Name: isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-05-07T13:30:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

हम कृतज्ञता FACS में सहायता स्वीकार करते हैं-Bärbel रेनेंगर और Wolfgang Bauer द्वारा छंटाई । यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF: V ५२५-B28) से बी एम एल के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और यूरोपीय जैव रासायनिक समाजों के फेडरेशन (FEBS, अनुवर्ती अनुसंधान कोष) । एस एफ ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी (OeAW) के एक डॉक्टर फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । हम वियना के चिकित्सा विश्वविद्यालय में प्रमुख सुविधाओं से उत्कृष्ट समर्थन स्वीकार करते हैं । हम मानव त्वचा सामग्री प्रदान करने के लिए बर्नहार्ड Gesslbauer, Christine Radtke और मार्टिन Vierhapper धंयवाद ।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस लेख में, हम मानव त्वचा से अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन । CD90 व्यापक रूप से किया गया है पहचान या चर्मपत्र फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव18,20,21। तथापि, हमने यह प्रदशत किया है कि CD90 + फाइब्रोब्लास्ट के अलावा, मानव डर्मिस भी एक CD90- फाइब्रोब्लास्ट जनसंख्या के अग्रदूत हैं, जिसमें16FAP, जो सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के लिए मार्कर के रूप में स्थापित किया गया है ( Cafs)22,23,24,25। महत्वपूर्ण बात, हम तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations FAP+CD90 की पहचानकरने में सक्षम थे, fap+CD90 + और fap-CD90+ सभी स्वस्थ मानव दाताओं से त्वचा बायोप्सी में । इसलिए हम निष्कर्ष है कि FAP केवल सक्रिय fibroblasts या CAFs लेकिन यह भी सामांय ऊतक फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक मार्कर नहीं है ।
ध्यान दें, FAP-CD90- कोशिका आबादी के ऊपर-वर्णित बहिष्करण-और gating रणनीति के आवेदन के बाद शेष fibroblasts शामिल नहीं है, क्योंकि इन कोशिकाओं fibroblasts खेती मध्यम में विट्रो में पैदा करना नहीं है, लेकिन सबसे संभावित एक मिश्रित कोशिका आबादी सहित लसीका कोशिकाओं और pericytes16दूसरों के बीच ।
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग द्वारा प्राप्त सेल उपज शरीर-भाग के आधार पर अलग कर सकते है कि त्वचा टुकड़ा अलगाव के लिए इस्तेमाल से निकलती है । शरीर के विभिन्न अंगों से डर्मिस अपनी संरचना, मोटाई के साथ ही कोलेजन संरचना के बारे में अलग है । उदाहरण के लिए, चेहरे या ऊपरी बांह से त्वचा बहुत पतली है पेट या जांघ, जो भी अक्सर एक मोटा चमड़े के नीचे वसा परत प्रदर्शित से त्वचा की तुलना में । इसके अतिरिक्त, उंर और त्वचा दाताओं के सेक्स और न केवल ऊतक वियोजन दक्षता प्रभाव हो सकता है, लेकिन यह भी तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations के वितरण को प्रभावित कर सकता है (चित्रा 3) जब पूर्ण मोटाई त्वचा से अलग । इस तथ्य यह है कि पैशिलरी dermis सिकुड़ती है और कि कुल फाइकोब्लास्ट संख्या11,26,27,28उम्र के साथ कम से परिणाम । इसके अलावा, पैपिलरी डर्मिस से गुटिका गोली संभवत: मिटिकुलर डर्मिस से भी बड़ी होगी, क्योंकि ऊपरी डर्मिस, रीटिकुलर डर्मिस की तुलना में फाइब्रोब्लास्ट से अधिक घनी आबादी वाला है । इसके अलावा, कम dermis भी मुश्किल और अधिक घनी कोलेजन के साथ पैक किया जाता है, यह कठिन ऊतक अलग करना और फाइब्रोब्लास्ट जारी करने के लिए बना । नोट की, सेल गोली बहुत लाल दिखाई दे सकता है, यही वजह है कि लाल रक्त कोशिका lysis की सिफारिश की है ।
बरकरार मानव त्वचा में तीन subpopulations की पहचान के अलावा, हम यह भी बताते है कि त्वचा की सूजन में, प्रत्येक फाइकोब्लास्ट उपसमुच्चय या तो अंकुरक या जालीदार dermis16में समृद्ध है । त्वचीय परतों से प्रत्येक उपजनसंख्या का एक उचित संवर्धन प्राप्त करने के लिए डर्मा के साथ त्वचा की सटीक टुकड़ा करने की क्रिया महत्वपूर्ण है । के बाद से पिल्लों से भरा हुआ dermis बहुत पतली है, त्वचीय स्लाइस का प्रतिनिधित्व यह ३०० μm की मोटाई से अधिक नहीं होना चाहिए. ऊपरी जालीदार और कम जालीदार फाइब्रोब्लास्ट दोनों जालीदार वंश का प्रतिनिधित्व करते है और इसी तरह के कार्यों और जीन हस्ताक्षर प्रदर्शन, इसलिए कोई भी उन्हें अलग नहीं करने पर विचार कर सकता है ।
महत्वपूर्ण बात, सभी तीन फाइब्रोब्लास्ट आबादी dermis भर में पाए जाते है और विशेष रूप से एक परत में मौजूद नहीं हैं, यही वजह है कि पाशकीय या मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों में जालीदार dermis परिणाम से explant संस्कृतियों । हालांकि, fap+CD90- अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट पैपिलरी dermis में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं और सतही से कम त्वचीय परतों के लिए एक ढाल का पालन करें, जबकि fap+CD90+ और fap-CD90+ फाइब्रोब्लास्ट एक का पालन करें लोअर से सतही परतों16के लिए व्युत्क्रम ढाल । इसके अलावा, CD90 के बहुमत अंकुरक से भरा हुआ dermis के फाइब्रोब्लास्ट लगभग विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं के आसपास पाए जाते हैं और29CD146 परिसंवहनी फाइब्रोब्लास्ट मार्कर व्यक्त करते हैं, और इस तरह शायद से अलग कार्यों प्रदर्शन शेष CD146- जालीदार फाइब्रोब्लास्ट16. CD146 gating रणनीति में एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस आबादी को बाहर ।
त्वचीय परतों की वियोजन के बाद, अलग कोशिकाओं को विशेष रूप से डिजाइन एंटीबॉडी एक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहिष्करण के लिए विभिन्न एंटीबॉडी युक्त कॉकटेल के साथ दाग रहे हैं, endothelial और लसीका कोशिकाओं, एपिडर्मल कोशिकाओं, एरिथ्रोसाइट्स और mscs करने के लिए शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी प्राप्त करें । नोट की, पहचान और mscs के बहिष्कार के लिए एक मार्कर का चयन क्योंकि प्रकाशित MSC मार्कर की उच्च संख्या30,31मुश्किल हो सकता है । चूंकि एमएससीएस एक्सप्रेस CD90 फाइब्रोब्लास्ट की तरह, अतिरिक्त एमएससी मार्कर जैसे CD105 या CD271 उनकी पहचान के लिए उपयोगी साबित हो सकता है । हालांकि, MSCs केवल सभी त्वचीय कोशिकाओं का एक बहुत कम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते है और के बाद से CD90+ fibroblasts प्रदर्शन छँटाई पर fibroblasts की ठेठ रूपात्मक सुविधाओं, एक तर्क दे सकता है कि अलग सेल सतह मार्कर के उपयोग द्वारा mscs के बहिष्कार हो सकता है अनावश्यक हो ।
महत्वपूर्ण बात, हम 7-14 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को रखने के बाद छंटाई (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बाद FAP और CD90 जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और पाया कि दोनों मार्करों की अभिव्यक्ति संबंधित हल एकल सकारात्मक में upregulated है (FAP+CD90- या FAP-CD90+) कोशिकाओं16। इसलिए हम जोर देते है कि इसके बाद के संस्करण का वर्णन मार्कर सेट और प्रोटोकॉल सीधे ऊतक से प्राथमिक फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव की अनुमति नहीं है, लेकिन पहले से संस्कारित मिश्रित फाइकोब्लास्ट आबादी से ।
फिर भी, हम प्रदर्शित करते है कि सभी तीन subpopulations की कार्यशीलता कोशिका संस्कृति में कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति के परिवर्तन की परवाह किए बिना बनाए रखा है, क्योंकि के रूप में fibroblasts के हल FAP+CD90- अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट नहीं संस्कृति की एक लंबी अवधि के बाद adipogenesis से गुजरना करने की क्षमता हासिल है, जबकि fibroblasts के रूप में छांटे गए fap+CD90+ या fap-CD90+ जालीदार फाइब्रोब्लास्ट अपने adipocytes में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने 16 . महत्वपूर्ण बात, हमने यह भी पाया है कि पैपिलरी और लिटिकुलर-विशिष्ट जीन अभी भी FAP में अधिक हद तक व्यक्त कर रहे हैं+CD90- और CD90+ क्रमशः.
अंत में, हम facs के माध्यम कार्यात्मक रूप से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है कि पहली बार मानव त्वचा dermis से अलगाव और शुद्ध और भोली फाइकोब्लास्ट सबसेट के विश्लेषण परमिट के लिए । इस विधि के लिए एक बड़ी उंनति स्थापित करता है आमतौर पर इस्तेमाल किया फाइब्रोब्लास्ट explant ऊपरी और निचले dermis से संस्कृति अलगाव प्रोटोकॉल के रूप में (i) एक विरोधी के ढाल और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट त्वचा की सतह से hypodermis करने के लिए मौजूद है और (ii) fibroblasts में उनके जीन हस्ताक्षर विट्रो में बदल जाते हैं ।

संयोजी ऊतक के मुख्य सेलुलर घटक के रूप में, fibroblasts कोलेजन और लोचदार फाइबर के जमाव के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं कि अंततः extracellular मैट्रिक्स के रूप में1, और इस प्रकार, ऊतक homeostasis में उनकी भूमिका, उत्थान और बीमारी को लंबे समय से कम करके आंका गया है । हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट हाल ही में शोधकर्ताओं की सुर्खियों में आ गए हैं, न केवल क्योंकि वे प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लिए एक प्रमुख सेलुलर स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं2 लेकिन यह भी कारण के रोगजनन में उनके उच्च सुघट्यता और निहितार्थ अंग फाइब्रोसिस3,4,5 या कैंसर6,7जैसे रोगों की एक विस्तृत संख्या ।
मानव त्वचा एक बहु स्तरित उपकला से बना है, epidermis, और उसके अंतर्निहित संयोजी ऊतक, dermis, जो histologically ऊपरी अंकुरक में subdivided किया जा सकता है और कम जालीदार dermis और मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट से बना है और कोशिकीय मैट्रिक्स8 और हाइपोडर्मिस । ऊतक के भीतर अपने स्थान के अनुसार, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट मोटे तौर पर पाषाणमय और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट1में वर्गीकृत किया गया है ।
महत्वपूर्ण बात, हाल के आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इन चमड़े का फाइब्रीब्लास्ट subpopulations केवल histologically भेद नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी है कि उनके समारोह में काफी विविध है । माउस त्वचा में, papeni और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट भ्रूणजनन9के दौरान दो अलग प्रजातियों से उत्पन्न होता है । सबूत के कई लाइनों का सुझाव है कि दोनों प्रजातियों न केवल ऊतक homeostasis में विभिंन भूमिकाओं डालती है, बाल कूप morphogenesis, घाव की मरंमत और फाइब्रोसिस7,9,10, लेकिन वे भी विभिंन जवाब नियोप्लास्टिक एपिडर्मी स्टेम कोशिकाओं से संकेत11, कैंसर रोगजनन में हट भूमिकाओं का सुझाव । आसानी से, दोनों प्रजातियों वयस्क माउस त्वचा में पारस्परिक रूप से अनंय सेलुलर मार्करों का एक अलग सेट एक्सप्रेस, इस प्रकार शुद्ध त्वचीय फाइकोब्लास्ट आबादी और उनके विशिष्ट कार्यों की बाद में व्यापक विश्लेषण के अलगाव को सक्षम करने में विट्रो9 , ११।
तदनुसार, अलग आकारिकी और कार्यों, प्रसार दर हट, ऊतक remodeling क्षमता12,13, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षमता के विकास इन विट्रो में एपिडर्मल स्टेम सेल, मानव त्वचा dermis14,15के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि, मानव चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट पर प्रकाशित अध्ययन के अधिकांश मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट की त्वचीय त्वचा से explant संस्कृतियों से अलग आबादी का उपयोग कर आयोजित किया गया है, के बाद से विशिष्ट कोशिका की सतह मार्कर शुद्ध मानव पाशिकीय के अलगाव को सक्षम करने के सेट या जालीदार फाइबब्लास्ट सादृश्य में माउस dermis को subpopulations अभी तक स्थापित किया जाना था ।
हम हाल ही में प्रदर्शन किया है, कि मानव त्वचा अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों कि प्रतिदीप्ति के माध्यम से संबंधित subpopulations के अलगाव को सक्षम द्वारा विशेषता-सक्रिय सेल छंटाई (facs)16: FAP + CD90- fibroblasts मुख्य रूप से ऊपरी dermis में स्थित अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं, उच्च प्रसार दर, एक विशिष्ट जीन हस्ताक्षर लेकिन कोई adipogenic क्षमता पेश । Fap+CD90+ और fap-CD90+ फाइब्रोब्लास्ट कम चमड़े के डिब्बों की एक प्रकार की वंशावली से संबंधित हैं, जो कम प्रफलन लेकिन आसानी से गुजरना adipogenesis-जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक बानगी । इस विधि का बड़े पैमाने पर अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, न केवल शारीरिक स्थितियों के तहत उनके विशिष्ट कार्यों के संबंध में बल्कि त्वचा कैंसर सहित त्वचीय रोगों के रोगजनन के संदर्भ में भी इन अलग फाइटोब्लास्ट subpopulations ।
हालांकि, के बाद से fibroblasts दो में अपनी कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन इन विट्रो संस्कृति16,17,19, हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन मानव से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव तक ही सीमित है dermis और मिश्रित कोशिका संस्कृति आबादी में अंकुरक या जालीदार फाइब्रोब्लास्ट की पहचान की अनुमति नहीं है । महत्वपूर्ण बात है, हालांकि विट्रो में कोशिका की सतह मार्कर परिवर्तन की अभिव्यक्ति, हम दिखा दिया है कि फाइटोब्लास्ट सबसेट प्रोटोकॉल के अनुसार अलग अपने विशिष्ट कार्यशीलता बनाए रखने के नीचे वर्णित है जब16की खेती, इस प्रकार सक्षम शारीरिक या रोग स्थितियों के तहत सबसेट विशिष्ट गुणों के इन विट्रो अध्ययन ।
अंत में, हम FACS के माध्यम से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है कि पहली बार के लिए एक भोले राज्य में मानव त्वचा dermis से शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी के अलगाव परमिट ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax-C100 (1x) Basal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17001-074</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME0095</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100 Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12556015</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8216;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,096,341,011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OilRed O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline without Ca++ &#38; Mg++</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237205</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA MicroKit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman 2xUniversal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>! CAUTION Skin and eye irritant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD31-AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303109</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD45-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304029</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit human CD49f/ITGA6-PE</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA699PE</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD90/Thy-1-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328120</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD106-AF421</td>
			<td>BD</td>
			<td>744309</td>
			<td>Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD235ab-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306611</td>
			<td>Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human E-cadherin-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>147304</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human FAP-APC</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>FAB3715A</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422302</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mL micronic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,692,405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene canonical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Acculan 3Ti Dermatome</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGA670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Dermatome blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGB228R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96well</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tea strainer</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting

फाइब्रोब्लास्ट एक अत्यधिक विषम कोशिका आबादी है जो कई मानव रोगों के रोगजनन में फंसाती है । मानव त्वचा dermis में, फाइब्रोब्लास्ट पारंपरिक रूप से उनके ऊतकीय स्थानीयकरण के अनुसार सतही अंकुरक या कम जालीदार dermis के लिए जिंमेदार ठहराया गया है । माउस डर्मिस में पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट दो विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न होते हैं जो शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं और एक विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के संबंध में अपसारी कार्यों के साथ होते हैं जिसके द्वारा उन्हें प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
महत्वपूर्ण बात, सतही और निचले चमड़े के परतों से explant संस्कृतियों से सबूत सुझाव है कि कम से दो कार्यात्मक अलग चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट प्रजातियों मानव त्वचा dermis में के रूप में अच्छी तरह से मौजूद हैं । हालांकि, माउस त्वचा के लिए विपरीत, सेल सतह मार्कर विभिंन फाइकोब्लास्ट सबसेट के भेदभाव को सक्षम करने के लिए मानव त्वचा के लिए अभी तक स्थापित नहीं किया गया है । हम प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई (facs) दो सेल सतह मार्कर रेशकोरक सक्रियकरण प्रोटीन (FAP) और thymocyte antigen 1 (Thy1)/ इस विधि में इन विट्रो हेरफेर, जो जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था बिना शुद्ध फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव को सक्षम बनाता है, इस प्रकार ऊतक homeostasis या रोग के संबंध में मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट सबसेट के सटीक कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति पैथोलॉजी.

एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए प्रसंस्करण त्वचा ऊतक के लिए मुख्य कदम का एक सिंहावलोकन चित्र 1में दिखाया गया है, त्वचा की dermatoming प्रदर्शित (चित्रा 1a), विभिन्न त्वचीय परतों (चित्र 1b), चमड़े के नीचे वसा को हटाने परत (चित्रा 1 ग) और एपिडर्मिस और पैपिलरी dermis के जुदाई (चित्रा 1 डी), साथ ही साथ मैनुअल और एंजाइमी ऊतक वियोजन के विभिन्न चरणों (चित्रा 1c, F). चित्र 2में तीन त्वचीय परतों की एक योजना प्रदान की गई है ।
चित्रा 3 मानव त्वचा से अलग फाइटोब्लास्ट सबसेट के विश्लेषण के लिए एक प्रवाह कोशिका मिति धुंधला पैनल के gating रणनीति प्रदर्शित करता है । अतिरिक्त सेल सतह मार्कर है कि fibroblasts पर व्यक्त नहीं कर रहे हैं अनुमति देने के लिए त्वचा में मौजूद विभिन्न अन्य कोशिकाओं के बहिष्करण जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एपिडर्मल कोशिकाओं, मध्योतक स्टेम सेल (mscs), लाल रक्त कोशिकाओं या endothelial कोशिकाओं के अधिकतम शुद्धता प्राप्त करने के लिए इक्का-दुक्का आबादी में । यह एक समान FACS इन फाइकोब्लास्ट subpopulations की पहचान के लिए 2 चित्रा में इस्तेमाल पैनल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन यह हमारी सिफारिश है. एक अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करें या अपवर्जन मार्कर के संयोजन में परिवर्तन हो सकता है ।
ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल मानव त्वचा जो अलग intradermal स्थानीयकरण, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और भी कार्य के साथ वर्तमान में तीन फाइकोब्लास्ट आबादी की पहचान सक्षम बनाता है (चित्रा 4) । Fap+CD90- पित्ती dermis में समृद्ध कर रहे हैं, जबकि fap+CD90+ और fap-CD90+ में अधिक प्रचुर मात्रा में है जालीदार dermis (चित्रा 4a) । सभी तीन subpopulations कोशिका संस्कृति में छंटाई पर ठेठ फाइवब्लास्ट आकारिकी प्रदर्शन (चित्रा 4b) । दिलचस्प है, वे अपने adipocytes जो जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक बानगी है में अंतर करने की क्षमता के बारे में अलग है । वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)16 (चित्रा 4c) के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के साथ इन परिणामों के संयोजन, दिखा रहा है कि FAP+CD90- कोशिकाओं आमतौर पर मार्कर के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए जिंमेदार ठहराया इस तरह के CD26, ntn और pdpn के रूप में अंकुरक fibroblasts जबकि CD90+ कोशिकाओं को उच्च स्तर पर CD36, ACTA2 और pparγ के रूप में जाना जाता है कि जालीदार मार्कर एक्सप्रेस, हम निष्कर्ष है कि FAP+CD90- कोशिकाओं पाशकीय और CD90 के हैं+ कोशिकाऐं वंश से संबंधित होती हैं.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig1.jpg"> चित्रा 1: अखंड मानव त्वचा से चमड़े के एकल कोशिका निलंबन का अलगाव । (क) त्वचा को पैपिलरी और रीटिकुलर डर्मिस में एक विद्युत त्वचीय के साथ कटा हुआ है । (ख) आसन्न एपिडर्मिस के साथ पैपिलरी डर्मिस ३०० μm मोटा (शीर्ष) है जबकि ऊपरी रिटिकुलर डर्मिस ७०० μm मोटा (नीचे) है । (ग) अधस्त्वचीय वसा की परत, स्केलपेल के साथ निम्नतर मितकीय डर्मिस से खुबतर हो जाती है । (घ) 1 ज के लिए ३७ ° ब् पर वियोजन एंजाइम विलयन में पैपिलरी डर्मिस के ऊष्मायन के पश्चात बाह्यत्वचा को संदंश के साथ आसानी से निकाला जा सकता है । (ङ) विभिन्न चर्म परतों को कैंची से मिलाया जाता है और इसे एंजाइम पाचन मिश्रण में अंतरित किया जाता है जिसमें कोलेजिनेनेस I, II और IV तथा हायलुरोनिडेस शामिल है । (च) 1 ह के ३७ ° ब् पर वियोजन के बाद ऊतक पाचन रूक जाता है तथा अपचित त्वचा के टुकड़ों को हटाने के लिए एक चाय छन्नी के माध्यम से निलंबन को रोक दिया जाता है । (ज) कोशिका निलंबन को ७० μm कोशिका छलनी के माध्यम से एक बार फिर छान कर 10 मिनट के लिए ५०० × छ पर अपकेंद्रित किया जाता है । (H) अपकेंद्रण के बाद, सेल गोली 1x PBS के साथ 10% FCS के साथ धोया जाता है और facs धुंधला के लिए तैयार है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig2.jpg"> चित्रा 2: एक dermatome के साथ पैपिलरी और एक प्रकार की हड्डी परतों में मानव त्वचा dermis के Sectioning. एक ऐसी योजना जिसमें पूर्ण मोटाई की त्वचा को टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा प्राप्त तीन त्वचीय परतें (एपिडर्मिस सहित) (बाह्यत्वचा; 0 \ u2012300 μm; त्वचीय परत 1), ऊपरी (300 \ u20121, 000 μm; त्वचीय लेयर 2) और निचली मिटिकुलर डर्मिस (> 1000 माइक्रोमीटर डर्मी । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig3.jpg"> चित्रा 3: FACS gating मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट subpopulations के लिए रणनीति । (A\u2012e) सबसे पहले, कोशिकाओं को एक (ख) और व्यवहार्य (dapi-) कोशिकाओं (सी) पर gated हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+), मध्योतक स्टेम सेल (CD106+), लाल रक्त कोशिकाओं (CD235ab+) को बाहर रखा जाता है (ग) और प्रशांत नीला नकारात्मक कोशिकाओं ई cadherin पर आगे gated है (ecad) और ITGA6 डबल नकारात्मक कोशिकाओं (पीई चैनल, डी ). E-cadherin और ITGA6 एपिडर्मल कोशिकाओं पर व्यक्त मार्कर हैं । अगले, CD31-FITC सकारात्मक कोशिकाओं (endothelial और लसीका कोशिकाओं) को छोड़ दिया (घ) तीन फाइकोब्लास्ट या तो एक या दोनों कोशिका की सतह फाइकोब्लास्ट मार्करों FAP और CD90 के दोनों व्यक्त की आबादी में जिसके परिणामस्वरूप: fap+CD90-, Fap+CD90+ और fap-CD90+ (ई) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig3large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig4.jpg"> चित्र 4: FAP+CD90-, fap+CD90+ और fap-CD90+ fibroblasts त्वचीय स्थानीयकरण में अलग, जीन अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता । (क) पैपिलरी, अपर रिटिकुलर और लोअर मिटिकुलर डर्मिस से अलग टेड फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि फैक्स प्लॉट । चित्र-3में गेटिंग की रणनीति बताई गई है । FAP+CD90- फाइब्रोब्लास्ट पैपिलरी dermis में समृद्ध कर रहे हैं (१९.२%) कम रिटिकुलर डर्मिस (०.८३%) की तुलना में । FAP+CD90+ कोशिकाओं dermis भर में पाया जा सकता है लेकिन उनके उच्चतम बहुतायत ऊपरी जालीदार dermis (४०.७%) । FAP-CD90+ कम लालिक्यूलर dermis में समृद्ध कर रहे है (६४.४%) । (ख) नोट की, सभी तीन सॉर्ट की गई subpopulations 7 दिनों (बाएं) के लिए संस्कृति पर ठेठ फाइकोब्लास्ट आकारिकी प्रदर्शित करते हैं । दिलचस्प है, वे एक adipogenesis परख में अलग व्यवहार करते हैं । संस्कृति में 14 दिनों के बाद, FAP+CD90- adipocytes में अंतर नहीं है जबकिFAP +CD90+ और fap-CD90+ आसानीसेगुजरना adipoउत्पत्ति (सही; तेल लाल ओ दाग लिपिड असर कोशिकाओं लाल) । स्केल पट्टियां = १,००० μm । (ग) सीधे छांटे गए FAP+CD90- fibroblasts एक्सप्रेस पिलरी फाइब्रोब्लास्ट मार्करों CD26, NTN1 और pdpn, जबकि FAP-CD90+ कक्षों एक्सप्रेस CD36, ACTA2 और pparγ, जाना जाता है जो रीतिमय वंश द्वारा व्यक्त किया गया । * p ≤ ०.०५; p ≤ ०.०००५ की तुलना में FAP+/cd90- कोशिकाओं; # p ≤ ०.०५; # # # p ≤ ०.०००५ की तुलना में FAP-/cd90+ कोशिकाओं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig4large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>

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Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

यह पांडुलिपि मानव त्वचा से पैपिलरी और रीटिकुलर फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक FACS-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । यह विट्रो संस्कृति में circumvents जो explant संस्कृतियों के माध्यम से आमतौर पर इस्तेमाल किया अलगाव प्रोटोकॉल के साथ अपरिहार्य था । निकलने वाले फाइकोब्लास्ट सबसेट कार्यात्मक रूप से अलग और dermis के भीतर प्रदर्शन विभेदक जीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण कर रहे हैं ।

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा मानव त्वचा से पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

यह प्रोटोकॉल कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एफएसी छंटाई द्वारा मानव त्वचा से कार्यात्मक रूप से अलग फाइब्रोब्लास्ट सबसेट के अलगाव की सुविधा प्रदान करता है। पहली बार, पिपिलरी और रेटिकुलर फाइब्रोब्लास्ट को इन विट्रो हेरफेर के बिना त्वचा से सीधे अलग किया जा सकता है। यह एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग करके पहले स्थापित अलगाव विधियों की तुलना में एक बड़ी उन्नति है।डर्मल फाइब्रोब्लास्ट सबसेट होमोस्टेटिक स्थितियों के तहत अलग-अलग कार्यों को बंदरगाह करता है। इस उपकरण के साथ, कैंसर या भड़काऊ त्वचा रोगों सहित त्वचा विकृतियों में कार्यात्मक अंतर की जांच करना संभव है। चूंकि मानव ऊतक की हैंडलिंग संतोषजनक सेल पैदावार प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है, हम इस प्रक्रिया को सुविधाजनक और तेज करने के लिए एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करना चाहते हैं ।पूर्ण मोटाई डर्मिस तैयार करने के लिए, मानव त्वचा का एक टुकड़ा एक मोटी फिल्टर पेपर पर रखें जिसमें एपिडर्मिस नीचे की ओर सामना कर रहा है। एपिडर्मिस को संदंश के साथ कसकर पकड़ें, और एक स्केलपेल के साथ चमड़े के नीचे वसा परत को कुरेदें। फिर, ऊतक को पेट्री डिश में डालने से पहले पांच मिलीमीटर चौड़ी स्ट्रिप्स में स्लाइस करें।डर्मिस को पेपिलरी और रेटिकुलर परतों में सेक्शन करने के लिए, त्वचा का एक टुकड़ा एक मोटी फिल्टर पेपर पर ऊपर की ओर सामना करने वाले एपिडर्मिस के साथ रखें। त्वचा को अपने किनारों पर संदंश के साथ कसकर पकड़ें, और एक इलेक्ट्रिक डर्मेटोम के साथ 300-माइक्रोमीटर मोटाई के एक वर्ग को काट लें। एपिडर्मिस और पैपिलरी डर्मिस से मिलकर पहली परत को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।फिर, एपिडर्मिस और डर्मिस को अलग करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें, या ऊतक को सूखने से रखने के लिए 1x पीबीएस जोड़ें। इसके बाद, डर्मेटोम को 700 माइक्रोमीटर की काटने की मोटाई में समायोजित करें, और शेष डर्मिस को काट लें। ऊपरी टुकड़ा रखें, जिसे एक अलग पेट्री डिश में ऊपरी रेटिकुलर डर्मिस के रूप में परिभाषित किया गया है।इसके बाद, अवशिष्ट निचले रेटिकुलर डर्मल परत से स्केलपेल के साथ चमड़े के नीचे की वसा परत को दूर करें, और इसे त्याग दें। एक और पेट्री डिश में कम रेटिकुलर डर्मिस ले लीजिए। एंजाइमेटिक पाचन प्रक्रिया के लिए तुरंत आगे बढ़ें, या ऊतक को सूखने से रखने के लिए 1x पीबीएस जोड़ें।एंजाइमीय पाचन करने के लिए, पांच मिलीमीटर त्वचा स्ट्रिप्स या एपिडर्मिस/पैपिलरी डर्मिस को पेट्री डिश में ऊपर की ओर सामना करने वाले एपिडर्मिस के साथ 10 मिलीलीटर एंजाइम समाधान के साथ रखें । इसके बाद पेट्री डिश को एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद एपिडर्मिस/पैपिलरी डर्मिस को पेट्री डिश के ढक्कन में ट्रांसफर करें ।दो संदंश के साथ ऊपरी डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करें, प्रत्येक डर्मिस के किनारे पकड़े हुए। इसके बाद, प्रत्येक डर्मल परत को यथासंभव अच्छी तरह से कीमा लें। टुकड़े छोटे, ऊतक पाचन बेहतर है।इसके बाद पाचन मिश्रण तैयार करें। तैयार पाचन मिश्रण के 10 मिलीमीटर के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक एक 50 मिलीमीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। आंदोलन के तहत एक घंटे के लिए ऊतक को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया।पाचन के दौरान कई बार ट्यूब को उलटें। सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयार करने के लिए, बर्फ पर पचाए गए ऊतकों में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइमैटिक ऊतक पाचन को रोकें। इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को नियमित बाँझ स्टेनलेस चाय छलनी के माध्यम से डालें, और एक साफ पेट्री डिश में सेल निलंबन एकत्र करें।छलनी को मध्यम से धोएं, और एक सिरिंज प्लंजर के किनारे के साथ अपाच्य ऊतक टुकड़ों को मैश करें। बाद में, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से एकत्र सेल निलंबन पिपेट। मध्यम के साथ सेल छलनी कुल्ला, और एक ही ट्यूब के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा।फिर, 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 500 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट निकालें, और फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ सेल पेलेट को धोएं। अपकेंद्रित्र कदम फिर से दोहराएं।इसके बाद, सुपरनैट को हटा दें, और एक रीक एरिथ्रोसाइट लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। परिवेश के तापमान पर लगभग एक मिनट के लिए लाइसिस बफर में कोशिकाओं को छोड़ दें। इसके बाद 10 फीसद एफसीएस के साथ 1x पीबीएस के नौ मिलीलीटर जोड़कर लाइसिस बंद करें।पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 500 बार जी पर फिर से ट्यूब अपकेंद्रित्र, और बाद में सुपरनैंट त्यागें। मानक प्रोटोकॉल के बाद एफएसी छंटाई के लिए कोशिकाओं को दाग लगाने के बाद, आरएनए अलगाव के लिए लाइसिस बफर के 350 माइक्रोलीटर या सेल संस्कृति के लिए फाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम के 350 माइक्रोलीटर से भरे अलग-अलग माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में तीन फाइब्रोब्लास्ट सबपॉलेशन सॉर्ट करें। ट्यूबों को तुरंत उलटें, और या तो लाइसिस बफर ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में डाल दें, या फाइब्रोब्लास्ट विकास मध्यम ट्यूबों को बर्फ पर डाल दें।FACS के बाद, कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए ५०० बार जी पर नीचे स्पिन । फिर, एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान में फाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम में कोशिकाओं की एक समान राशि थाली, और उंहें छोड़ने के लिए बढ़ने के लिए जब तक वे ७०% मांग तक पहुंचने । इसके बाद, सुसंस्कृत कोशिका माध्यम को आदिपोसाइट विभेदन माध्यम से प्रतिस्थापित करें, और कोशिकाओं को 14 दिनों के लिए अंतर करने दें।विभेदन दिन 14 में, 20 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। कुओं को 60% आइसोप्रोपैनॉल से धोएं, और इसे पूरी तरह से वाष्पित होने दें। फिर, 20 मिनट के लिए फ़िल्टर तेल लाल ओ के पांच मिलीमोलर के साथ कोशिकाओं को दाग दें।20 मिनट बाद दाग दार कोशिकाओं को डिस्टिल्ड पानी से चार बार धोएं। छवि संचारित प्रकाश के साथ 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ पानी में डूबे कोशिकाओं । यह प्रोटोकॉल मानव त्वचा में तीन फाइब्रोब्लास्ट आबादी की पहचान करने में सक्षम बनाता है, जो विभिन्न इंट्राडरमल स्थानीयकरण, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और कार्यों के साथ प्रस्तुत करता है।एफएपी-पॉजिटिव सीडी 90-निगेटिव को पैपिलरी डर्मिस में समृद्ध किया जाता है, जबकि एफएपी-पॉजिटिव सीडी90-पॉजिटिव और एफएपी-निगेटिव सीडी90-पॉजिटिव रेटिकुलर डर्मिस में ज्यादा प्रचुर मात्रा में होते हैं । सभी तीन क्रमबद्ध उपआबादी सात दिनों के लिए संस्कृति पर ठेठ फाइब्रोब्लास्ट आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं । दिलचस्प बात यह है कि वे एक एडिपेनेसिस परख में अलग व्यवहार करते हैं ।संस्कृति में 14 दिनों के बाद, FAP-सकारात्मक CD90-नकारात्मक adipocytes में अंतर नहीं है, जबकि FAP सकारात्मक CD90-सकारात्मक और FAP-नकारात्मक CD90-सकारात्मक आसानी से adipogenesis से गुजरना । जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग से पता चलता है कि एफएपी-पॉजिटिव सीडी 90-निगेटिव कोशिकाएं आमतौर पर सीडी26, एनटीएन और पीडीपीएन जैसे पेपिलरी फाइब्रोब्लास्ट के लिए जिम्मेदार मार्कर के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, जबकि सीडी 90-पॉजिटिव कोशिकाएं ज्ञात रेटिकुलर मार्कर को व्यक्त करती हैं, जैसे सीडी 36, चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन और PPAR-गामा उच्च स्तर पर। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि एफएपी-पॉजिटिव सीडी90-निगेटिव कोशिकाएं पैपिलरी से संबंधित हैं और सीडी 90-पॉजिटिव कोशिकाएं रेटिकुलर वंश से संबंधित हैं।पाचन सबसे अच्छा काम करता है यदि डर्मल टुकड़े पाचन माध्यम की पर्याप्त मात्रा में अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ और इनक्यूबेटेड होते हैं। डर्मल फाइब्रोब्लास्ट सबसेट कार्यात्मक रूप से विविध हैं। रोग रोगजनन के संदर्भ में उनके कार्य की खोज नए नैदानिक और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मार्ग प्रशस्त होगा ।

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Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

मेंढक और सैलामैंडर के लिविंग Oocytes से विशाल Lampbrush गुणसूत्रों का अलगाव

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Proliferating और Quiescent मानव Fibroblasts में जीनोम चौड़ा प्रतिलिपि क्षय दरों का निर्धारण

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

मानव स्टेम और जनक आबादी के आणविक और Immunophenotypic विविधता की विशेषताएं करने के लिए एक मिश्रित एकल सेल दृष्टिकोण

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और मानव अग्नाशय Islets का विश्लेषण

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

एकल सेल जीनोमिक अनुप्रयोगों के लिए Adipose ऊतक नाभिक का अलगाव

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

वीवो CRISPR में/Cas9 स्क्रीनिंग एक साथ माउस त्वचा और मौखिक गुहा में जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

न्यूरोमस्कुलर विकारों के लिए चिकित्सा की जांच करने के लिए मायोब्लास्ट में मानव फाइब्रोब्लास्ट का प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...