Name: novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Support för NIH Cancer Center Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Howard Hughes Medical Institute utbildnings gemenskap (A. Vassall); och NY hjärt stiftelse (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Partiellt stöd tillhandahölls av r01 CA196660-01 till M. Bosenberg.
Författarna är tacksamma för Dr Robert Tigelaar för hans mentors Kap, vägledning och experimentell insikt. Vi tackar våra kollegor på Fraunhofer IBMT, särskilt Dr Thorsten Knoll, för att utveckla och tillhandahålla ECP-motsvarigheten TI-kammaren. Nicholas Theodosakis hjälpte vänligt med inledande stadier av YUMM experiment. Vi tackar våra frivilliga blod givare, Inger Christensen och hennes professionella personal på Yale ECP Treatment Center för hjälp med frivillig blod upphandling. Dr Wendell Yarbrough och Dr Natalia Issaeva vänligt delade med oss SCC61 och SCC61-E6/7 cellinjer. För tekniskt stöd på projektet, tackar vi Dr Julia Lewis för FACS protokoll råd, och E. menet, G. Tokmoulina, C. Cote på Yale FACS core. Film bilder av celler inom TI plattan förvärvades med hjälp av Felix Rivera-Molina, PhD, Institutionen för cell bio logi och Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Film produktionen övervakades av Andrew Osborne, Senior Video Producer, kommunikations byrån, Yale School of Medicine.

Alla mus metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid Yale University, i samförstånd med de nationella instituten för djur hälso rikt linjer. Alla studier på människa utfördes med blod som donerats av friska frivilliga, med skriftligt informerat samtycke. Human blod studier genomfördes i enlighet med erkända etiska rikt linjer (t. ex., förklaring av Helsingfors, CIOMS, Belmont rapport, US common rule), och godkändes av Yale Human prövnings nämnden Review styrelsen under protokoll nummer 0301023636.
Anmärkning: Följande är det protokoll som beskriver transimmunization för anti-tumör terapi av mus syngena tumörer.
1. syngenisk YUMM 1,7 tumör implantation
<ol><li>Följ etablerade protokoll för att implantatet syngena tumörer i flanker av möss som lämpar sig för tumör cell raden av intresse. Anmärkning: Protokollet nedan beskriver YUMM 1.7 C57BL/6 mus melanom tumör modell. YUMM 1,7 melanom celler var vänligt tillhandahålls av Dr Bosenberg, Yale18.</li>
	<li>
Tina en fryst alikvot av celler och Använd celler efter en cell passage. Kultur nytinade YUMM 1,7 celler i Dulbecco modifierade Eagle näringsämne blandning F-12 medium (DMEM/F12), kompletteras med 10% Värmeinaktiverade Foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, och 1% icke-essentiella aminosyror, enligt standard vävnads odlings förhållanden (37 ° c, 5% CO2).
	<ol>
<li>Samla YUMM 1,7 celler vid 60 \ u201270% sammanflödet genom att lägga till tillräckligt trypsin-EDTA för att täcka botten av cell odlings plattan eller kolven (t. ex. 4 mL för en T75-kolv).</li>
		<li>Vila cell kultur fartyg i rums temperatur för 3 \ u20124 min, försiktigt knacka på under sidan eller sidorna av kärlet ibland för att hjälpa lossa cellerna.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL fetalt bovint serum (FBS) per 4 mL trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att stoppa reaktionen när de flesta cellerna lossnar. Samla cellerna genom att Pipettera till ett 15 mL koniskt rör. Skölj kolven med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt sköljvätskan till samma samlings rör. Fyll röret till 15 mL med PBS.</li>
		<li>Ta ut en liten alikvot och räkna cellerna.</li>
		<li>Snurra i 10 min på 250 x g i en vanlig vävnads odlings centrifug för att samla in tumör cellerna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omsuspendera YUMM 1,7 celler i PBS vid densitet 1 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Injicera 1 x 105 yumm 1,7 tumör celler subkutant i 100 μl PBS i de högra sidorna av mottagare 4 till 6-veckors-gamla vild typ manliga C57BL/6j möss, sövda enligt institutionella rikt linjer (t. ex. 3 \ u20125% isofluran inhalant gas, anestesi bekräftas av brist på baktass nypa reflex).</li>
	<li>Övervaka tumör volym via varannan vecka mätningar av vinkel räta tumör dia metrar och höjd med hjälp av en Caliper. Beräkna YUMM 1.7 (tumör volym som tumör längd x bredd x höjd)/2.</li>
	<li>Initiera transimmunization terapi när tumörer blir bara påtaglig; för YUMM 1,7 tumörer, detta är vanligt vis dag 7 \ u201210 efter tumör implantation.</li>
</ol>2. insamling av perifera blod mononukleära celler för Transimmunization
<ol><li>Samla in 100 \ u2012150 μL blod från varje tumör bär ande mus via kind blödning.</li>
	<li>När blod samlas in, samla blod från varje mus behandlings grupp (varje 5 experimentella möss + 5 kontroll möss) i en enda 15 mL tub som innehåller 5 000 U/mL heparin. Använd 10 μL 10% heparin per 100 μL blod som samlats in. Anmärkning: Blanda röret ofta under uppsamling för att undvika blod koagulation. Medan kontroll tumör-bärande möss kan blöda samtidigt som de experimentella möss, för att säkerställa lika villkor med behandlings gruppen, kan "kontroll" blod antingen kasseras, eller i kombination med blod i behandlings gruppen för att ge ytterligare experimentella PBMC för behandlings gruppen, efter utredarnas gottfinnande.</li>
	<li>Ställ in 1 15 mL tub med 4 mL lymfocytisolerings medium (se material tabell) per 5 \ u201210 möss blödde. Långsamt lager blod (som samlats in från tumör-bärande möss) ovanpå mediet. Snurra cellerna i 20 min vid 1000 \ u20121, 500 x g för att separera PBMC från röda blod kroppar.</li>
	<li>Vid slutet av centrifugering, samla den översta plasma skiktet, lämnar ~ 0,5 mL kvar över Buffy Coat, och lagra vid 4 °C för senare användning (steg 7,1).</li>
	<li>Samla in Buffy Coat lagret i en ren 15 mL tub, fyll med PBS till 15 mL, och snurra i 10 min på 250 x g i en standard vävnad kultur centrifug för att samla in PBMC.</li>
	<li>Försiktigt Pipettera utanför supernatanten, och omsuspendera pelleten genom att snärta röret. Inte decant, eftersom pelleten är mjuk och kan förloras. Tillsätt 2 mL ACK röd blodcellslyssningsbuffert (se material tabell) till röret för att avlägsna kvarvarande röda blod kroppar från PBMC. Inkubera på is i 10 min.</li>
	<li>Fyll röret med PBS till 15 mL, och snurra ner i 10 min på 250 x g i en vanlig vävnads odlings centrifug för att samla in PBMC.</li>
	<li>Försiktigt Pipettera utanför supernatanten, och omsuspendera pelleten genom att snärta. Inte decant, eftersom pelleten är mjuk och kan förloras. Anmärkning: I detta steg kan den renade PBMC ändras på bästa möjliga passar experimentet. De olika PBMC-komponenterna (blodplättar, monocyter, andra immun cells typer) kan utarmas eller isoleras från PBMC efter behov. Dessutom kan PBMC själva utsättas för 8-MOPA, antingen före eller efter avsnitt 4 (före eller efter plattpassage-efter avsnitt 2 eller före avsnitt 5), genom att följa protokollet steg 3.3 \ u 20123.8 och ersätta PBMC för yumm 1.7-celler. Detta kommer att trunkera den immunogena kapaciteten av behandlingen, och i stället främja immun försvaret tolerans.</li>
	<li>För varje behandlings grupp (varje 5 experimentella möss + 5 kontroll möss), Återsuspendera PBMC-pelleten i 300 μL FBS.</li>
</ol>3.8-MOP/UVA behandling av tumör celler
<ol><li>Kultur och samla YUMM 1,7 tumör celler som beskrivs i steg 1.2 – 1.3 för att förbereda en 8-MOPA-exponerade tumör cell antigen källa.</li>
	<li>Förbered 2,5 x 106 yumm 1,7 tumör celler per behandlings grupp på 5 möss. För varje behandlings grupp, omsuspendera tumör cells pelleten i FBS vid 2,5 x 106 celler/300 μl (~ 8,33 x 106 celler/ml).</li>
	<li>Med vävnad kultur huva lyser av, tillsätt 8-MOP (se tabell över material) till yumm 1,7 tumör cell SUS pensionen för en slutlig 8-mopp koncentration av 100 ng/ml. Varning: 8-MOP är ett fotoactivatable DNA-skadande medel och cancerframkallande. Var försiktig vid hantering och dispensering, Undvik kontakt med exponerad hud och kassera på lämpligt sätt.</li>
	<li>Blanda cellerna väl, Linda cell behållaren i aluminiumfolie, och inkubera i 20 min vid 37 °C.</li>
	<li>Pre-Coat en 12-väl vävnad kultur plattan genom att fylla en brunn för varje behandlings grupp på 5 möss (2,5 x 106 yumm 1,7 tumör celler) med 1 ml FBS, och kyl skåp fylld plattan för 20 min vid 4 °C.</li>
	<li>Slå på UVA-ljuskällan för att förvärma den. Var försiktig: UVA-ljus är ett cancerframkallande ämne. När du arbetar med UVA-ljus kan du arbeta snabbt och varsamt, skydda huden mot exponering och använda ansikts sköldar eller skydds glasögon för att skydda ansikte och ögon.</li>
	<li>Efter 20 min, flytta den kylda 12-brunnsplattan (steg 3,5) till vävnaden kultur huven, ta bort FBS från brunnar, och tillsätt 300 μL (2,5 x 106 celler/brunn) MOP-exponerade tumör celler (från steg 3,4) per brunn.</li>
	<li>Exponera den cell innehåll ande plattan för den förvärmda UVA-ljuskällan för total bestrålning av 4 J/cm2. Anmärkning: 8-MOP koncentration och UVA dos beskrivs här är kalibrerade för YUMM 1,7 tumör cellinjen. En titrering av 8-MOP/UVA DOS, tillräckligt för att orsaka 100% tumör celldöd inom 1 vecka efter exponering, bör utföras för varje experimentell tumör cellinjen, för att fastställa effektiv avlivning DOS. Detta är av avgörande betydelse för mus in vivo-experiment, eftersom cellerna reinjiceras retro-Orbitally (steg 6,1) och därmed alla oskadade tumör celler kan annars bilda ögon tumörer hos det behandlade djuret. Som en rikt linje, 4 \ u20128 J/cm2 av UVA, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, är det typiska effektiva intervallet för de flesta tumör cellinjer.</li>
	<li>Samla in 8-MOPA-behandlade tumör celler från varje brunn, snurra plattan och Pipettera noggrant för att säkerställa fullständig cell återhämtning.</li>
</ol>4. TI skylt passage av celler
<ol><li>För varje behandlings grupp på 5 möss, kombinera i ett 1,5 mL koniskt rör 300 μL av lämplig PBMC (från steg 2,11) och 300 μL av 8-MOPA-behandlade tumör celler (från steg 3,9). Blanda cellerna.</li>
	<li>Använd en 10 mL spruta för att fylla "ingången" och "exit"-uppsättningarna av TI-slang (se Material tabell) med FBS. Öppna slang klämmorna för att fylla rören och stäng klämmorna när rören fylls innan du kopplar loss sprutan, för att behålla FBS inuti slangen.</li>
	<li>Använd en P1000 pipett för att lägga till PBMC-och tumör cells mixen (från steg 4,1) till TI-plattan (se material tabellen). Håll plattan i en 45° vinkel, Placera pipettspetsen ordentligt i ti-plattans intag och fyll plattan långsamt och Undvik bubblor.</li>
	<li>Ta bort pipettspetsen från intaget innan du släpper pipettkolven. Plattan rymmer 450 μL; återstående cellerna till 1,5 mL koniskt rör.</li>
	<li>Inkubera den FBS-fyllda slangen, den cellfyllda TI-plattan och 1,5 mL koniska röret som innehåller de återstående cellerna i vävnads kulturens inkubator vid 37 °C för 1 h. Efter inkubation, Töm TI slangen genom gravitation, frigöra klämmorna.</li>
	<li>Använd en P1000-pipett för att ta bort cellerna från TI-plattan genom att föra in pipettspetsen med kolven nedtryckt i plattans port. Håll plattan i en 45° vinkel och fyll P1000 pipettspetsen. Placera cellerna tillbaka i sitt ursprungliga 1,5 mL koniskt rör.</li>
	<li>För att köra TI plattan, Anslut exit röret till plattan och säkra TI plattan i plattan kör systemet.</li>
	<li>Använd en 1 mL spruta, dra upp 600 μL PBMC och tumör cell mix från 1,5 mL koniska röret, bli av med eventuella bubblor i sprutan, fäst sprutan i ingångs röret med klämman öppen och sakta fylla tills vätskan når änden av slangen.</li>
	<li>Fäst den fria änden av ingångs röret på TI-plattan och fortsätt försiktigt fylla på resterande volym. Stäng ingångs klämman.</li>
	<li>Lossa 1 mL-sprutan och Anslut ingångs slangen till sprutpumpen. Säkra utträdes slangen till en ren 1,5 mL konisk tub för cell insamling.</li>
	<li>Justera sprutpumpens flödes hastighet till 0,09 mL/min, men starta inte pumpen ännu. Luta TI-plattan ~ 30° mot sprutpumpens sida, med hjälp av en ti-plattans kör plattform eller på något annat sätt (t. ex. ett litet plant föremål under den ena änden av plattan).</li>
	<li>Lossa försiktigt klämman på ingångs slangen. Starta sprutpumpen, Observera noga hur TI plattan fyller, och snärt slangar eller plattan vid behov om eventuella luft bubblor hindrar flödet.</li>
	<li>När TI plattan är helt fylld, luta den ~ 30° i motsatt riktning som det tömmer. När alla celler och vätska är i 1,5 mL konisk samlings röret, stoppa pumpen.</li>
	<li>För att tvätta TI-plattan, koppla loss ingångs slangen från sprutpumpen, Anslut till en 1 mL Spruta fylld med 600 μL FBS, och följ proceduren för steg 4.8 \ u 20124.9.</li>
	<li>Justera sprutpumpens flödes hastighet till 0,49 mL/min, lossa ingångs klämman och kör TI-plattan enligt beskrivningen i steg 4.12 \ u 20124.13, uppsamling av tvätten i samma 1,5 mL koniska rör. Snärta eller knacka på ti plattan försiktigt hela tiden, för att hjälpa till att lossa och avgivande alla anhängare celler.</li>
	<li>Snurra samlingen 1,5 ml koniskt rör i bänk mikrofugrör på 250 x g för 8 min. Kassera supernatanten.</li>
</ol>5. beredning av autologous Mouse serum för övernattning kultur medium
<ol><li>Samla in blod från 10 \ u201212 vecka gamla C57BL/6j möss av någon institutionellt godkänd metod (t. ex. ögonblödning, svans venblödning, kind blödning, eller Terminal utfallning av hjärt punktering), utan antikoagulantia. Uppskattning samla in 1 mL blod för varje 300 μL av serum som behövs. Anmärkning: Man skulle behöva 300 μL serum för varje behandlings grupp på 5 möss i experimentet.</li>
	<li>Låt blodet koagulera över natten vid 4 ° c.</li>
	<li>Snurra ner det koagulerade blodet vid 3 000 x g i 15 min. samla försiktigt in den översta serum-innehållande skiktet Anmärkning: Serum kan användas omedelbart för att göra natten cell inkubation medium (steg 6,1), eller bevaras för framtida experiment. För att bevara serumet, frys i Ali kvoter vid-20 ° c.</li>
</ol>6. övernattning co-inkubation av PBMC med antigen
<ol><li>Omsuspendera PBMC och tumör cell pellet (steg 4,5) i 2 mL klar RPMI med 15% autologa mus serum (beredd i steg 5). Platta i en 35 mm icke-vävnadsbehandlad steril mat rätt och inkubera över natten under normala vävnads odlings förhållanden (37 ° c, 5% CO2). Anmärkning: Om PBMC används med en icke-cellulär antigen (peptid, Nanopartikel, protein, etc.), utelämna avsnitt 3 i protokollet, och fortsätt från avsnitt 2 direkt till avsnitt 4, lägga till önskat antigen till TI plattan passerade PBMC för övernattning co-inkubation här i steg 6,1.</li>
	<li>På följande dag, försiktigt ta bort alla anhängare celler från botten av skålen med en vävnad kultur skrapa, roterande skålen medan skrapning för att säkerställa även cell insamling. Samla cellerna i en 15 mL tub.</li>
	<li>Tillsätt 2 mL PBS till skålen och upprepa skrapnings steget, samla in cellerna i samma tub. Skölj 35 mm skålen med 1 mL PBS och tillsätt sköljvätskan till samma tub.</li>
	<li>Snurra i 10 min på 250 x g i en standard vävnads odlings centrifug för att samla cellerna. Försiktigt Pipettera utanför supernatanten och omsuspendera pelleten genom att snärta röret. Inte decant, eftersom pelleten är mjuk och kan förloras.</li>
</ol>7. återinjektion av TI-behandlade celler i Tumörbärande möss
<ol><li>Snurra upp autolog plasma (beredd i steg 2,4) på 750 x g i 15 min för att sediment några partiklar. Omsuspendera cellpelleten (från steg 6,4) i 600 μL autologt plasma eller PBS.</li>
	<li>Injicera celler på 100 μL per mus i retro-orbital plexus av lämpligt bedövade (t. ex., 3 \ u20125% Isoflurane inhalant gas, anestesi bekräftas av brist på baktass nypa reflex) tumörbärande experimentella möss. Om så önskas, re-injicera kontroll tumör uthärda möss med 100 μl av autolog plasma ensam, eller PBS.</li>
	<li>För YUMM 1,7 tumörbärande möss, upprepa behandlingen (steg 2 – 7.2) två gånger i veckan i 3 veckor, för totalt 6 behandlingar. Samla in och behandla PBMC från tumörbärande möss varje vecka (protokoll avsnitt 2 \ u20124) på måndagar och torsdagar, och återinfusera efter övernattning inkubation (protokoll avsnitt 5 \ u20127) på tisdagar och fredagar. Anmärkning: Denna behandlingsregim utvecklades för specifika tillväxtkinetik av YUMM 1,7 tumörer hos möss. Det kan behöva titreras för andra tumör system med långsammare eller snabbare tumör tillväxt hastigheter-respektive öka eller minska antalet behandlingar.</li>
	<li>Övervaka tumör volym via varannan vecka mätning-helst vid tiden för behandling administration (tisdag och fredag)-av vinkel räta tumör dia metrar och höjd med hjälp av en kaliper. Avsluta experimentet när kontroll tumör volymer når maximal storlek tillåts av institutionella rikt linjer och protokoll.</li>
</ol>8. protokoll anpassning för behandling av Ssmall volym av humant blod
<ol><li>Anpassa protokollet för användning med mänskliga celler genom att först isolera PBMC från humant blod. Använd heparin som antikoagulantia, med alla föredragna PBMC-isoleringsprotokoll.</li>
	<li>Se till att den isolerade PBMC-fraktionen innehåller ett fysiologisk antal blodplättar för bästa protokoll resultat. Övervaka trombocyt antal pre-och post-PBMC isolering med någon standard hematologi räknare.</li>
	<li>Om du använder en mänsklig cell antigen källa, behandla de mänskliga antigen cellerna enligt de steg som beskrivs i avsnitt 3 för YUMM 1,7 celler. Titrera 8-MOP-och UVA-doserna därefter.</li>
	<li>Utför plattpassage steg som beskrivs i avsnitt 4 med upp till 3 x 107 PBMC per ti-plåt.</li>
	<li>Kultur PBMC över natten med cellulära/andra antigen val, som beskrivs i avsnitt 6, men Ersätt 15% humant AB serum för autolog mus plasma för natten kultur mediet i steg 6,1.</li>
	<li>Använd de resulterande cellerna i önskad analys. Till exempel, samodling med antigen-reaktiva T-celler för att observera antigen-specifika T-cellsvar som initieras av de TI-behandlade cellerna.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results.">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li><li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens.">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li><li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI:+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent.">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li><li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation.">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li><li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy.">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li><li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis:+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis.">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li><li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+council+on+ECP+(ACE):+Why+now?.">American council on ECP (ACE): Why now?.</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li><li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy:+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation.">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li><li>Gasparro, F. P., Dall&#8217;Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).</li><li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes.">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity.">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li><li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+(PET+cells).+Is+in+vivo+cell+transferrable?.">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li><li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma:+A+phase+I+study.">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li><li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy:+Initiation+via+direct+platelet+signaling.">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li><li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy:+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin.">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li><li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells.">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li><li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms.">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li><li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. , (2016).</li><li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival.">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li><li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes.">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li><li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease.">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li><li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells:+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy.">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li></ol>

Yale University äger patent som härrör från dendritiska cell forskning av prof. Richard Edelson som har licensierats till ett Yale nystartade företag, Transimmune AG. Richard Edelson och Michael Girardi är vetenskapliga konsulter till Transimmune AG, medan Olga Sobolev är en Transimmune AG anställd. Transimmune AG har inte någon ström reklamfilm produkter, however på ett Collaborative bas producerar det de Transimmune pläterar använt i denna artikel. Det är möjligt att dessa tre författare potentiellt skulle kunna dra nytta av kommersialiseringen av dessa upptäckter i framtiden.

Miniatyriserad enhet och protokoll som beskrivs ovan för första gången möjliggör en effektiv laboratorie undersökning av mekanismerna för ECP i mus experimentella system, och i små humana blod prov. Detta är ett stort framsteg; till exempel tillät det oss att visa för första gången effekten av transimmunization mot solida tumörer i en mus modell 11, öppna den framtida möjligheten av en liknande tillämpning i mänsklig onkologi.
Innan utvecklingen av transimmuniseringsenheten och metoden som beskrivs här, var det omöjligt att fullt ut undersöka alla aspekter av ECP. I mus modeller, även om 8-MOPen aspekt av terapin kunde replikeras något genom att behandla celler i en petriskål12,20, det fanns ingen förmåga att integrera i metoden plattan passage, som har visat sig dynamiska trombocyt interaktioner som är kritiskt viktiga för ECP: s fysiologiska DC-aktivering14. I mänskliga studier, alternativt, flödet komponenten var fullt närvarande, men möjligheten att selektivt exponera specifika cellulära komponenter till 8-MOPA, eller för att skydda dem från det, saknades21,22. Detta hindrade fullständig förståelse av ECP mekanism, och dess optimering för immunitet eller tolerans. Dessutom är den mängd blod som krävs för att arbeta med den kliniska ECP-apparaten stor och hämmar den vetenskapliga utredningen. Den miniatyriserade ECP-enheten och det protokoll som beskrivs här för första gången möjliggör effektiv, helt flexibel och avstämbara ECP-modellering för laboratorier. Dessutom möjliggör TI-plattan real tids visualisering och övervakning av cellinteraktioner inom plattan genom mikroskopi.
För protokollets framgång med både in vivo-och ex vivo-system är det viktigt att den behandlade PBMC innehåller monocyter som kan aktive ras i funktionella domänkontrollanter. För att denna aktivering ska fortsätta, är det också nödvändigt att se till att PBMC-fraktionen innehåller ett fysiologisk antal friska, activatable blodplättar, och att TI plattan passage protokollet följs noggrant. För att styra de nyligen aktiverade DCs mot en specifik reaktivitet måste de förses med antigen. Vi har funnit att den mest effektiva metoden för antigen leverans för anti-cancer immunitet är övernattning co-inkubation av de nyligen aktiverade DCs med antigen-innehåll ande 8-MOPA-exponerade tumör celler. Detta har den extra fördelen att kunna skapa en immunogent anti-cancer svar utan nödvändiggör tidigare kunskaper om tumörantigener, genom att låta DCs att välja dem. Men i fall där antigenet är känt, vi hade viss framgång i ex vivo-system när du använder fria peptider som antigener i Co-inkubation. För immunogena tillämpningar bör DCs själva skyddas från 8-MOPA Exposure. Slutligen, i in vivo experiment, det är viktigt att arbeta med en djur modell som är kapabel till anti-tumör immunitet. Transimmunization fungerar genom att skapa aktiverade, antigen-specifika DCS, som arbetar i kroppen för att initiera medfödda och adaptiva immun svar. Nedsatt aktivitet eller brist på NK, CD4, eller CD8 T celler i den behandlade musen kommer att påverka protokollets effekt5,11.
Även om protokollet som beskrivs här är ett Proof-of-princip en som har optimerats för en mus solid syngena tumör modell, avslöjar det ändå många möjligheter. Mekanismerna för ECP i onkologi är bara klarlagd, och det finns fortfarande mycket utrymme för bättre förståelse. Mer allmänt, förmågan att generera fysiologiskt aktive rad mus och mänskliga domänkontrollanter, och att selektivt rikta dem mot antigen-specifik immunitet har många potentiella tillämpningar bortom cancer. Förmågan att göra samma sak, men istället styra DCs mot antigen-specifik tolerans, som föreslås av tolerizing effekt av ECP själv, har också omfattande medicinska konsekvenser. Med denna metod hoppas vi kunna tillhandahålla verktyg och öppna en produktiv aveny för forskning för alla med ett intresse för fysiologisk DC terapier.

Extracorporeal fotokemoterapi (ECP) är en etablerad immun terapi som är allmänt operativ i universitets centra över hela världen. Dess användning har drivits av unik selektivitet, säkerhet och dubbelriktad effekt av ECP-behandling, egenskaper som ECP delar med det fysiologiska immun systemet självt med vilket det verkar partner. ECP är selektivt immuniseringsämnet mot de maligna cellerna i kutan T-cellslymfom (ctcl)1,2, och selektivt tolerizing för riktade antigener i transplantationen, autoimmunitet, och graft-versus-host sjukdom (GVHD) inställningar 3 för att , 4. immunogeniciteten hos ECP framhävs av dess beroende av ett intakt CD8 T-cellfack i ctcl5, medan specificitet återspeglas av ECP: s mycket gynnsamma biverknings profil, utan någon icke-målimmunsuppression vid transplantation eller GvHD-inställningar, och ingen ökad opportunistisk infektions känslighet i CTCL, där icke-patogena T-cellsoner potentiellt kan gå förlorade tillsammans med de maligna T-cellerna.
Med tanke på den kliniska betydelsen av ECP, hoppas att bättre förståelse av dess mekanismer kan utvidga ECP: s terapeutiska räckvidd till ett bredare spektrum av cancer och immunologiska störningar har stimulerat internationellt intresse. Två nationellt sanktionerade workshops, ett nationellt institut för hälsa (NIH) State-of-The-Science symposium6 och ett amerikanskt samhälle för aferes konsensus konferens7, genomfördes och rapporteras, i syfte att påskynda identifiering av de främsta cellulära bidrags givarna till ECP: s anti-cancer och tolerogena effekter.
Trots många publicerade rapporter som försöker ta itu med ECP: s mekanism har två primära hinder hittills hindrat vetenskapliga framsteg. För det första har undersökning av ECP-mekanismerna i experiment laboratoriets inställning begränsats av avsaknaden av miniatyr-ECP-enheter som helt skulle återspegla ECP: s cellulära och in vivo-effekter och vara tillämpliga på djur modeller. För det andra har djupgående laboratorie analyser av ECP-prover i den kliniska miljön begränsats av den begränsade till gången på ECP-bearbetade patient immun celler, som kräver till gång till behandlings centra, och är dessutom föremål för tidpunkten för patientens infusioner och det etiska behovet av kompromisslös uppsättning av patient-reinbrända leukocyter.
För att lösa hindren för utvecklingen av ECP: s forskning har vi föresatt oss att utveckla en miniatyr ECP-apparat som närmast skulle efterlikna de viktigaste delarna av terapin. Standard behandling med ECP innebär passage av patientens leukaferes-berikade leukocyter genom en 1 mm tjock, ultraviolett en ljus (UVA)-transparent, plast platta6,8. I plattan, är leukocyter utsätts för 8-metoxipsoralen (8-MOP), en foto-activatable agent som vid UVA-exponering är transitivt omvandlas till en reaktiv form (8-MOPa), kan DNA tvär bindning via dess bivalenta bindning till pyrimidinbaser på syster DNA Strands9,10. Bearbetade, 8-MOPA-behandlade leukocyter samlas in och returneras intravenöst till patienten.
Eftersom ECP själv är en dubbelriktad terapi, immuniseringsämnet i cancer och tolerizing i transplantation, autoimmunitet och GVHD inställningar, för tydligande vi har namngett modell ECP immuniseringsläge "transimmunization", och tolerogena läge "transtolerization". Vi fokuserade först på transimmunization modalitet. Vår nyligen rapporterade miniatyriserade skalbara mus-till-man ECP-enhet, transimmunization (TI) kammaren eller plattan, och motsvarande protokoll, reproducera både cellulära och in vivo effekterna av Human ECP enheten i en cancer inställning11.
För att göra transimmuniseringen in vivo-modellen så kliniskt relevant som möjligt, initierade vi immun terapi efter subkutant injicerade syngena mus tumörer blev påtaglig, vilket testar protokollets effektivitet i etablerad cancer. På samma sätt som ECP i CTCL, den Proof-of-princip transimmunization protokoll i YUMM 1,7 modell av melanom använder perifera blod mononukleära celler (PBMC) från tumör-bärande djur. Cellerna leds genom TI-plattan under flöde. Medan 8-MOPen behandling av celler i miniatyr kammaren är möjligt, är det bättre att utföra det separat, för att säkerställa att endast den önskade cell typen utsätts för 8-MOPA. Tidigare studier visar att ECP: s tolerogena effekt medieras av 8-MOPa-skadade antigen-presenterande celler12, medan immuniserande effekten kräver 8-MOPen skada av mål tumör celler11. I transimmuniseringsprotokollet kan antingen tumör cellerna, eller immun cellerna, selektivt exponeras för 8-MOPA vid behov. Eftersom maximera tiden för kontakt mellan 8-MOPA-skadade tumör celler och ECP-inducerad dendritiska celler (DC) har visat sig signifikant förbättra den immunterapeutiska kapaciteten hos kliniska ECP13, införlivade vi en över natten inkuberingsteg i vårt protokoll. Efter nattens inkubation återförs de behandlade cellerna till det tumör bär ande djuret.
Detta system minskade tillförlitligt tumör tillväxt och initierade specifika anti-tumör immunitet hos möss med etablerade syngena tumörer11, och tillät oss att dissekera mekanismen för ECP: s kliniska anti-tumör effekt. I flera studier har vi visat att ECP immunitet initieras genom ex vivo trombocyt aktivering i ti-plattan14,15. Aktiverade trombocyter signalerar därefter den monocyter-till-dendritiska cellmognaden14, vilket leder till produktion av fysiologisk DCS. De nybildade monocyter-härledda DCs kan cross-present internaliserade antigener från 8-MOPA-skadade tumör celler för att aktivera antigen-specifika T cell svar16. Som föreslagits tidigare12,17, dock 8-MOPA-inducerad skada av de begynnande DCS själva kan kontra-Act eller ens vända anti-tumör effekt11, vilket ger en mekanistisk länk till ECP tolerans.
TI-plattan har också använts för att producera fysiologiskt aktiverade domänkontrollanter från mänsklig PBMC. På samma sätt som mus studierna är humana TI-härledda domänkontrollanter beroende av plattpassage i närvaro av blodplättar för sin generation, förefaller fenotypisk identisk med dessa produceras i den kliniska ECP plattan, och kan effektivt bearbeta och Cross-presenterande humana tumör antigener för aktivering av humana T-celler11,16.
Genom att avslöja mekanismen för ECP-immunoterapi har vi därför avslöjat en metod för att snabbt generera fysiologisk mus och humana dendritiska celler av önskad antigen-specificitet, som kan vara funktionellt modulerade. Den innovativa ti-enheten och protokollet har stor potentiell betydelse inom områdena för ECP: s forskning och terapi och cancer immunoterapi mer allmänt, och på alla andra områden med intresse för fysiologiska, funktionella dendritiska celler i antingen immuniseringsämnet eller den tolerizing modaliteten. Vi hoppas att denna publikation kommer att ge de verktyg som behövs till dem som har intresse av sådana forsknings områden.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td>
			<td >Therakos, Inc</td>
			<td >Rx only, NDC No. 64067-0216-01</td>
			<td >Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB serum</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >14-498E</td>
			<td>Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACK red cell lysis buffer</td>
			<td >Lonza BioWhittaker</td>
			<td >10-548E</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging</td>
			<td >VetEquip</td>
			<td >901820</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse plasma</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 2.4, use in&#160; 7.1 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autologous mouse serum</td>
			<td >prepare in lab</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57Bl/6J mice</td>
			<td >Jackson labs</td>
			<td >0000664</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um</td>
			<td >Medipoint</td>
			<td >9891620</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear RPMI</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11835-030</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM/F12</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11330-032</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyGrip Petri Dishes, 35mm</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >351008</td>
			<td>Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf 1.5mL conical tubes</td>
			<td >DOT scientific</td>
			<td >1700-GMT</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated)</td>
			<td >SAFC Biosciences</td>
			<td >12306C-500mL</td>
			<td>Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemavet 950FS hematology counter</td>
			<td >Drew Scientific</td>
			<td >HV950FS</td>
			<td>Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin 5,000U/mL</td>
			<td >McKesson Packaging services</td>
			<td>949512</td>
			<td>Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Abbott Laboratories</td>
			<td >5260-04-05</td>
			<td>Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lympholyte M lymphocyte isolation medium</td>
			<td >Cedarlane Labs</td>
			<td >CL5035</td>
			<td>Protocol step 2 - mouse PBMC preparation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-essential amino acids</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >11140-050</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >14190-144</td>
			<td>Protocol steps 1-7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/strep</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >15140-122</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 15mL conical tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352097</td>
			<td>Protocol steps 1-8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable 2-channel syringe pump</td>
			<td >New Era Pump Systems Inc</td>
			<td >model NE-4000</td>
			<td>Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305109</td>
			<td>Protocol step 7 - mouse TI treatment administration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 10mL (LUER-LokTip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309604</td>
			<td>Protocol steps 4, 8 - running the TI plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes, 1mL (Slip tip)</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >309659</td>
			<td>Protocol steps 1, 4, 7, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate and tubing set</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TI plate running platform</td>
			<td >Transimmune AG</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture flasks, T75 (75 cm2)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353136</td>
			<td>Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture plates, 12-well</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353043</td>
			<td>Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue culture scrapers</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353085</td>
			<td>Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.25% (1x)</td>
			<td >Gibco by LifeTech</td>
			<td >25200-056</td>
			<td>Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tumor injection needles, 25G x 5/8</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >305122</td>
			<td>Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UVA irradiator</td>
			<td >Johnson and Johnson</td>
			<td >not commercially available&#160;</td>
			<td >The apparatus was specifically developed by J&#38;J for Prof. R. Edelson&#39;s laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td>fluorescence imaging instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel protocol for generating physiologic immunogenic dendritic cells

Extracorporeal fotokemoterapi (ECP) är en allmänt använd cancer immunoterapi för kutan T-cellslymfom (CTCL), operativa i över 350 universitets centra över hela världen. Samtidigt som ECP: s kliniska effekt och exemplariska säkerhets profil har drivit sin utbredda användning, har en klargörande av de bakomliggande mekanismerna varit en utmaning, delvis på grund av avsaknad av ett laboratorium ECP-modell. För att övervinna detta hinder och skapa en enkel, användarvänlig plattform för ECP-forskning, utvecklade vi en avskalad version av den kliniska ECP-leukocytprocessenheten, lämplig för arbete med både mus modeller och små blod prov från människa. Denna enhet kallas Transimmunization (TI) kammare, eller tallrik. I en serie av landmärke experiment, miniatyriserade enheten användes för att producera ett cell vaccin som regelbundet inledde terapeutisk anti-cancer immunitet i flera syngena mus tumör modeller. Genom att ta bort enskilda faktorer från det experimentella systemet och fastställa deras bidrag till in vivo anti-tumör svar, klargjorde vi sedan viktiga mekanistiska förare av ECP immuniseringsämnet potential. Sammantaget visade våra resultat att anti-tumöreffekter av ECP initieras av dendritiska celler (DC), fysiologiskt genereras genom blod monocyter interaktion med trombocyter i TI plattan, och laddad med antigener från tumör celler vars apoptotiska cell döden titreras fint genom exponering för det fotoactivatable DNA-tvär bindnings medlet 8-metoxipsoralen och UVA-ljus (8-MOPa). När återvände till musen, detta cellulära vaccin leder till specifika och överförbara anti-tumör T-cell immunitet. Vi kontrollerade att TI kammaren är också lämplig för mänsklig blod bearbetning, producerar humana DCs helt jämförbar i aktiverings tillstånd och profil till de som härrör från den kliniska ECP kammaren. De protokoll som presenteras här är avsedda för ECP studier i mus och människa, kontrollerad generation av apoptotiska tumör celler med 8-MOPA, och snabb produktion av fysiologiska humana och möss monocythärledda domänkontrollanter för en mängd olika tillämpningar.

Vi har nyligen utvecklat en mus-till-man skalbar miniatyr ECP-enhet, TI plattan (figur 1a), och utformade motsvarande behandlings protokoll. Enheten och protokollet reproducera viktiga cellulära och in vivo funktioner av immuniseringsämnet ECP, kallas "transimmunization".
Den Proof-of-princip murina transimmunization protokoll11 (figur 1b) består av extrakorporeal ti plattan passage av perifera blod mononukleära celler (PBMC) från tumör-bärande möss tillsammans med apoptotiska 8-MOPA-exponerade tumör celler. Särskilt är ti kammaren transparent och dimensionerad för att matcha standard mikroskopi bild format, vilket möjliggör enkel visualisering av cell interaktioner inom ti plattan på någon punkt i protokollet (video 1). De TI-Plate-aktiverade immun cellerna inkuberas över natten med 8-MOPA-exponerade apoptotiska tumör celler, vilket underlättar tumör cells upptag, bearbetning och överföring av tumörantigener till DCS. Dagen därpå återförs den co-ruinerade cell blandningen till blod flödet hos det tumör bär ande djuret. Kontrol lera djuren genomgå identiska blod insamlings förfaranden, att normalisera för alla effekter av lymfoutarmning på tumör tillväxt, men i stället få PBS re-infusioner. Tumör tillväxt i alla djur övervakas under hela experimentet.
I studier med YUMM 1.7 syngenisk murin melanom modell18, transimmunization protokollet upprepades två gånger i veckan under tre veckor, för totalt sex behandlingar i varje djur (figur 1b). Terapin verkade tolereras väl i alla behandlade djur (> 100), och konsekvent visade minskning av YUMM 1,7 tumör tillväxt i behandlade kontra kontroll djur, som observerats i 9 oberoende experiment som genomfördes under 2 år (figur 2A, B). Resultaten visar kumulativa tumör tillväxt data i transimmunization-behandlade och kontroll djur över alla utförda experiment (figur 2A), samt representativa tumör tillväxt kurvor för enskilda djur inom ett experiment, för att ge en känsla variationer i systemet (figur 2b).
Vi fann att protokollets framgång kritiskt beror på närvaron av monocyter i den behandlade PBMC, närvaron av trombocyter i PBMC-fraktionen, och TI-plattans passage steg. När plattpassage utelämnas, eller när antingen trombocyter eller monocyter är uttömda från PBMC-fraktionen, observeras inte längre den terapeutiska effekten (figur 3a). Behandlingen kräver också förekomst av apoptotiska tumör celler. Det är verkningslöst i avsaknad av antingen immun celler eller en antigen källa, eller i närvaro av inkompatibla antigen, till exempel när möss som bär YUMM 1.7 tumörer behandlas med MC38 kolon cancer celler (figur 3b). För en immuniseringsämnet resultat är det också viktigt att undvika PBMC exponering för 8-MOPA. 8-MOPA-exponerade PBMC inte bara abrogate, eller möjligen även omvänd, anti-tumör immunitet (figur 3c), men också hämmar immuniseringsämnet potential oexponerade celler, som i experimentet där ett lika stort antal 8-MOPA-exponerade och 8-MOP A-skyddad PBMC användes utan observerbar antitumöreffekt (figur 3c).
Med mänsklig PBMC, ti kammare och transimmunization protokoll leda till framgångs rik monocyt aktiveringen in i DC, omöjlig att skilja vid cell yta och intracellulära aktiveringen märken från så pass uträttat vid den klinisk ECP platta (tabell 1). Som i mus studier, DC aktivering (figur 4a) och förmågan att transimmunization-genererade DCS att bearbeta och presentera antigen (figur 4b,C) kritiskt beroende av närvaron av blodplättar i PBMC, och på ti plattan passage. Den Transimmunization-aktiverade humana DCs kan effektivt behandla och Cross-present antingen peptid antigen (figur 4b), eller antigener från hela 8-MOPA-exponerade humana tumör celler, för att aktivera humana antigen-specifika T cellinjer i in vitro (figur 4c), i ett ti-och trombocyt beroende sätt (figur 4b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg"> Figur 1: Transimmunization (TI) kammare och protokoll scheman. (A) diagram och specifikationer för behandlings kammaren för transimmunisering (TI-plattan). (B) Schematisk beskrivning av transimmuniseringsbehandling experimentellt arbets flöde. Kort, djur är inokulerade subkutant (s.c.) med syngena tumör celler; djur med palpabla tumörer behandlas två gånger i veckan genom blod provs dragning, isolering av PBMC från blod, PBMC-flödespassage genom den autologa trombocytbelagda TI-plattan i närvaro av 8-MOP/UVA-behandlade tumör celler, PBMC och tumör cells co-inkubation över natten, och Återinjicering av cellerna intravenöst i samma tumör bär ande djur. Tumör volym mäts under hela experimentet. Siffran har ändrats från11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg"> Figur 2: Transimmunisering styr tillväxten av YUMM 1,7 melanom syngena tumörer. (A) yumm 1,7 tumör volym över tiden plottas för C57BL/6 möss inokuleras med 1 x 105 yumm 1,7 tumör celler, och får antingen sex transimmunization behandlingar (svart linje), eller sex kontroll behandlingar (grå linje). Data är kumulativa över nio oberoende experiment som genomförts under två år. (B) uppgifter från en enda representativ yumm 1.7 transimmunizaton experiment, med varje rad som visar tumör tillväxt för en enskild mus. (A och B) "PBS-kontroll" möss i alla experiment var blödde på samma schema som försöks djuren, men fick sex sterila PBS re-infusioner. Felstaplar representerar SEM, p-värden beräknade för varje tidpunkt med hjälp av Sidaks multipla jämförelse test; * *, p = 0,0013; , p < 0,0001. Siffran har ändrats från11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg"> Figur 3: transimmunisering kräver monocyter och trombocyter i ti-skylt-passerade PBMC fraktion, samt 8-MOPen behandling av antigen-matchade tumör celler och 8-MOPen kaliumsparande av PBMC. (A) yumm 1,7 tumör volym över tiden PLOTTAS för C57BL/6 möss inokuleras med 1 * 105 yumm 1,7 tumör celler, och får antingen sex transimmunization behandlingar (fasta svarta linjer), sex kontroll behandlingar (fast grå linjer), eller sex ti behandlingar där monocyter eller trombocyter var uttömda från PBMC före plattan passage steg (med a-CD11b och a-CD41 utarmning kit, respektive), eller plattan passage utelämnades (prickiga linjer). (B) tumör volym över tiden plottas för C57BL/6 möss inokulerade med 1 x 105 yumm 1,7 tumör celler, och fick antingen sex transimmunization behandlingar (fasta svarta linjer), sex kontroll behandlingar (fast grå linjer), PBMC ensam (streckad linje), 8- MOPa-behandlade yumm 1,7 celler ensam, eller TI med 8-MOPA-behandlade MC38 tumör celler (prickade linjer). (C) tumör volym över tiden plottas för C57BL/6 möss inokulerade med 1 x 105 yumm 1,7 tumör celler, och fick antingen sex transimmunization behandlingar (fasta svarta linjer), sex kontroll behandlingar (fast grå linjer), sex ti behandlingar där PBMC var jämnt exponerade för 8-MOPa omedelbart före plattpassage, sex ti behandlingar där PBMC var jämnt exponerade för 8-MOPa omedelbart efter plattan passage, eller sex behandlingar där ti celler efter plattan passage var blandade 1:1 med lika många PBMC som är jämnt exponerade för 8-MOPa bestrålning (prickade linjer). (A, B och C) "PBS-kontroll" möss i alla experiment var blödde på samma schema som försöks djuren, men fick sex sterila PBS re-infusioner. Uppgifter lämnas för representativa experiment. Staplar representerar SEM, P-värden beräknade för varje tidpunkt med hjälp av Sidaks multipla jämförelse test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001; NS = skillnader som inte är signifikanta. Siffran har ändrats från11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg"> Figur 4: TI-protokollet med TI-kammaren inducerar snabbt DC-mognad, unik aktiverings profil och T-cells aktiverande kapacitet i Human PBMC, beroende på plattpassage och trombocyter. A. FACS analys av de indikerade markörer i CD11c+ celler bland antingen nyligen isolerade humana PBMC ("kontroll"), PBMC behandlas med ti-protokollet ("TI"), eller ti-behandlad PBMC där plattan passage utelämnades, trombocyter utarmat med hjälp av a-CD41 bead kit före plattpassage, eller båda av ovanstående utfördes. Data sammanfattar sex oberoende experiment med tre blod givare. Staplar representerar medelvärden, medan felstaplar representerar SEM. P-värden för varje jämförelse beräknad med hjälp av parade t-test; *, p < 0,05; * *, p < 0,01. Panelerna har modifierats från11. B. trombocythämmande eller TROMBOCYTHÄMMANDE ti-behandlad människa PBMC var co-inkuberas över natten med en irrelevant (SIINFEKL) peptid, eller med lång peptid för huvud-och-hals skivepitelcancer-associerade HPV E7 protein. Den PBMC användes sedan för att stimulera en mänsklig CD8 T cellinjen specifikt reaktiva till E7 peptid. T-cellstimulering mättes med IFNg-produktion efter 5 dagars kultur. (C) trombocytinnehållande eller TROMBOCYTHÄMMANDE ti-behandlad Human PBMC inkuberades över natten med 8-MOPA-behandlad skivepitelcancer i huvud-och hals cells cancer cellinjen SCC61, antingen uttrycker (SCC61 HPV E6/7) eller inte uttrycker (SCC61 ingen HPV ) de antigena HPV E6-och E7-proteinerna19. Den PBMC användes sedan för att stimulera en mänsklig CD8 T cellinjen specifikt reaktiva till E7 peptid. T-cellstimulering mättes med IFNg-produktion efter 5 dagars kultur. (B och C) Data visar representativa experiment med tre replikat i varje. Staplar representerar medelvärden, medan felstaplar representerar SEM. P-värden för varje jämförelse som beräknas med Sidaks multipla jämförelse test; , p < 0,001; , p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Markör</td>
			<td>Parametern</td>
			<td>Obehandlade</td>
			<td>ECP-skylt med TI-protokoll</td>
			<td>TI-skylt med TI-protokoll</td>
			<td>p-värde ECP vs TI</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100,1 ± 42,4</td>
			<td>439,8 ± 152,5</td>
			<td>417,7 ± 152,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD80</td>
			<td>Δ</td>
			<td>3,9 ± 1,1</td>
			<td>22,3 ± 7,2</td>
			<td>24,5 ± 7,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>53,3 ± 9,7</td>
			<td>51,4 ± 17,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,8 ± 1,7</td>
			<td>103,9 ± 23,4</td>
			<td>87,1 ± 17,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mer från PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54,5 ± 12</td>
			<td>721,4 ± 183,6</td>
			<td>528,7 ± 135,5</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12,2 ± 1,6</td>
			<td>179,6 ± 28,5</td>
			<td>192,5 ± 25,4</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53,6 ± 25,7</td>
			<td>97,1 ± 31,6</td>
			<td>103,8 ± 32,8</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,6 ± 0,5</td>
			<td>70,1 ± 6,7</td>
			<td>55,2 ± 8,9</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL5</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,7 ± 0,4</td>
			<td>39,1 ± 7,2</td>
			<td>41,5 ± 4,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CXCL16</td>
			<td>Δ</td>
			<td>0,3 ± 0,2</td>
			<td>28,0 ± 8,8</td>
			<td>35,3 ± 11,7</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3,6 ± 0,3</td>
			<td>124,3 ± 25,4</td>
			<td>141,8 ± 33,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD112 (Nectin 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,9 ± 1,8</td>
			<td>47,3 ± 5,2</td>
			<td>50,9 ± 9,2</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10,1 ± 2,6</td>
			<td>2,2 ± 1,4</td>
			<td>1,8 ± 1,1</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2,9 ± 1,5</td>
			<td>1,0 ± 0,4</td>
			<td>1,2 ± 0,6</td>
			<td>Ns</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: ti-protokollet med ti-kammaren inducerar snabbt DC-mognad motsvarande det som induceras av TI-protokollet med den kliniska ECP-kammaren. FACS analys av förändringar av de indikerade markörer från motsvarande IgG-kontroller i levande mänskliga CD11c + celler bland antingen nyligen isolerade PBMC ("obehandlad"), passerade PBMC genom den kliniska ECP plattan efter TI-protokollet ("ECP plattan med TI-protokollet") och analyseras efter övernattning inkubation, eller PBMC behandlas med TI-protokollet ("TI plattan med protokoll") och analyseras efter natten inkubation. För markörer, såsom HLA-DR, där hela cell populationen ändrades, uttrycks data som förändring i medelfluorescensintensiteten (MFI). För markörer där endast en delmängd av cellerna uttrycker markören, till exempel CCL2, representeras skillnaden i procent markör positiva celler med levande CD11c + PBMC i stället. Data sammanfattar sex oberoende experiment med tre blod givare. Data för varje markör uttrycks som genomsnittlig ålder ± standard fel för medelvärdet (SEM). P-värden för varje jämförelse beräknas med hjälp av parade t test; NS = skillnader som inte är signifikanta. Tabellen har ändrats från11.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg"> Video 1: levande cell avbildning av trombocyt-och immun cells interaktioner inom TI-plattan. PBMC preparerades enligt beskrivningen i protokoll avsnitt 2 ovan och exponerades för transimmuniseringsplattan enligt beskrivningen i avsnitt 4, utom den statiska inkubations tiden i steg 4.2.3 minskades från 1 h till 30 min. Under TI-protokollet, var TI-plattan, som är identisk i storlek med en standard Mikroskop bild, monterad i glidhållningsstadiet av ett fluorescensbildningssystem och cellerna i den avbildades vid 40x förstoring och vid 37 ° c under plattan fyllning (4.2.2 ), inkubering (4.2.3) och plattflöde (4.3.5). Kontinuerliga bilder förvärvades och filmer som producerats med hjälp av "automatiserad scanning rutin" program vara. Under texterna under videon visar i vilket skede av protokollet som cellerna filmas på. Pilar och cirklar i videon, med tillhör ande bild texter, pekar ut cellerna och intresse områdena. Skalstapeln på 10 μM finns i det nedre högra hörnet i hela videon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Transimmunization (TI)-anordningen eller plattan och relaterade protokoll har utvecklats för att replikera de viktigaste inslagen i extrakorporeal fotokemoterapi (ECP), i en experimentell miljö, vilket möjliggör produktion av fysiologiskt aktiverade, avstämbara dendritiska celler (DCs) för cancer immun terapi.

Nytt protokoll för generering av fysiologisk immunogena dendritiska celler

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Physiologic dendritic antigen-presenterande celler, benämns PhDC, är immun master-switchar som initierar antigen-specifika T-cell immunitet och tolerans. Detta papper avgränsar en effektiv metod för produktion av PhDC. Klinisk användning av dendritiska celler hindras av de icke-fysiologiska cytokin metoder som används för att producera dem.Vår metod övervinner det problemet via effektiv trombocytsignalering av monocyte-till-DC-konvertering hos människor och möss. Dessa PhDC är inte beroende av cytokin villkor inte tillgänglig in vivo, så de kan generera potenta kliniska anti-tumör T cell svar i både människor och möss med etablerade cancerformer. Artoberoende trombocyt initiering av monocyt-till-PhDC mognad har bred experimentell tillämplighet.PhDC tillstånd dissekering av dendritic cell fysiologi, underlätta induktion av terapeutiska anti-cancer immunitet mot immunogena cancerformer, och erbjuda löfte för personlig antimikrobiell vaccination. Detta experimentella system är nytt, och flera aspekter av det såsom beläggning av plastkammaren, tumör cell behandling med 8-MOP/UVA, flödesförhållanden, och frisättning av monocyter är bäst visuellt representerade. Demonstrerar proceduren blir Eve Robinson, en tekniker från mitt laboratorium.För att samla perifert blod mononukleära celler, först inrätta en 15-milliliter rör med fyra milliliter av lymfocyt isolering medium per fem till 10 möss blödde. Sedan långsamt lager blod som samlats in från tumörbärande möss ovanpå mediet. Snurra cellerna på 1, 000-till 1, 500-times-G i 20 minuter för att separera PBMCs från röda blodkroppar.I slutet av centrifugeringen, samla upp plasmaskiktet, lämnar 0,5 milliliter kvar ovanför buffy pälsen, och lagra på fyra grader Celsius för senare användning. Samla sedan buffy coat-lagret i ett rent 15-milliliter rör fyllt med PBS till 15 milliliter och snurra på 250 gånger-G i en vanlig vävnadskulturcentrifug i 10 minuter för att samla in PBMC. I slutet av centrifugeringen, försiktigt pipettera av supernatanten och snärta röret för att återanvända pelleten.Tillsätt sedan två milliliter av ACK röda blodkroppar lys buffert till röret för att ta bort eventuella kvarvarande röda blodkroppar från PBMC. Inkubera PBMC på is i 10 minuter. Fyll röret med PBS till 15 milliliter, och snurra ner vid 250-gånger-G i en vanlig vävnadskultur centrifug i 10 minuter för att samla in PBMC.Försiktigt pipettera av supernatanten och snärta på röret för att lossa pelleten. Resuspend pelleten i 300 mikroliter av FBS. För att förbereda YUMM1.7 tumörceller per behandling grupp, först resuspend tumörcellen pelleten i FBS på 2,5 miljoner celler per 300 mikroliter.Med vävnadskultur huva lampor av, tillsätt 8-metoxipsoralen för en slutlig koncentration av 100 nanogram per milliliter till YUMM1.7 tumörcell suspension. Blanda därefter cellerna, linda cellbehållaren i folie och inkubera i 37 grader Celsius i 20 minuter. För att förbelägga en 12-brunns vävnadskulturplatta, tillsätt en milliliter FBS till en brunn för varje behandlingsgrupp på fem möss och kyl plattan vid fyra grader Celsius i 20 minuter.Efter 20 minuter, under en vävnadskultur huva, ta bort FBS från brunnarna, och tillsätt 300 mikroliter av metoxipsoralen-exponerade tumörceller per brunn. Utsätt sedan cellinnehållande plattan för den förvörda ultraviolett En ljuskälla för total bestrålning av fyra joule per kvadratcentimeter. För att samla 8-metoxipsoralen/UVA-behandlade tumörceller från varje brunn, virvla plattan och pipetten noggrant för att säkerställa fullständig cellåterhämtning.För att utföra transimmuniseringsplatta passage för varje behandling grupp av fem möss, kombinera 300 mikroliter av lämpliga PBMC och 300 mikroliter av 8-metoxipsoralen/UVA-behandlade tumörceller i en 1,5-milliliter koniska rör och blanda cellerna. Därefter öppnar du INGÅNG OCH UTGÅNGSRÖRklämmor av TI-plattan. Använd en 10-milliliter spruta för att fylla TI-slangen med FBS, stänga klämmorna som slangen är fylld för att behålla FBS inuti slangen.Koppla bort sprutan. Placera en P1000-pipettspets säkert i TI-plattans intag. Håll plattan i en 45-graders vinkel och fyll plattan långsamt med PBMC och tumörcell mix, undvika bubblor.Ta ut pipettspetsen från intaget innan pipettens kolv. Återför de återstående cellerna till 1,5-milliliter koniska röret. Inkubera det FBS-fyllda slangen, den cellfyllda TI-plattan och det koniska röret på 1,5 milliliter som innehåller de återstående cellerna i inkubatorn för vävnadskulturen vid 37 grader Celsius i en timme.Efter inkubationen släpper du klämmorna och tömr TI-slangen genom tyngdkraften. Sätt sedan in en P1000-pipettspets med kolven nedtryckt i plattansporten för att ta bort cellerna från TI-plattan. Håll plattan i 45-graders vinkel och fyll P1000-pipettspetsen.Placera celler tillbaka till sin ursprungliga 1,5-milliliter koniska röret. För att köra TI-plattan, anslut utgångsröret till plattan, och säkra TI-plattan i plattan-kör systemet. Nästa, med hjälp av en en-milliliter spruta, dra upp dessa 600 mikroliter av PBMC och tumörcell mix från 1,5-milliliter koniska röret.Fäst sprutan på ingångsröret med klämman öppen, och fyll långsamt tills vätskan når änden av slangen. Fäst den fria änden av ingångsröret på TI-plattan och fortsätt försiktigt lasta den återstående volymen. Stäng ingångsklämman när den är klar.Lossa en millilitersprutan och anslut ingångsslangen till sprutpumpen. Säkra utgångsslangen till ett rent 1,5 milliliter koniskt rör för celluppsamling. Justera sprutans pumpflödeshastighet till 0,09 milliliter per minut.Luta TI-plattan cirka 30 grader mot sprutpumpsidan med hjälp av en TI-platta som kör plattform. Släpp försiktigt klämman på entréslangen. Starta sprutpumpen, observera noga hur TI-plattan fylls.När TI-plattan är helt fylld, luta den ungefär 30 grader i motsatt riktning när den töms. När alla celler i vätskan är i 1,5-milliliter koniska uppsamlingsröret, stoppa pumpen. För att tvätta TI-plattan, koppla bort ingångsslangen från sprutpumpen, och anslut den till en en-milliliter spruta fylld med 600 mikroliter FBS.Fyll tills FBS är fullastad. Koppla sedan bort sprutan och fäst slangen på sprutpumpen. Justera sprutans pumpflödeshastighet till 0,49 milliliter per minut.Släpp ingångsklämman, och kör TI-plattan, samla tvätten i samma 1,5-milliliter koniska röret. Snärta eller knacka på TI-plattan försiktigt hela tiden för att hjälpa till att lossa och elutera eventuella vidhäftande celler när plattan töms. Koppla bort uppsamlingen 1,5-milliliter koniskt rör från TI-plattans inställning.Snurra uppsamlingsröret i bänkskivans mikrofuge vid 250 gånger-G i åtta minuter och kassera supernatanten. För att utföra övernattning co-inkubation av PBMC med antigen, först resuspend pbmc och tumör cell pellet i två milliliter av tydliga RPMI kompletteras med 15%autolog mus serum. Sedan plåtceller i en 35-millimeters icke-vävnads-kulturbehandlad steril maträtt, och inkubera över natten under vanliga vävnadskulturförhållanden.På följande dag, försiktigt lossa eventuella anhängare celler från botten av skålen med en vävnad kulturskrapa. Rotera skålen medan skrapa för att säkerställa jämn cell insamling. Samla in cellerna i ett 15-milliliter rör.Tillsätt två milliliter PBS till skålen, och upprepa skrapning steg, samla cellerna i samma rör. Skölj 35-millimetersfatet med en milliliter PBS, och tillsätt sköljningen till samma rör. Snurra på 250-gånger-G i en vanlig vävnadskulturcentrifug i 10 minuter för att samla in cellerna.Försiktigt pipettera bort supernatanten och snärta sedan röret för att återanvända pelleten. Terapin visade minskning av YUMM1.7 tumör tillväxt i mer än 100 behandlade kontra kontroll möss, som observerats i den kumulativa tumörtillväxt data nio oberoende experiment som utförts under två år. Den representativa tumörtillväxtkurvor för enskilda djur inom ett experiment ger en känsla av variabilitet i systemet.När antingen monocyter eller trombocyter är uttömda från PBMC-fraktionen, eller när plåtpassage utelämnas, observeras inte längre den terapeutiska effekten. Behandlingen är ineffektiv i avsaknad av antingen immuncellerna eller en antigenkälla, eller i närvaro av ett felmatchat antigen, såsom YUMM1.7 tumörer som behandlas med hjälp av MC38 kolon carcinom celler. För ett immuniserande resultat är det också viktigt att undvika PBMC exponering för 8-metoxypsoralen.FACS analys av förändring av de angivna markörerna från motsvarande IgG-kontroller i humana CD11c+celler bland antingen nyligen isolerade PBMC, TI-behandlade PBMC, TI-behandlade PBMC utan plättpassage, utarmat trombocyter före plattan passage, eller båda av ovanstående, visade att DC-aktivering beror på förekomsten av trombocyter i PBMC, och på TI-plattan passage. TI-aktiverade mänskliga DCs kan effektivt bearbeta och korspresentera antingen peptid antigener, eller antigener från hela 8-metoxypsoralen-exponerade mänskliga tumörceller för att aktivera humant antigen-specifika T cellinjer i in vitro-analyser i en TI-och trombocyt-beroende sätt. Specificitet av T-cell svar är beroende av källan för de bearbetade antigener.Vid inducering av anti-cancer immunitet, apoptos av varje cancer cellinje måste titrerad att maximera immunogenicitet. Eftersom inducerad immunitet kommer att vara specifika för immuniserande antigener, kommer detaljerad dissekering av varje system vara möjligt. Varje experimentell eller klinisk cancer, och varje antimikrobiellt svar, kommer att vara unikt informativ.Varje enskild mänsklig cancer har sitt eget utbud av tumör-specifika antigener. PhDC utföra nödvändiga sortering och presentation av tumör antigener, utan att kräva deras tidigare laboratorium identifiering. Tänk på att 8-MOP och UVA-ljus är cancerframkallande.Använd lämplig skyddsutrustning och följ säkerhetsrutiner vid hantering av 8-MOP och vid arbete med UVA-ljuskällor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Framställning av tumörantigen-laddade mogna dendritceller för Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generering av ett nytt dendritiskt cellvaccin med melanom och skivepitelcancerstamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Fånga Bakterier från Transinfection från dendritiska celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generation av omogna, mogna och tolerogena dendritiska celler med olika Metabolic fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...