprensión. En términos más generales, la capacidad de generar un ratón y un DCs humano activados fisiológicamente, y de dirigirlos selectivamente hacia la inmunidad específica de antígeno, tiene muchas aplicaciones potenciales más allá del cáncer. La capacidad de hacer lo mismo, pero en su lugar dirigir los controladores de dominio hacia la tolerancia antígeno-específica, como se sugiere por la eficacia tolerizante de la propia ECP, también tiene implicaciones médicas de amplio alcance. Con este método, esperamos proporcionar las herramientas y abrir una avenida productiva de la investigación para cualquier persona con un interés en las terapias fisiológicas de DC.

La fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) es una inmunoterapia establecida que es ampliamente operativa en centros universitarios de todo el mundo. Su uso ha sido impulsado por la selectividad única, la seguridad y la eficacia bidireccional de la terapia ECP, rasgos que el ECP comparte con el sistema inmunológico fisiológico en sí con el que parece asociarse. El ECP se inmuniza selectivamente contra las células malignas en el linfoma cutáneo de células T (CTCL)1,2y se toleriza selectivamente para los antígenos específicos en los ajustes de trasplante, autoinmunidad y enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 3 , 4. la inmunogenicidad del ECP se destaca por su dependencia de un compartimento de células CD8 T intacto en CTCL5, mientras que la especificidad se refleja en el perfil de reacción adversa muy favorable de la ECP, sin supresión inmune fuera de la Diana en el trasplante o La configuración de la EICH, y ninguna susceptibilidad de infección oportunista aumentada en CTCL, donde los clones de linfocitos T no patógenos potencialmente podrían perderse junto con los linfocitos T malignos.
Dada la importancia clínica del ECP, la esperanza de que una mejor comprensión de sus mecanismos podría expandir el alcance terapéutico de la ECP a un espectro más amplio de cánceres y trastornos inmunológicos ha estimulado el interés internacional. Se realizaron y informaron dos talleres sancionados nacionalmente, un Simposio de estado de la ciencia de los institutos nacionales de salud (NIH)6 y una asociación americana para la aféresis, Conferencia de consenso7, con el objetivo de acelerar la identificación de los principales contribuyentes celulares a los efectos anticancerígenos y tolerogénicos de la ECP.
Hasta la fecha, a pesar de los numerosos informes publicados que intentan abordar el mecanismo de la ECP, dos obstáculos primarios han impedido avances científicos. En primer lugar, la investigación de los mecanismos del ECP en el entorno del laboratorio experimental se ha limitado por la falta de un dispositivo ECP en miniatura que refleje plenamente los efectos celulares e in vivo de ECP, y se aplique a los modelos animales. En segundo lugar, el análisis exhaustivo de las muestras de ECP en el entorno clínico ha sido restringido por la disponibilidad limitada de células inmunitarias procesadas por el ECP, que requieren acceso a los centros de tratamiento, y están sujetas además al momento de la infusiones del paciente, y la necesidad ética de conjuntos no comprometidos de leucocitos reinfundidos por el paciente.
Para resolver los obstáculos que impiden el avance de la investigación del ECP, nos hemos establecido para desarrollar un aparato de ECP en miniatura que imitaría más estrechamente los elementos clave de la terapia. El tratamiento estándar del ECP involucra el paso de leucocitos enriquecidos con leucoaféresis de un paciente a través de una lámina de plástico de 1 mm de espesor, ULTRAVIOLETA a luz (uva),6,8. En la placa, los leucocitos están expuestos a 8-methoxypsoralen (8-MOP), un agente fotoactivable que sobre la exposición a la UVA se convierte transientemente a una forma reactiva (8-MOP a), capaz de reticulación de ADN a través de su unión bivalente a bases de pirimidina en hermana DNA hebras9,10. Los leucocitos tratados con8 trapos procesados se recogen y se devuelven por vía intravenosa al paciente.
Dado que el ECP en sí es una terapia bidireccional, inmunizando en el cáncer y tolerizing en los ajustes de trasplante, autoinmunidad y Eich, para aclarar hemos nombrado el modo de inmunización del modelo ECP "transimmunization", y el modo tolerogénico "transtolerización". Primero nos centramos en la modalidad de transimmunización. Nuestro dispositivo de ratón a hombre escalable miniaturizado recientemente reportado, la cámara o placa de transimmunización (TI), y el protocolo correspondiente, reproducen los efectos celulares e in vivo del dispositivo ECP humano en un entorno de cáncer11.
Con el fin de hacer que el modelo in vivo de transimmunización sea lo más clínicamente relevante posible, iniciamos la inmunoterapia después de que los tumores singénicos inyectados por vía subcutánea se hicieran palpables, probando así la eficacia del protocolo en el cáncer establecido. Del mismo modo que el ECP en CTCL, el protocolo de transsimmunización de prueba de principio en el modelo YUMM 1.7 de melanoma utiliza células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de animales portadores de tumores. Las células se pasan a través de la placa de TI bajo flujo. Mientras que 8-MOPun tratamiento de las células en la cámara en miniatura es posible, es preferible conducirse por separado, para asegurarse de que sólo el tipo de célula deseada se exponea 8-MOP a. Estudios anteriores indican que el efecto tolerogénico de la ECP está mediado por las células de 8-MOP-que presentanunantígeno lesionado12, mientras que el efecto de inmunización requiere 8-MOPuna lesión de las células del tumor objetivo11. En el protocolo de transimmunización, las células tumorales, o las células inmunitarias, pueden exponerse selectivamente a 8-MOP a según sea necesario. Ya que la maximización del tiempo de contacto entrelas células tumorales de 8-MOP y las células dendríticas inducidas por ECP (DC) ha demostrado mejorar significativamente la capacidad inmunotherapéutica de la clínica ECP13, incorporamos una noche paso de la coincubación a nuestro protocolo. Después de la incubación durante la noche, las células tratadas se devuelven al animal que lleva el tumor.
Este sistema redujo de forma fiable el crecimiento tumoral e inició una inmunidad antitumoral específica en ratones con tumores singénicos establecidos11, y nos permitió diseccionar el mecanismo de la eficacia antitumoral clínica de la ECP. En varios estudios hemos demostrado que la inmunidad a ECP se inicia a través de la activación plaquetaria ex vivo en la placa ti14,15. Las plaquetas activadas posteriormente señalan la maduración14de células monocitos a dendríticas, lo que lleva a la producción de DCS fisiológicas. Los controladores de dominio derivados de monocitos recién formados son capaces de interpresentar antígenos internalizados de células tumorales dañadas por 8-MOP para activar las respuestas de células T de antígeno específicas16. Como se sugirió anteriormente12,17, sin embargo, 8-MOPA-inducida por daño de los propios DCS naciente pueden contrarrestar o incluso revertir el efecto antitumoral11, proporcionando un enlace mecanicista a la tolerancia de la ECP.
La placa TI también se ha utilizado para producir controladores de dominio fisiológicamente activados de PBMC humano. De manera similar a los estudios de ratón, los DCs humanos derivados de TI dependen de la placa-pasaje en presencia de plaquetas para su generación, aparecen fenotípicamente idénticos a estos producidos en la placa clínica ECP, y son capaces de procesar eficientemente y antígenos del tumor humano de presentación cruzada para la activación de células T humanas11,16.
Al descubrir el mecanismo de la inmunoterapia de ECP, por lo tanto hemos descubierto un método para la generación rápida de ratones fisiológicos y células dendríticas humanas de especificidad de antígeno deseada, que pueden ser funcionalmente modulada. El innovador dispositivo y Protocolo de TI tiene una importante importancia potencial en los campos de la investigación y la terapia de ECP y la inmunoterapia del cáncer de manera más amplia, y en cualquier otro campo con interés en las células dendríticas funcionales y fisiológicas, ya sea en la inmunización o la modalidad de tolerizing. Esperamos que esta publicación proporcione las herramientas necesarias a quienes tengan interés en dichas áreas de investigación.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

La fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) es una inmunoterapia de cáncer ampliamente utilizada para el linfoma cutáneo de células T (CTCL), operativa en más de 350 centros universitarios en todo el mundo. Si bien la eficacia clínica y el perfil de seguridad ejemplares de la ECP han impulsado su uso generalizado, la elucidación de los mecanismos subyacentes ha seguido siendo un desafío, en parte debido a la falta de un modelo de laboratorio de ECP. Para superar este obstáculo y crear una plataforma sencilla y fácil de usar para la investigación de ECP, desarrollamos una versión reducida del dispositivo de procesamiento de leucocitos clínico ECP, adecuado para trabajar con modelos de ratón y muestras de sangre humana pequeñas. Este dispositivo se denomina cámara de Transimmunización (TI) o placa. En una serie de experimentos históricos, el dispositivo miniaturizado se usó para producir una vacuna celular que inició regularmente la inmunidad terapéutica contra el cáncer en varios modelos de tumores de ratones singénicos. Al eliminar los factores individuales del sistema experimental y determinar su contribución a la respuesta antitumoral in vivo , se aclararon los impulsores mecánicos clave del potencial de inmunización del ECP. Colectivamente, nuestros resultados revelaron que los efectos antitumorales del ECP son iniciados por las células dendríticas (DC), generadas fisiológicamente a través de la interacción de los monocitos sanguíneos con las plaquetas en la placa TI, y cargadas con antígenos de células tumorales cuya célula apopóntica la muerte se valora finamente por la exposición al agente de reticulación de ADN fotoactivable 8-methoxypsoralen y la luz UVA (8-MOPA). Cuando se devuelve al ratón, esta vacuna celular conduce a la inmunidad de linfocitos T antitumoral específica y transferible. Hemos comprobado que la cámara de TI también es adecuada para el procesamiento de sangre humana, produciendo DCs humano totalmente comparable en estado de activación y perfil a los derivados de la cámara clínica ECP. Los protocolos presentados aquí están destinados a estudios de ECP en ratones y hombres, generación controlada de células tumorales apopónticas con 8-MOPA, y producción rápida de DCS fisiológicos humanos y de ratón derivados de monocitos para una variedad de aplicaciones.

Recientemente desarrollamos un dispositivo ECP en miniatura escalable de ratón a hombre, la placa TI (figura 1A), y diseñamos los protocolos de tratamiento correspondientes. El dispositivo y el protocolo reproducen las principales características celulares e in vivo del ECP inmunizante, denominado "transimmunización".
El protocolo de transimmunización de murina de prueba de principio11 (figura 1B) consiste en el pasaje de la placa de ti extracorpórea de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratones portadores de tumor junto con apopético 8-MOPa– expuesto células tumorales. En particular, la cámara de TI es transparente y de tamaño para que coincida con el formato de diapositiva de microscopía estándar, lo que permite una fácil visualización de las interacciones celulares dentro de la placa de TI en cualquier punto del Protocolo (video 1). Las células inmunes activadas por TI-Plate son incubadas durante la noche con las célulasdel tumor apopético de 8-MOP a-expuesta, facilitando la captación de células tumorales, el procesamiento y la transferencia de antígenos tumorales a los DCS. Al día siguiente, la mezcla celular coincubada se devuelve al torrente sanguíneo del animal que lleva el tumor. Los animales de control se someten a procedimientos de recolección de sangre idénticos, para normalizar los efectos de los linfocitos en el crecimiento tumoral, pero en su lugar reciben reperfusiones de PBS. El crecimiento tumoral en todos los animales se supervisa durante todo el experimento.
En estudios que utilizan el melanoma singénico murino YUMM 1.7 modelo18, el protocolo de transimmunización se repitió dos veces a la semana durante tres semanas, para un total de seis tratamientos en cada animal (figura 1B). La terapia pareció bien tolerada en todos los animales tratados (> 100), y mostró consistentemente reducción del crecimiento tumoral de YUMM 1.7 en animales tratados versus control, como se observó en 9 experimentos independientes realizados durante 2 años (figura 2A, B). Los resultados muestran datos acumulativos de crecimiento tumoral en animales tratados con transimmunización y control sobre todos los experimentos realizados (figura 2A), así como curvas de crecimiento tumoral representativas para animales individuales dentro de un experimento, para proporcionar un sentido de variabilidad en el sistema (figura 2B).
Descubrimos que el éxito del protocolo depende críticamente de la presencia de monocitos en el PBMC Tratado, la presencia de plaquetas en la fracción PBMC y el paso de pasaje de la placa TI. Cuando se omite el pasaje de la placa, o cuando las plaquetas o monocitos se agotan de la fracción PBMC, el efecto terapéutico ya no se observa (figura 3a). El tratamiento también requiere la presencia de células tumorales apopónticas. Es ineficaz en ausencia de las células inmunitarias o de una fuente de antígeno, o en presencia de antígeno no coincidente, por ejemplo cuando los ratones que tienen tumores YUMM 1.7 son tratados usando células de carcinoma de colon MC38 (figura 3B). Para un desenlace vacunal, también es fundamental evitar la exposición a la PBMC a 8-MOP a. 8-MOPA-expuesta PBMC no sólo abrogate, o posiblemente incluso inversa, inmunidad antitumoral (Figura 3C), pero también inhiben el potencial de inmunización de las células no expuestas, como en el experimento donde un número igual de 8-MOPA-expuesto y 8-MOP Se utilizaron PBMC protegidos con unefecto antitumoral observable (Figura 3C).
Con PBMC humano, la cámara de TI y el protocolo de transimmunización conducen a la activación exitosa de los monocitos en DC, indistinguibles por la superficie celular y los marcadores de activación intracelular de los logrados por la placa clínica ECP (tabla 1). Como en los estudios de ratón, la activación de CC (figura 4a) y la capacidad de los controladores de dominio generados por transimmunización para procesar y presentar antígeno (Figura 4B,C) dependen críticamente de la presencia de plaquetas en el PBMC, y en el pasaje de la placa ti. El DCs humano activado por Transimmunización puede procesar y presentar de manera eficaz los antígenos peptídicos (Figura 4B) o los antígenos de las célulastumorales humanas de 8-MOP a-expuestas, para activar las líneas celulares T-específicas del antígeno humano in vitro ensayos (figura 4C), en un ti y de manera dependiente de las plaquetas (Figura 4B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> Figura 1: esquemas de cámara y Protocolo de Transimmunización (TI). (A) diagrama y especificaciones de la cámara de tratamiento de transimmunización (placa ti). (B) Descripción esquemática del flujo de trabajo experimental de tratamiento de transimmunización. Brevemente, los animales son inoculados subcutáneamente (s.c.) con células tumorales singénicas; los animales con tumores palpables son tratados dos veces por semana por el sorteo de sangre, el aislamiento de PBMC de la sangre, el paso de flujo PBMC a través de la placa TI autóloga recubierta de plaquetas en presencia de células tumorales tratadas con 8-MOP/UVA, PBMC y co-incubación de células tumorales durante la noche, y la reinyección de las células por vía intravenosa en los mismos animales portadores de tumor. El volumen del tumor se mide a lo largo del experimento. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> Figura 2: la Transimmunización controla el crecimiento de tumores singénicos YUMM 1.7 melanoma. (A) volumen tumoral yumm 1.7 con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con 1 x 105 yumm 1.7 células tumorales, y recibir seis tratamientos de transimmunización (línea negra), o seis tratamientos de control (línea gris). Los datos son acumulativos de nueve experimentos independientes realizados durante dos años. (B) datos de un experimento único representativo de yumm 1.7 transimmunizaton, con cada línea mostrando el crecimiento del tumor para un ratón individual. (A y B) Los ratones de "control de PBS" en todos los experimentos se sangraron en el mismo horario que los animales experimentales, pero recibieron seis reinfusiones estériles de PBS. Las barras de error representan SEM, los valores p calculados para cada punto de tiempo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> Figura 3: la transimmunización requiere monocitos y plaquetas en la fracción de PBMC aprobada por placa de ti, así comoun tratamiento de 8-MOP a las células tumorales con antígeno y 8-MOPa ahorradores de PBMC. (A) volumen tumoral yumm 1.7 con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales 1 * 105 yumm 1.7, y recibiendo seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), o seis tratamientos de ti donde los monocitos o plaquetas se agotaron de PBMC antes del paso de pasaje de la placa (utilizando kits de depleción a-CD11b y a-CD41, respectivamente), o pasaje de placa fue omitido (líneas de puntos). (B) volumen del tumor con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con 1 x 105 yumm 1.7 células tumorales, y recibir seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), PBMC solo (línea discontinua), 8- Solocélulas yumm 1.7 tratadas con MOP, o ti que utilizan células tumoralesMC38 tratadas con 8 MOP (líneas de puntos). (C) volumen del tumor con el tiempo trazado para ratones C57BL/6 inoculados con células tumorales de 1 x 105 yumm 1.7, y recibiendo seis tratamientos de transimmunización (líneas negras sólidas), seis tratamientos de control (líneas grises sólidas), seis tratamientos de ti donde PBMC fueron expuestos uniformemente a 8-MOP a inmediatamente antes del pasaje de la placa, seis tratamientos de ti donde PBMC estaban uniformemente expuestos a 8-MOP a inmediatamente después del pasaje de la placa, o seis tratamientos donde las células ti después del pasaje de la placa se mezclaron 1:1 con un número igual de PBMC que se han expuesto uniformemente a la irradiación de 8-MOP (líneas de puntos). (A, B y C) Los ratones de "control de PBS" en todos los experimentos se sangraron en el mismo horario que los animales experimentales, pero recibieron seis reinfusiones estériles de PBS. Se proporcionan datos para experimentos representativos. Las barras representan SEM, valores P calculados para cada punto de tiempo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = diferencias no significativas. Esta cifra ha sido modificada a partir de11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> Figura 4: el protocolo de TI con cámara de TI induce rápidamente la maduración de CC, el perfil de activación único y la capacidad de activación de células T en PBMC humano, dependiente del pasaje de la placa y las plaquetas. A. FACS análisis de los marcadores indicados en células CD11c+ entre el PBMC humano recién aislado ("control"), PBMC tratado con el protocolo de ti ("ti"), o PBMC tratado con ti donde se omitió el pasaje de la placa, las plaquetas se agotaron utilizando el a-CD41 kit de perlas antes del pasaje de la placa, o ambos de los anteriores se realizaron. Los datos Resumen seis experimentos independientes con tres donantes de sangre. Las barras representan valores medio, mientras que las barras de error representan SEM. valores P para cada comparación calculada mediante la prueba t emparejada; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Los paneles han sido modificados a partir de11. B. los PBMC humanos tratados con plaquetas o con plaquetas empobrecido se coincubaron durante la noche con un péptido irrelevante (SIINFEKL), o con péptido largo para la proteína de VPH E7 asociada al carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. El PBMC se utilizaron entonces para estimular una línea humana CD8 T célula específicamente reactiva al péptido E7. La estimulación de células T se midió mediante la producción de IFNg después de 5 días de cultivo. (C) PBMC humano con tratamiento de plaquetas o de plaquetas empobrecido, fueron coincubados durante la noche con un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello de 8-MOP tratado conunalínea de células SCC61, ya sea expresando (SCC61 VPH E6/7) o no expresando (SCC61 sin VPH ) las proteínas antigénicas VPH E6 y E719. El PBMC se utilizaron entonces para estimular una línea humana CD8 T célula específicamente reactiva al péptido E7. La estimulación de células T se midió mediante la producción de IFNg después de 5 días de cultivo. (B y C) Los datos muestran experimentos representativos con tres réplicas en cada uno. Las barras representan valores medio, mientras que las barras de error representan SEM. valores P para cada comparación calculada utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak; , p < 0,001; , p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>marcador</td>
			<td>parámetro</td>
			<td>Untreated</td>
			<td>Placa ECP con protocolo de TI</td>
			<td>Placa de TI con protocolo de TI</td>
			<td>valor p ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100,1 ± 42,4</td>
			<td>439,8 ± 152,5</td>
			<td>417,7 ± 152,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3,9 ± 1,1</td>
			<td>22,3 ± 7,2</td>
			<td>24,5 ± 7,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>53,3 ± 9,7</td>
			<td>51,4 ± 17,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,8 ± 1,7</td>
			<td>103,9 ± 23,4</td>
			<td>87,1 ± 17,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54,5 ± 12</td>
			<td>721,4 ± 183,6</td>
			<td>528,7 ± 135,5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12,2 ± 1,6</td>
			<td>179,6 ± 28,5</td>
			<td>192,5 ± 25,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53,6 ± 25,7</td>
			<td>97,1 ± 31,6</td>
			<td>103,8 ± 32,8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,6 ± 0,5</td>
			<td>70,1 ± 6,7</td>
			<td>55,2 ± 8,9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,7 ± 0,4</td>
			<td>39,1 ± 7,2</td>
			<td>41,5 ± 4,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>28,0 ± 8,8</td>
			<td>35,3 ± 11,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3,6 ± 0,3</td>
			<td>124,3 ± 25,4</td>
			<td>141,8 ± 33,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (nectina 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,9 ± 1,8</td>
			<td>47,3 ± 5,2</td>
			<td>50,9 ± 9,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,1 ± 2,6</td>
			<td>2,2 ± 1,4</td>
			<td>1,8 ± 1,1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2,9 ± 1,5</td>
			<td>1,0 ± 0,4</td>
			<td>1,2 ± 0,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: el protocolo de TI con cámara de ti induce rápidamente la maduración de CC equivalente a la inducida por el protocolo de TI con la cámara clínica ECP. Análisis FACS del cambio de los marcadores indicados de los correspondientes controles IgG en células CD11c + humanas vivas entre cualquier PBMC recién aislado ("sin tratar"), PBMC pasó a través de la placa clínica ECP siguiendo el protocolo de TI ("placa ECP con protocolo de TI") y analizado después de la incubación durante la noche, o PBMC tratado con el protocolo de TI ("placa de TI con protocolo") y analizado después de la incubación durante la noche. Para los marcadores, como HLA-DR, donde se modificó toda la población celular, los datos se expresan como cambios en la intensidad media de fluorescencia (IMF). Para los marcadores en los que solo un subconjunto de celdas expresan el marcador, como CCL2, la diferencia en las celdas de porcentaje positivo de marcador de CD11c en vivo + PBMC se representa en su lugar. Los datos Resumen seis experimentos independientes con tres donantes de sangre. Los datos de cada marcador se expresan como un error estándar de la media (SEM). Valores P para cada comparación calculada mediante la prueba t emparejada; NS = diferencias no significativas. La tabla ha sido modificada a partir de11.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> Video 1: imágenes de células vivas de las interacciones de plaquetas e inmunoglobulina dentro de la placa de TI. El PBMC se preparó como se describe en la sección 2 del protocolo anterior y se expuso a la placa de transimmunización como se describe en la sección 4, excepto que el período de incubación estática en el paso 4.2.3 se redujo de 1 h a 30 min. Durante el protocolo de ti, la placa de ti, que es idéntica en tamaño a una diapositiva de microscopio estándar, se ha instalado en la etapa de retención deslizante de un sistema de imágenes de fluorescencia y las celdas dentro de ella se imágenes a 40 aumentos y a 37 ° c durante el llenado de la placa (4.2.2 ), de incubación de placas (4.2.3) y de caudal de placa (4.3.5). Se adquirieron imágenes continuas y se produjeron películas utilizando el software de "rutina de escaneo automatizado". Los subtítulos debajo del video indican la etapa del protocolo en el que se están filmando las celdas. Las flechas y los círculos del vídeo, con los subtítulos asociados, señalan las celdas y las áreas de interés. La barra de escala de 10 μM está presente en la esquina inferior derecha a lo largo del vídeo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Las células de representación de antígenos dendríticos fisiológicos, llamadas PhDC, son los interruptores maestros inmunes que inician la inmunidad y tolerancia de células T específicas del antígeno. Este documento delinea un método eficiente para la producción de PhDC. El uso clínico de células dendríticas se ve obstaculizado por los métodos de citoquina no fisiológica utilizados para producirlas.Nuestro método supera ese problema a través de la señalización plaquetaria eficiente de la conversión de monocitos a CC en humanos y ratones. Estos PhDC no dependen de condiciones de citoquinas no disponibles in vivo, por lo que pueden generar potentes respuestas clínicas contra tumores de células T tanto en humanos como en ratones con cánceres establecidos. El inicio plaquetario independiente de la especie de maduración monocito a phDC tiene una amplia aplicabilidad experimental.PhDC permite la disección de la fisiología de células dendríticas, facilita la inducción de la inmunidad terapéutica contra el cáncer a los cánceres inmunogénicos y ofrece promesas para la vacunación antimicrobiana personalizada. Este sistema experimental es novedoso, y múltiples aspectos de la misma, como el recubrimiento de la cámara de plástico, el tratamiento de células tumorales con 8-MOP/UVA, las condiciones de flujo y la liberación de monocitos están mejor representados visualmente. Demostrando el procedimiento estará Eve Robinson, una técnico de mi laboratorio.Para recoger las células mononucleares de sangre periférica, primero configure un tubo de 15 mililitros con cuatro mililitros de medio de aislamiento de linfocitos por cada cinco a 10 ratones sangraron. Luego, la sangre de capa lenta se extrae de ratones portadores de tumores en la parte superior del medio. Gire las células a 1.000 a 1.500 veces-G durante 20 minutos para separar los PBMC de los glóbulos rojos.Al final de la centrifugación, recoger la capa de plasma superior, dejando 0.5 mililitros queman por encima de la capa de buffy, y almacenar en cuatro grados Celsius para su uso posterior. A continuación, recoja la capa de capa buffy en un tubo limpio de 15 mililitros lleno de PBS a 15 mililitros, y gire a 250 veces G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger el PBMC. Al final de la centrifugación, pipetee cuidadosamente el sobrenadante y deslice el tubo para resuspender el pellet.Luego agregue dos mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos ACK al tubo para eliminar los glóbulos rojos restantes de la PBMC. Incubar el PBMC sobre hielo durante 10 minutos. Llene el tubo con PBS a 15 mililitros, y gire hacia abajo a 250 veces-G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger el PBMC.Pipetee cuidadosamente el sobrenadante y deslice el tubo para aflojar el pellet. Resuspender el pellet en 300 microlitros de FBS. Para preparar células tumorales YUMM1.7 por grupo de tratamiento, primero resuspendir el gránulo de células tumorales en FBS en 2,5 millones de células por cada 300 microlitros.Con las luces de la campana de cultivo de tejido apagadas, agregue 8-methoxypsoralen para una concentración final de 100 nanogratro por mililitro a la suspensión de células tumorales YUMM1.7. A continuación, mezcle las células, envuelva el recipiente celular en papel de aluminio e incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Para pre-recubrir una placa de cultivo de tejido de 12 pozos, agregue un mililitro de FBS a un pozo por cada grupo de tratamiento de cinco ratones, y refrigerar la placa a cuatro grados Centígrados durante 20 minutos.Después de 20 minutos, bajo una capucha de cultivo de tejido, retire la FBS de los pozos y agregue 300 microlitros de células tumorales expuestas por metoxipsoralen por pozo. A continuación, exponga la placa que contiene la célula a la fuente de luz ultravioleta precalentó para la irradiación total de cuatro julios por centímetro cuadrado. Para recoger células tumorales tratadas con 8-methoxypsoralen/UVA de cada pozo, gire la placa y la pipeta cuidadosamente para asegurar una recuperación completa de la célula.Para realizar el paso de la placa de transimunización para cada grupo de tratamiento de cinco ratones, combine 300 microlitros del PBMC apropiado y 300 microlitros de células tumorales tratadas con 8-methoxypsoralen/UVA en un tubo cónico de 1,5 mililitros y mezcle las células. A continuación, abra las abrazaderas de tubo de entrada y salida de la placa TI. Utilice una jeringa de 10 mililitros para llenar el tubo TI con FBS, cerrando las abrazaderas mientras se llena el tubo para retener FBS dentro del tubo.Desconecte la jeringa. Coloque una punta de pipeta P1000 firmemente en la toma de la placa TI. Sostenga la placa en un ángulo de 45 grados y llene la placa lentamente con PBMC y mezcla de células tumorales, evitando burbujas.Retire la punta de la pipeta de la toma antes de soltar el émbolo de la pipeta. Devuelva las células restantes al tubo cónico de 1,5 mililitros. Incubar el tubo lleno de FBS, la placa TI llena de células y el tubo cónico de 1,5 mililitros que contiene las células restantes en la incubadora de cultivo de tejido a 37 grados celsius durante una hora.Después de la incubación, suelte las abrazaderas y vacíe el tubo TI por gravedad. A continuación, inserte una punta de pipeta P1000 con el émbolo presionado en el puerto de la placa para extraer las celdas de la placa TI. Sujete la placa en un ángulo de 45 grados y llene la punta de la pipeta P1000.Coloque las células de nuevo en su tubo cónico original de 1,5 mililitros. Para ejecutar la placa TI, conecte el tubo de salida a la placa y fije la placa TI en el sistema de funcionamiento de la placa. A continuación, utilizando una jeringa de un mililitro, extraiga esos 600 microlitros de PBMC y mezcla de células tumorales del tubo cónico de 1,5 mililitros.Fije la jeringa al tubo de entrada con la abrazadera abierta y llene lentamente hasta que el líquido llegue al final del tubo. Coloque el extremo libre del tubo de entrada a la placa TI y continúe cargando suavemente el volumen restante. Cierre la abrazadera de entrada cuando haya terminado.Separe la jeringa de un mililitro y conecte el tubo de entrada a la bomba de la jeringa. Asegure el tubo de salida a un tubo cónico limpio de 1,5 mililitros para la recolección celular. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,09 mililitros por minuto.Incline la placa TI aproximadamente 30 grados hacia el lado de la bomba de la jeringa utilizando una plataforma de funcionamiento de la placa TI. Suelte con cuidado la abrazadera del tubo de entrada. Encienda la bomba de la jeringa, observando cuidadosamente cómo se llena la placa TI.Una vez que la placa TI esté completamente llena, inclínelo aproximadamente 30 grados en la dirección opuesta a medida que se vacía. Cuando todas las células del líquido estén en el tubo de recogida cónica de 1,5 mililitros, detenga la bomba. Para lavar la placa TI, desconecte el tubo de entrada de la bomba de la jeringa y conéctelo a una jeringa de un mililitro llena de 600 microlitros de FBS.Rellene hasta que FBS esté completamente cargado. A continuación, desconecte la jeringa y conecte el tubo a la bomba de la jeringa. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,49 mililitros por minuto.Suelte la abrazadera de entrada y ejecute la placa TI, recogiendo el lavado en el mismo tubo cónico de 1,5 mililitros. Deslice o toque suavemente la placa TI todo el tiempo para ayudar a separar y eluir las células adherentes a medida que la placa se vacía. Desconecte el tubo cónico de 1,5 mililitros de la placa TI.Gire el tubo de recogida en la microfure de sobremesa a 250 veces G durante ocho minutos y deseche el sobrenadante. Para realizar la coincimocimiento durante la noche de PBMC con antígeno, primero resuspendir el PBMC y el pellet de células tumorales en dos mililitros de RPMI claro complementado con 15% de suero de ratón autólogo. Luego, las células de la placa en un plato estéril tratado con cultivo de tejido no de 35 milímetros, e incubar durante la noche bajo condiciones estándar de cultivo de tejido.Al día siguiente, separe cuidadosamente las células adherentes de la parte inferior del plato con un rascador de cultivo de tejido. Gire el plato mientras raspa para asegurar una recolección uniforme de la célula. Recoger las células en un tubo de 15 mililitros.Añadir dos mililitros de PBS al plato, y repetir el paso de raspado, recogiendo las células en el mismo tubo. Enjuague el plato de 35 milímetros con un mililitro de PBS, y agregue el enjuague al mismo tubo. Girar a 250 veces-G en una centrífuga de cultivo de tejido estándar durante 10 minutos para recoger las células.Pipetear cuidadosamente el sobrenadante, luego mover el tubo para resuspender el pellet. La terapia mostró una reducción del crecimiento tumoral de YUMM1.7 en más de 100 ratones tratados frente a ratones de control, como se observa en los datos acumulados de crecimiento tumoral de nueve experimentos independientes realizados durante dos años. Las curvas representativas de crecimiento tumoral para animales individuales dentro de un experimento proporcionan una sensación de variabilidad en el sistema.Cuando los monocitos o las plaquetas se agotan de la fracción PBMC, o cuando se omite el paso de la placa, el efecto terapéutico ya no se observa. El tratamiento es ineficaz en ausencia de las células inmunitarias o de una fuente de antígeno, o en presencia de un antígeno no coincidente, como tumores YUMM1.7 tratados con células de carcinoma de colon MC38. Para un resultado inmunizante, también es fundamental evitar la exposición de PBMC a 8-methoxypsoralen.El análisis FACS del cambio de los marcadores indicados de los controles IgG correspondientes en células CD11c+ humanas entre PBMC recién aislado, PBMC tratado con TI, PBMC tratado con TI sin paso de placa, plaquetas agotadas antes del paso de la placa, o ambos de los anteriores, mostró que la activación de CC depende de la presencia de plaquetas en el PBMC, y del paso de la placa TI. Los DC humanos activados por TI pueden procesar y presentar eficazmente antígenos de péptidos o antígenos de células tumorales humanas expuestas a 8-methoxypsoralen para activar líneas celulares T específicas de antígenos humanos en ensayos in vitro de una manera dependiente de TI y plaquetas. La especificidad de las respuestas de los células T depende de la fuente de los antígenos procesados.Al inducir la inmunidad contra el cáncer, la apoptosis de cada línea de células cancerosas debe valorarse para maximizar la inmunogenicidad. Dado que la inmunidad inducida será específica para inmunizar antígenos, será posible una disección detallada de cada sistema. Cada cáncer experimental o clínico, y cada respuesta antimicrobiana, será únicamente informativo.Cada cáncer humano individual tiene su propia variedad de antígenos específicos del tumor. El PhDC realiza la clasificación y presentación necesarias de antígenos tumorales, sin necesidad de su identificación previa de laboratorio. Tenga en cuenta que la luz 8-MOP y UVA son carcinógenos.Utilice el equipo de protección adecuado y siga los procedimientos de seguridad cuando manipule 8-MOP y cuando trabaje con fuentes de luz UVA.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...