Name: isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-05-07T13:30:00
Duration: 9 min 14 s
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わたしたちは Bärbel Reininger とヴォルフガング・バウアーによる FACS ・ソートの支援を感謝しています。この研究は、オーストリア科学基金 (FWF: V 525-B28) と欧州生化学会 (FEBS、フォローアップ研究基金) の連盟から b. m. l. への助成金によって支援されました。S. f. は、オーストリア科学アカデミー (OeAW) の DOC フェローシップを受賞しています。ウィーン医科大学の中核施設からの優れた支援に感謝しています。私たちは、人間の皮膚材料を提供するためのベルンハルト・ Gesslbauer、クリスティン・ Radtke とマーティン・ Vierhapper に感謝します。

ヒトの皮膚は、26 ~ 61 歳の白人の男性と女性 (日焼けした皮膚、腹部の矯正、乳房の減少) から得られた。書かれた患者の同意書は、ヘルシンキ宣言に従って組織のコレクションの前に取得しました, ウィーン医科大学機関レビュー委員会の承認を得て.
注:私たちは、完全な厚さの真皮から (セクション1を参照してください)、またはその異なる層にヒト皮膚真皮を区分した後、機能的に明瞭な線維芽細胞亜集団の単離のためのプロトコルを提供します (セクション1をスキップし、直接セクション2を参照).
1. 真皮厚の完全な厚さの調製
<ol><li>厚い濾紙上で表皮が下向きになるように 10 cm x 10 cm の人間の皮の部分 (例えば、腹部の訂正または乳房の減少から) を置きなさい。</li>
	<li>表皮を鉗子でしっかりと持ち、皮下脂肪層をメスで削り取る。その後、ペトリ皿に入れる前に、組織を5mm 幅の細片にスライスする。 注:これは、ディスパーゼ II の浸透を容易にします (以後、解離酵素と呼ばれ、セクション3を参照)、表皮が真皮全体から分離される必要がある場合に使用される。このスキップセクション2については、セクション3を直接参照してください。汚染を避けるために、外科的切除後に組織を無菌状態に保つか、エタノールまたはヨウ素溶液で徹底的に洗浄してください。場合によっては、皮膚表面のエタノール処理は、軽度の細胞死のみを引き起こす。ティッシュの文化の流動フードの生殖不能の条件の下で働きなさい。</li>
</ol>2. ヒト皮膚真皮を Dermatome で乳頭と網状層に区分する
<ol><li>厚い濾紙に 10 cm x 10 cm の皮の部分 (例えば、腹部の訂正または乳房の減少から) を置きなさい、表皮は上向きに向いている。鉗子でその縁にしっかりと肌を保持します。</li>
	<li>Dermatome の頭部を自分から遠ざけることにより、皮膚の表面に対する90°の角度でブレードを使用して、電気 dermatome で皮膚をスライスし、切断厚さ/深さを300μ m に調節します。</li>
	<li>表皮と真皮の乳頭からなる第一層 (300 μ m 厚の「真皮層1」、図 1および図 2) を取り、ペトリ皿に入れる。セクション3にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。 注:汚染を避けるために、外科的除去後に組織を無菌に保つか、エタノールまたはヨウ素溶液で徹底的に洗浄してください。ティッシュの文化の流動フードの生殖不能の条件の下で働きなさい。 注意:刃が非常に鋭いので dermatome を注意深く扱いなさい。</li>
	<li>ステップ2.2 に dermatome を調整し、切断厚さを700μ m にし、残りの真皮をスライスします。上部細層 (「真皮層2」、図 2) として定義されている上部スライスを別のペトリ皿に配置する。セクション4にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。</li>
	<li>皮下脂肪層を低網状真皮層の残留下 (> 1000 μ m) からメスで削り、それを捨てる。より低い真皮網 (「真皮層3」、図 2) を別のペトリ皿に集める。セクション4にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。 注:あるいは、メスで脂肪を掻き取るのではなく、はさみで脂肪層を取り除きます。これは、脂肪を掻き取る前に、氷の網状層を氷上に置くのに役立つことがある。</li>
</ol>3. 表皮と真皮の分離
<ol><li>
3 U/mL の解離酵素 (すなわち、ディスパーゼ II) 溶液を無菌 1x PBS に調製する。5 mm の皮膚縞を (セクション1から)、または表皮/乳頭状の真皮 (ステップ2.2 から) に置き、10 mL の 3 U/mL の解離酵素溶液で10cm のペトリ皿において表皮を上方に向けた。37° c のペトリ皿を1時間インキュベートします。
	<ol>
<li>プロトコルはここで一時停止されるかもしれません。代わりに4° c で冷蔵庫のプロテアーゼで表皮/乳頭真皮をインキュベートします。必要に応じて他の層 (真皮層1、2および 3) を保存し、4° c で 50 mL チューブ中の 1x PBS に浸した。 注意:プロテアーゼを注意深く働かせると、接触すると皮膚や目に刺激を及ぼします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インキュベート後、表皮/乳頭真皮をペトリ皿の乾燥した蓋に移し、表皮または真皮のどちらかの端を保持している2つの鉗子を持つ真皮 (真皮層 1) と皮を分離する。</li>
</ol>4. 真皮組織の酵素消化
<ol><li>各真皮層 (真皮層1、2および 3) を、できるだけ徹底的にはさみ/メスと別々にミンチする。小片が小さければ小さいほど、組織消化が良くなります。 注:真皮の靭性は、それが由来する身体部位 (例えば、腹部または上腕皮膚) に依存して変化し得る。</li>
	<li>1.25 mg/mL コラゲナーゼの I, 0.5 mg/ml コラゲナーゼ II, 0.5 mg/ml のコラゲナーゼ IV および 0.1 mg/ml のヒアルロニダーゼダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、L-グルタミン (材料の表参照)、10% ウシ胎児血清 (FCS) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)。 注意:これらは接触時に皮膚や目を刺激する可能性がありますようにコラゲナーゼで慎重に作業.</li>
	<li>準備された消化力の10ml をそれぞれのミンチ組織を 50 mL チューブに入れ、恒久的な攪拌の下で37° c の温水浴で1時間インキュベートします。消化中にチューブを数回反転します。 注:1つは、ミンチ皮膚片のサイズに応じて消化量を調整することを検討する必要があります.あまりにも多くの組織と 10 mL の消化ミックスをオーバーロードしないでください細胞の収量は最小限になります。全体積内の組織の3分の1未満が推奨されます (1:2 w/v)。</li>
</ol>5. 単一細胞懸濁液および赤血球溶解の調製
<ol><li>10 mL の線維芽細胞培地 (L-グルタミン、10% FCS および 1% P/S) を消化された組織に添加することによって酵素組織消化を停止する。ここから氷上で作業します。</li>
	<li>定期的な滅菌ステンレスティーストレーナーを介して各チューブの内容を注ぎ、きれいなペトリ皿で細胞懸濁液を収集します。注射器を使って、未消化のティッシュピースをシリンジ・プランジャーの端で洗ってください。</li>
	<li>その後、ピペットは、70μ m の細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を 50 mL チューブに集めた。培地でこした細胞をすすぎ、同じ管に流れを集める。</li>
	<li>4° c で10分間 500 x gにチューブを遠心分離し、5 mL の線維芽細胞で上清と洗浄細胞ペレットを除去および廃棄します。遠心分離ステップを繰り返します。</li>
	<li>上清を除去し、1 mL 自己作成 ACK 赤血球溶解バッファー (0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4) でペレットを再懸濁します。周囲温度 (20 \ u201222 ° c) で約1分間溶解バッファー内の細胞を残します。</li>
	<li>10% FCS と 1x PBS の 9 mL を追加することによって溶解を停止し、5分間4° c で 500 x gで再びチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 注意:赤血球溶解におけるインキュベーション時間は、溶解が不完全であると思われる場合に調整することができる (赤色ペレット)。しかし、細胞の線維芽細胞と免疫セルの溶菌を避けるために、あまりにも長い間赤血球溶解バッファー内にセルを放置しないでください。</li>
</ol>6. FACS のための線維芽細胞のブロッキングと染色
<ol><li>ヒト fc ブロッカーの100μ l 中の 10% FCS および再懸濁細胞を用いた 1x PBS の100μ l のヒト Fc レセプターブロッキング溶液5μ l を調製します。氷上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>ヒトの皮膚線維芽細胞を染色する FACS 染色パネルを設計する。混合抗ヒト FAP APC (1:20)、抗ヒト CD90 AF700 (1:30)、抗ヒト E-カドヘリン PE (1:20)、抗ヒト CD31 FITC (1:30)、抗ヒト CD45 パシフィックブルー (1:20)、抗ヒト ITGA6 PE (1:20)、抗ヒト CD235ab パシフィックブルー (1: 1000) および抗ヒト CD106 パシフィック青 (1:100) で 10% FCS の 1x PBS で。</li>
	<li>
Fc 受容体ブロッキング後、細胞を 500 x gで4° c で3分間スピンさせる。100μ l の抗体混合で上清および再懸濁細胞を除去して廃棄する。4° c の暗所で20分間細胞をインキュベートします。
	<ol>
<li>染色する前に、未染色および単染色の FACS コントロールのための高い細胞数でサンプルの20μ l を取り除いてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色された細胞と FACS コントロールを、500μ l 1x PBS を 10% FCS で2回洗浄し、4° c で3分間 500 x gで遠心分離します。その間、4′, 6-diamidino-2-フェニル (DAPI) を 10% FCS の 1x PBS に添加して、1μ g/mL の最終濃度を作ります。</li>
	<li>上澄み液を除去して、200μ l の再懸濁細胞を DAPI 溶液中で濾過し、70μ m 細胞ストレーナーを通して各細胞懸濁物を5ml の FACS チューブに通す。 注:FACS が遅れて実行される場合、DAPI を追加し、記録の直前にフィルターをかけます。</li>
</ol>7. ヒトの皮膚線維芽細胞サブセット分離と FACS のためのゲーティング戦略
<ol><li>フローサイトメトリーコントロールを記録し、正しい電圧設定を設定し、適切な補正を実行します。単一細胞および生きている (DAPI-)、太平洋青、PE および FITC 陰性細胞 (CD45、CD31-、CD235ab-、CD106-、ITGA6-および E-カドヘリン)のためのゲート: 3 つの線維芽線集団を得ること。CD90-、fap+CD90 + および fap-CD90+細胞。図 3を参照してください。</li>
	<li>3つの線維芽細胞亜集団を別々の 1.5 mL スクリューキャップにマイクロ遠心、RNA 単離のための350μ l 溶解バッファーで充填するか、350μ l 線維芽細胞増殖培地 (材料の表を参照) で満たしました。ソートの直後にチューブを反転させ、そのいずれかを液体窒素に溶解緩衝管を入れて、スナップを凍結するか、または中管を氷上に置く。 注意:0.1% b-メルカプトエタノールで溶解緩衝液をヒュームフードに調製し、吸入を避けます。</li>
</ol>8線維芽細胞と脂肪生成アッセイの培養
<ol><li>FACS に続いて、500 x gで4° c で3分間スピンした細胞を、線維芽細胞増殖培地 (5000 \ u201210, 000 細胞/ウェル) で 48-ウェル細胞培養皿において等量にする。彼らは 70% コンフルエントに達するまで成長する細胞を残します。</li>
	<li>5μ g/mL のインスリンを加え、5μ m トログリタゾン、0.5 mM 3-メチルイソブチルキサンチン-1-メチルキサンチン (IBMX) および1μ m dexametasone を線維芽細胞増殖培地に添加して脂肪細胞分化培地を調製した。</li>
	<li>培養細胞の培地を脂肪細胞に置換し、細胞を14日間分化させます。2日目以降の交換培地は、5μ g/mL インスリンおよび5μ m トログリタゾンを含有する脂肪生成培地を減少させた。3rdまたは4日目ごとに培地を補充する。</li>
	<li>分化日14で周囲温度 (20 \ u201222 ° c) で20分間 4% PFA で細胞を固定します。ウェルを 60% の isopropanol で洗浄し、完全に蒸発させます。5 mM オイルレッド O (使用前にフィルター) を用いて細胞を染色し、20分間、染色した細胞を蒸留水で4回洗浄する。顕微鏡検査の実行に進みます。 注意:PFA は有毒で有害です。丁寧に取り扱ってください。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。固定された細胞は、オイルレッド O 染色が行われるまで4° c で 1x PBS に保存することができます。蒸発を避けるために、貯蔵前にパラフィンフィルムとカバーディッシュ。</li>
	<li>透過光で10倍の倍率で倒立顕微鏡で水中に浸漬した画像セル。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity:+more+than+skin+deep.">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).</li><li>Lowry, W. 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Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+expression+of+surface+markers+on+fibroblasts+and+fibroblast-like+cells+isolated+from+different+human+tissues.">Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).</li></ol>

作者は何も開示することはありません。

本稿では、ヒトの皮膚から乳頭状線維芽細胞および網状繊維の単離を行う方法について述べる。CD90 は、真皮線維芽細胞18、20、21の同定または単離のために広く使用されてきた。しかし、我々は、CD90 + 線維芽細胞の他に、ヒト真皮はまた、活性化した線維芽細胞および癌関連線維芽細胞のマーカーとして確立された FAP16を発現する CD90 繊維芽細胞集団を有することを実証した (CAFs)22,23,24,25重要なことに、我々は、すべての健康なヒトドナーからの皮膚生検の3つの線維芽細胞亜集団 FAP+CD90-、fap+CD90+および fap-CD90+を同定することができた。したがって、FAP は、活性化された線維芽細胞または CAFs のマーカーであるだけでなく、正常組織線維芽細胞についても結論づける。
注目すべきことに、上記の排除およびゲーティング戦略の適用後に残る CD90 細胞集団は、線維芽細胞を含まないが、これらのセルはインビトロで繊維芽細胞栽培培地で増殖しないので、最もおそらくリンパ細胞を含む混合細胞集団であり、他のものの間で16周皮細胞。
上記のプロトコルの使用によって得られる細胞収量は、単離のために使用される皮膚片が由来する身体部分に依存して変化し得る。異なる身体部位からの真皮は、その構造、厚さ、ならびにコラーゲン組成に関して異なる。例えば、顔面または上腕からの皮膚は、腹または大腿からの皮膚よりもはるかに薄く、またしばしばより厚い皮下脂肪層を表示する。さらに、皮膚ドナーの年齢および性別は、さらに、組織の解離効率に影響を及ぼすだけでなく、3つの線維芽細胞亜集団 (図 3) の分布にも影響を及ぼし得るが、完全な厚さの皮膚から単離されたときである。これは、乳頭真皮が収縮し、総線維芽細胞数が11、26、27、28の年齢とともに減少するという事実から生じる。さらに、乳頭状真皮からの細胞ペレットは、真皮網状層よりもより大きくなることがあり、真皮は真皮層よりも繊維芽細胞によってより密に移入されるからであろう。さらに、下真皮はまた、より硬く、より密にコラーゲンが詰め込まれ、組織を解離させ、線維芽細胞を放出することを困難にしている。注意すべきことに、細胞ペレットは非常に赤く見えることがあり、これが赤血球溶解が推奨される理由である。
無傷のヒト皮膚における3つの亜集団の同定に加えて、我々はまた、dermatomed 皮膚において、それぞれの線維芽細胞サブセットが乳頭状または網状真皮16のいずれかで富化されることを示す。Dermatome を用いた皮膚の正確なスライスは、異なる真皮層からの各亜集団の正しい濃縮を得るために重要である。乳頭真皮が非常に薄いので、それを表す dermatomed スライスは、300μ m の厚さを超えてはならない。上部網状層および下部網状線維芽細胞はいずれも、網状系譜を表し、同様の機能および遺伝子シグネチャーを表示し、したがって、それらを分離しないことも検討できます。
重要なことに、すべての3つの線維芽細胞集団は、真皮全体に見られ、1つの層にのみ存在するわけではなく、乳頭または網状真皮からの explant 培養が混合線維芽細胞培養の結果である理由である。しかし、FAP+CD90-乳頭線維芽細胞は乳頭真皮に最も多く含まれており、表面から下真皮層までの勾配に従い、fap+CD90+および fap-CD90+繊維芽細胞は、下から表面層16までの逆勾配。さらに、乳頭状真皮の CD90+線維芽細胞の大部分は、ほぼ独占的に血管の周囲に見出され、血管周囲線維芽細胞マーカー CD14629を発現し、したがっておそらく異なる機能を示す残りの CD146-網状線維芽細胞は16.CD146 は、この母集団を除外するゲーティング戦略の追加マーカーとして使用できます。
真皮層の解離に続いて、分離した細胞を、免疫細胞、内皮およびリンパ細胞、表皮細胞、赤血球および MSCs への排除のための種々の抗体を含む特別に設計された抗体カクテルで染色される純粋な線維芽細胞集団を得る。なお、msc の識別と除外のマーカーを選択するのは、公開されている数が非常に多いので、難しい場合があります30,31.CD90 は線維芽細胞のように発現するため、CD105 や CD271 などの MSC マーカーはその同定に有用であることが判明した。しかし、MSCs は、すべての真皮細胞の非常に低い割合を表しているだけであり、CD90+線維芽細胞は選別において線芽細胞の典型的な形態学的特徴を示すので、個別の細胞表面マーカーを使用して MSCs を排除することができると主張する可能性がある。必要ありません。
重要なこととして、CD90 遺伝子発現は、細胞を選別後7-14 日間培養した後に分析し (データは示さず)、それぞれのソートされた単一陽性 (FAP+CD90-またはFAP-CD90+) 細胞16.したがって、上述のマーカーセットおよびプロトコールは、一次線維芽細胞サブセットを組織から直接分離することを許可するが、以前に培養した混合線維芽細胞集団からではないことを強調する。
それにもかかわらず、我々は、すべての3つの亜集団の機能性が細胞表面マーカー発現の変化にかかわらず細胞培養において保持されることを証明する、FAP+CD90-乳頭線維芽細胞として選別するため、培養のより長い期間の後に脂肪生成を受ける能力を獲得し、一方で FAP+CD90+または fap-CD90+細網線維芽細胞が脂肪細胞に分化する能力を維持している間16.重要なことに、我々はまた、乳頭および網状特異的遺伝子がそれぞれ、FAP+CD90-および CD90+においてさらに高い範囲で発現していることを発見した。
結論として、我々は、FACS を介して機能的に明瞭な線維芽細胞サブセットを単離するためのプロトコルを確立し、初めてヒトの皮膚真皮からの純粋でナイーブな線維芽細胞亜集団の単離および分析を可能にした。この方法は、(i) 乳頭および網状線維芽細胞の対立する勾配が皮膚表面から皮下組織および (ii) まで存在するので、上と下の真皮からの一般的に使用される線維芽細胞 explant 培養分離プロトコルに大きな進歩を確立する線維芽細胞は、インビトロで遺伝子シグネチャーを変化させる。

結合組織の主な細胞成分として、線維芽細胞は、主として細胞外マトリックス1を形成するコラーゲンおよび弾性繊維の沈着に対して責任があり、したがって、組織恒常性におけるそれらの役割、再生および病気は長い間過小評価されています。しかし、最近、線維芽細胞は、それらが誘導された多能性幹細胞のための著名な細胞源を表しているだけでなく、その高い可塑性および病因における含意のために、研究者の注目を浴びるようになった。臓器線維症3、4、5または癌6、7などの多くの疾患。
ヒトの皮膚は、多層上皮、表皮、およびその根底にある結合組織から構成され、真皮は、上乳頭および下網状層に組織学的に細分することができ、主として線維芽細胞から構成され、細胞外マトリックス8および皮下組織。組織内のそれらの位置によれば、真皮線維芽細胞は、ほぼ乳頭状および網状線維芽細胞1に分類されている。
重要なことに、最近のデータは、これらの皮膚線維芽細胞亜集団が組織学的に区別できるだけでなく、それらの機能がかなり多様であることを示す。マウス皮膚において、乳頭状および網状線維芽細胞は、胚形成9の間に2つの異なる系譜から生じる。いくつかの証拠は、2つの系統が組織ホメオスタシス、毛包の形態形成、創傷修復および線維症7、9、10においてだけでなく、異なる役割を発揮することを示唆しているが、それらはまた異なる腫瘍性表皮幹細胞11からのシグナルは、癌の病因における役割を発散することを示唆している。好都合なことに、両系統は成人マウス皮膚において相互に排他的である細胞マーカーの別個のセットを発現し、したがって純粋な真皮線維芽細胞集団の単離およびその後のインビトロでの特定の機能の広範囲の分析を可能にする,11.
それに対応して、異なる形態および機能を有する少なくとも2つの明確な線維芽細胞サブセットを、発散増殖率、組織リモデリング能力12、13、ならびに成長をサポートする能力を含むインビトロでの表皮幹細胞は、ヒト皮膚真皮14,15について記載されている。しかし、ヒトの皮膚線維芽細胞についての公開された研究の大部分は、dermatomed 皮膚から explant 培養物から分離した線維芽細胞集団を用いて、純粋なヒト乳頭の単離を可能にする特定の細胞表面マーカーセットを使用して行った。マウス真皮に類似した網状線維芽細胞亜集団は未だ確立されていなかった。
我々は最近、ヒトの皮膚乳頭および網状線維芽細胞が、蛍光活性化細胞選別 (FACS)16を介してそれぞれの亜集団の単離を可能にする特定の細胞表面マーカーによって特徴付けられることを示した。+CD90-線維芽細胞は、主に真皮上部に位置する乳頭状線維芽細胞を表し、より高い増殖速度、明瞭な遺伝子シグネチャーを示すが、及びの可能性はない。FAP+ CD90+および fap-CD90+線維芽細胞は、低い真皮区画の網状系統に属し、これは増殖が少ないが、細網線維芽細胞の特徴である脂肪生成を容易に受ける。この方法は、生理的条件下での特定の機能に関してだけでなく、皮膚癌を含む皮膚疾患の病因の文脈においても、これらの明瞭な線維芽細胞亜集団を広範囲に研究することを可能にする。
しかし、線維芽細胞は細胞表面マーカーの発現を in vitro 培養16、17、19における2次元で変化させるので、私たちのプロトコールの適用は、ヒトからの一次線維芽細胞の単離に限定される真皮は、混合細胞培養集団における乳頭状または網状線維芽細胞の同定を許容しない。重要なことに、細胞表面マーカーの発現はインビトロで変化するが、以下に記載されるプロトコルに従って単離された線維芽細胞サブセットが16を栽培したときにそれらの特定の機能を保持していることを示した。生理的または病理学的条件下でのサブセット特異的特性のインビトロ研究。
結論として、我々は、FACS を介して明確な線維芽細胞サブセットの単離のためのプロトコルを開発し、初めて純粋な線維芽細胞集団をナイーブ状態のヒト皮膚真皮から単離することを可能にする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax-C100 (1x) Basal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17001-074</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME0095</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100 Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12556015</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8216;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,096,341,011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OilRed O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline without Ca++ &#38; Mg++</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237205</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA MicroKit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman 2xUniversal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>! CAUTION Skin and eye irritant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD31-AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303109</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD45-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304029</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit human CD49f/ITGA6-PE</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA699PE</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD90/Thy-1-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328120</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD106-AF421</td>
			<td>BD</td>
			<td>744309</td>
			<td>Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD235ab-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306611</td>
			<td>Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human E-cadherin-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>147304</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human FAP-APC</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>FAB3715A</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422302</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mL micronic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,692,405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene canonical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Acculan 3Ti Dermatome</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGA670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Dermatome blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGB228R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96well</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tea strainer</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting

線維芽細胞は、多くのヒト疾患の病因に関与する非常に不均一な細胞集団である。ヒト皮膚真皮において、線維芽細胞は、従来、組織学的局在による表層乳頭状または下部網状真皮に起因すると考えられてきた。マウスの真皮では、乳頭状および網状層の線維芽細胞は、生理的および病理学的プロセスに関して発散する機能を持つ2つの異なる系統から、それらを区別することができる明瞭な細胞表面マーカー発現プロファイルを有する。
重要なことに、表面的で低い真皮層からの explant 培養からの証拠は、少なくとも2つの機能的に明瞭な真皮線維芽細胞の系譜が人間の皮膚真皮にも存在することを示唆している。しかし、マウスの皮膚とは異なり、異なる線維芽細胞サブセットの識別を可能にするセル表面マーカーは、ヒトの皮膚については未だ確立されていない。我々は、2つの細胞表面マーカーの線維芽細胞活性化タンパク質 (FAP) および胸腺細胞抗原 1 (Thy1) を使用する蛍光活性化細胞選別 (FACS) を介してヒト乳頭線維芽細胞集団の単離のための新しいプロトコルを開発した/CD90.この方法は、遺伝子発現に影響を与えることが示された in vitro 操作なしで純粋な線維芽細胞サブセットの単離を可能にし、組織の恒常性または疾患に関してヒトの皮膚線維芽細胞サブセットの正確な機能分析を許可する病理学。

単一細胞懸濁液を得るために皮膚組織を処理するための主要なステップの概要は、図 1に示されており、皮膚の dermatoming を表示する (図 1a)、異なる真皮層 (図 1b)、皮下脂肪の除去層 (図 1c) と、表皮および乳頭状真皮の分離 (図 1d)、並びに手動および酵素組織解離の異なるステップ (図 1e、F) を示す。3つの真皮層のスキームを図 2に示します。
図 3は、ヒト皮膚からの異なる線維芽細胞サブセットの分析のためのフローサイトメトリー染色パネルのゲーティング戦略を示している。線維芽細胞上に発現していない追加の細胞表面マーカーは、免疫細胞、表皮細胞、間葉系幹細胞 (MSCs)、赤血球または内皮細胞などの皮膚に存在する様々な他の細胞の排除を可能にし、最大の純度を達成する孤立した集団で。これらの線維芽細胞亜集団を同定するために図 2で使用されるのと同じ FACS パネルを使用することは重要ではありませんが、これは私たちの推薦です。異なる蛍光色素で標識された抗体を使用したり、除外マーカーの組み合わせを変更したりすることができます。
注として、このプロトコルは、異なる皮内局在、遺伝子発現プロファイルおよびまた機能を有するヒト皮膚における3つの線維芽細胞集団の同定を可能にする (図 4)。FAP+CD90-乳頭状の真皮に富むのに対し、fap+CD90+および fap-CD90+は真皮網状層においてより豊富である (図 4a)。3つの亜集団はすべて、細胞培養での選別の際に典型的な線維芽細胞形態を呈する (図 4b)。興味深いことに、それらは細網線維芽細胞の顕著な特徴である脂肪細胞への分化能力に関して異なる。これらの結果を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (RT − PCR)16 (図 4c) を介した遺伝子発現プロファイリングと組み合わせることにより、FAP+CD90 細胞が一般に起因する高いレベルのマーカーを発現することが示されCD26、NTN および PDPN のような乳頭状線維芽細胞は、CD90+セルは、CD36、ACTA2 および ppar γなどの公知の網様マーカーを高いレベルで発現しているが、FAP+CD90 細胞は乳頭および CD90+に属していると結論付けている。細胞は網状系統に属しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig1.jpg"> 図 1: ヒト皮膚の無傷からの真皮単細胞懸濁液の単離。(A) 皮膚を、乳頭状および真皮網状層に電気 dermatome でスライスする。(B) 隣接する表皮を有する乳頭状真皮は、300μ m 厚 (上) であり、上部網状層は700μ m 厚 (下) である。(C) メスで皮下脂肪層が下細網から削り取られる。(D) 1 時間37° c で解離酵素溶液中の乳頭状真皮をインキュベートした後、表皮を鉗子で容易に除去することができる。(E) 異なる真皮層をはさみで刻んで、コラゲナーゼの I、II および IV およびヒアルロニダーゼからなる酵素消化混合物に移した。(F) 37 ° c での1時間の解離の後、組織消化が停止され、懸濁液は、未消化の皮膚片を除去するために茶ストレーナーを介して注がれる。(G) 細胞懸濁液を70μ m 細胞ストレーナーを通してもう一度濾過し、4° c で 500 x Gで10 分間遠心分離した後、細胞ペレットを 10% FCS で 1X PBS で洗浄し、FACS 染色する準備が整いました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig2.jpg"> 図 2: ヒト皮膚真皮を、dermatome を用いて乳頭および網状層に区分する。完全な厚さの皮膚を乳頭状の真皮にスライスして得られた3つの真皮層 (表皮、0 \ u2012300 μ m; 真皮層 1)、上層網状層 (300 \ u20121、000μ m; 皮膚の表層 2) および下網状細網 (> 1000 μ m; 真皮層 3)dermatome.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig3.jpg"> 図 3: ヒト皮膚線維芽細胞亜集団の FACS ゲーティング戦略(A\u2012E)第1に、細胞は、単一 (B) および生菌 (DAPI-) 細胞 (C) 上でゲートされる。免疫細胞 (CD45+)、間葉系幹細胞 (CD106+)、赤血球 (CD235ab+) は除外され (C)、太平洋の青色陰性細胞はさらに E-カドヘリン (ECAD) および ITGA6 二重陰性細胞 (PE チャネル、 D).E-カドヘリンおよび ITGA6 は、表皮細胞に発現するマーカーである。次に、CD31-FITC 陽性細胞 (内皮およびリンパ細胞) は除外され (D)、2つの細胞表面線維芽細胞マーカーのいずれかまたは両方を発現している3つの繊維芽細胞集団が FAP および CD90: fap+CD90-、Fap+ CD90 + および fap-CD90+ (E)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig4.jpg"> 図 4: FAP+CD90-、fap+CD90+および fap-CD90+線維芽細胞は、皮膚局在、遺伝子発現および機能性において異なる。(A) 乳頭状線維芽細胞の代表的な FACS プロットで、上網状層および下網状の真皮から単離された。ゲーティング戦略については、図 3で説明します。FAP+CD90-線維芽細胞は乳頭真皮に富む (19.2%)真皮網状層 (0.83%) と比較した。FAP+CD90+細胞は真皮全体に見られますが、それらの最も高い存在量は上部網状層 (40.7%) にあります。CD90+は下部網状層 (64.4%) に濃縮されている。(B) 注意の、3つのソートされたすべての亜集団は、培養7日目に典型的な線維芽細胞形態を表示する (左)。興味深いことに、それらは脂肪生成アッセイにおいて異なる振る舞いをします。培養14日後、FAP+CD90-脂肪細胞に分化せず、fap+ CD90+および fap-CD90+は容易に脂肪生成を受ける (右;オイルレッド O 染色脂質を持つ細胞の赤)。スケールバー = 1000 μ m。 (C) 直接選別された FAP+CD90 線維芽細胞は、乳頭状の繊維芽細胞マーカー CD26、NTN1 および PDPN を発現するが、FAP-CD90+セルは CD36、ACTA2 および ppar γを発現することが知られており、網状系統によって表される。* p ≤ 0.05;p ≤0.0005 は、 FAP+/CD90 細胞と比較して;# p ≤ 0.05;# # # p ≤0.0005 は、/CD90+細胞と比較して、.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

この原稿は、ヒトの皮膚から乳頭線維芽細胞および網状繊維を単離するための FACS ベースのプロトコルを記載している。それは、explant 培養を介して一般的に使用される分離プロトコルで避けられなかったインビトロ培養を回避する。発散する線維芽細胞サブセットは機能的に区別され、真皮内での微分遺伝子発現および局在を表示する。

蛍光活性化細胞選別によるヒトの皮膚からの乳頭状および網状線維芽細胞の単離

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

このプロトコルは、細胞表面マーカー発現に基づくFAC選別によるヒト皮膚からの機能的に異なる線維芽細胞サブセットの分離を促進する。初めて、乳頭および網状線維芽細胞は、インビトロ操作なしで皮膚から直接単離することができる。これは、外植培養を用いた従来の分離法と比較して大きな進歩です。皮膚線維芽細胞サブセットは、恒常性条件下で明確な機能を収容する。このツールを使用すると、癌または炎症性皮膚疾患を含む皮膚病理の機能的な違いを調査することが可能である。ヒト組織の取り扱いには、満足のいく細胞収量を達成するためのいくつかの練習が必要なため、このプロセスを促進し、加速するための視覚的なデモンストレーションを提供したいと考えています。完全な厚さの真皮を準備するには、表皮が下向きの厚いろ紙の上に人間の皮膚を置きます。表皮を鉗子でしっかりと保持し、皮下脂肪層をメスで削り取ります。その後、ペトリ皿に入れる前に、組織を5ミリメートル幅のストリップにスライスします。真皮を乳頭層と網状層に切り離すために、表皮を上向きにした厚い濾過紙の上に皮膚を置きます。鉗子で皮膚をしっかりと縁に持ち、300マイクロメートルの厚さの部分を電気皮膚膜でスライスします。表皮と乳頭真皮からなる第1層をペトリ皿に移します。次いで、表皮と真皮を分離するために直ちに進むか、組織が乾燥するのを防ぐために1x PBSを加える。次に、皮膚膜を700マイクロメートルの切断厚さに調整し、残りの真皮をスライスします。上部の網状真皮として定義されている上のスライスを別のペトリ皿に入れます。続いて、残りの下側網状皮層からメスで皮下脂肪層を削り取り、廃棄する。別のペトリ皿に下部網状真皮を収集します。酵素消化手順に直ちに進むか、1x PBSを加え、組織が乾燥しないようにします。酵素消化を行うために、5ミリメートルの皮膚ストリップまたは表皮を上向きにした表皮/乳頭真皮を、解離酵素溶液の10ミリリットルのペトリ皿に置きます。その後、ペトリ皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、表皮/乳頭真皮をペトリ皿の蓋に移します。表皮を上真皮から2つの鉗子で分離し、それぞれ真皮の端を保持する。その後、各真皮層をできるだけ十分にミンチする。小さいほど、組織消化が良くなります。その後、消化ミックスを準備します。調製した消化ミックスの10ミリメートルで細かく組織を50ミリメートルのチューブに移します。37°Cで組織を攪拌下で1時間インキュベートする。消化中にチューブを数回反転させます。単細胞懸濁液を調製するために、氷上の消化された組織に10ミリリットルの線維芽細胞培地を加えることによって酵素組織消化を停止する。次に、各チューブの内容物を通常の滅菌ステンレスティーストレーナーを通して注ぎ、きれいなペトリ皿に細胞懸濁液を集める。ストレーナーをミディアムで洗い、注射器プランジャーの端で未消化の組織片をつぶします。その後、収集した細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにピペットを送る。培地で細胞ストレーナーをすすい、同じチューブを通して流れを集めます。その後、チューブを摂氏4度で500倍にして10分間遠心する。上清を取り除き、5ミリリットルの線維芽細胞培地で細胞ペレットを洗浄する。遠心分離のステップを再度繰り返します。その後、上清を取り除き、1ミリリットルのACK赤血球ライシス緩衝液中のペレットを再懸濁させた。周囲温度で約1分間、細胞をリシスバッファーに入れておきます。次に、10%FCSで9ミリリットルの1x PBSを加えて溶出を停止する。再び500倍のgで5分間摂氏4度でチューブを遠心し、その後上清を捨てます。標準的なプロトコルに従ってFAC選別のために細胞が染色された後、RNA単離のための350マイクロリットルのライシスバッファーまたは細胞培養用の線維芽細胞増殖培地の350マイクロリットルで満たされた別々のマイクロ遠心分離管に3つの線維芽細胞亜集団を選別する。チューブを直ちに反転させ、リシス緩衝管を液体窒素に入れるか、または線維芽細胞成長培地チューブを氷の上に置きます。FACSに続いて、セルを摂氏4度で3分間500倍gで回転させます。次に、24ウェル細胞培養皿に同量の線維芽細胞増殖培地に同量の細胞をプレートし、70%の合流まで増殖させる。次に、培養細胞培地をアディポサイト分化培地に置き換え、細胞を14日間分化させた。分化14日目に、細胞を4%PFAで20分間固定する。60%イソプロパノールで井戸を洗い、完全に蒸発させます。その後、ろ過したオイルレッドOの5ミリモルで細胞を20分間染色します。20分後、染色した細胞を蒸留水で4回洗います。透過光で10倍の倍率で反転顕微鏡で水中に浸した細胞を画像化します。このプロトコルは、異なる皮内局在化、遺伝子発現プロファイル、および機能を有するヒト皮膚における3つの線維芽細胞集団の同定を可能にする。FAP陽性CD90陰性は乳頭真皮に富み、FAP陽性CD90陽性およびFAP陰性CD90陽性は、網状真皮に豊富である。3つの分類された亜集団はすべて、7日間培養時に典型的な線維芽細胞形態を示す。興味深いことに、彼らは脂質生成アッセイで異なる振る舞いがします。培養で14日後、FAP陽性CD90陰性は、脂質細胞に分化せず、FAP陽性CD90陽性およびFAP陰性CD90陽性は容易に脂質生成を受ける。遺伝子発現プロファイリングは、FAP陽性CD90陰性細胞がCD26、NTN、PDPNなどの乳頭線維芽細胞に一般的に起因する高レベルのマーカーを発現し、CD90陽性細胞はCD36、平滑筋アクチン、PPAR-γなどの既知の網状マーカーを高レベルで発現することを示している。我々は、FAP陽性CD90陰性細胞が乳頭に属し、CD90陽性細胞が網状系統に属すると結論付ける。消化酵素は、真皮部分を十分にミンチし、十分な量の消化培地でインキュベートする場合に最適です。皮膚線維芽細胞サブセットは機能的に多様である。病気の病因の文脈でそれらの機能を探求することは、新しい診断および治療介入への道を開くだろう。

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