Name: isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-05-07T13:30:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Мы с благодарностью признаем помощь в FACS-Сортировка по Бербель Рейнингер и Вольфганг Бауэр. Эта работа была поддержана грантами б. м. л. из австрийского научного фонда (ФВФ: V 525-B28) и Федерацией европейских биохимических обществ (FEBS, исследовательский фонд последующих мер). S. F. является получателем DOC стипендий Австрийской академии наук (OeAW). Мы с благодарностью признаем отличную поддержку от основных объектов в медицинском университете Вены. Мы благодарим Бернхарда Гесльбауера, Кристин РАДТКЕ и Мартина Вивхафер за предоставление материала для кожи человека.

<ol>
	<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity:+more+than+skin+deep.">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).</li><li>Lowry, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).</li><li>Kisseleva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+fibrogenic+myofibroblasts+in+fibrotic+liver.">The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver.</a> Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).</li><li>LeBleu, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+myofibroblasts+in+kidney+fibrosis.">Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis.</a> Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+fibrosis.+Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential.">Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), (2015).</li><li>Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Differentiation+Complex:+A+Review+on+Its+Epigenetic+Regulation+and+Potential+Drug+Targets.">Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets.</a> Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Mastrogiannaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+Stabilization+in+Skin+Fibroblasts+Causes+Fibrotic+Lesions+by+Preventing+Adipocyte+Differentiation+of+the+Reticular+Dermis.">beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).</li><li>Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+beta-catenin+activation+remodels+the+dermis+via+paracrine+signalling+to+distinct+fibroblast+lineages.">Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages.</a> Nature Communications. 7, 10537 (2016).</li><li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis:+differences+in+growth+potential+in+vitro.">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204 (4392), 526-527 (1979).</li><li>Hiraoka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clonal+types+of+human+skin+fibroblasts+with+different+potentials+for+proliferation+and+tissue+remodeling+ability.">Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability.</a> Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).</li><li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+role+of+hair+follicle+dermal+cells+in+bioengineered+skins.">Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins.</a> Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).</li><li>Korosec, A., Lichtenberger, B. M., Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.">Ch. 12.</a> Skin Tissue Models. , 279-301 (2017).</li><li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin.">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. , (2018).</li><li>Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+by+three-dimensional+culture+enables+dermal+papilla+cells+to+induce+de+novo+human+hair-follicle+growth.">Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).</li><li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Single-Cell+Transcriptional+Profiling+Identifies+Functionally+Distinct+Human+Dermal+Fibroblast+Subpopulations.">Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li><li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro.">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li><li>Jiang, D., Rinkevich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Skin+Fibroblastic+Cell+Types+Beyond+CD90.">Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).</li><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all.">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Fibroblast-Activation+Protein-Specific+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts.</a> BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).</li><li>Jiang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+fibroblast+activation+protein+alpha-targeted+immunotherapy+strategy.">The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy.</a> Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).</li><li>Pure, E., Blomberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumorigenic+roles+of+fibroblast+activation+protein+in+cancer:+back+to+the+basics.">Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics.</a> Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).</li><li>Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fibroblast+activation+protein+(FAP):+substrates,+activities,+expression+and+targeting+for+cancer+therapy.">Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy.</a> PROTEOMICS &#8211; Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).</li><li>Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+skin+ageing+and+its+medical+therapy.">A review of skin ageing and its medical therapy.</a> Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).</li><li>Gilchrest, B. A., Krutmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin Aging. , 198 (2006).</li><li>Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+skin+aging:+state+of+the+art.">Molecular mechanisms of skin aging: state of the art.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Kundrotas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+distinguishing+mesenchymal+stem+cells+from+fibroblasts.">Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts.</a> Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).</li><li>Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+expression+of+surface+markers+on+fibroblasts+and+fibroblast-like+cells+isolated+from+different+human+tissues.">Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В этой статье мы описываем метод изоляции папиарной и ретикулярной фибробласты из человеческой кожи. CD90 широко используется для идентификации или изоляции кожных фибробласты18,20,21. Однако, мы продемонстрировали, что кроме CD90 + фибробласты, человеческая дерма также таит в себе CD90- фиброза, выражающее фак16, которая была установлена в качестве маркера активированного фибробласты и связанного с раком фибробласты ( Кафс)22,23,24,25. Важно отметить, что мы смогли идентифицировать три субпопуляции фибровзрыва+CD90-, фак+CD90+ и фак-CD90+ в биопсии кожи от всех здоровых человеческих доноров. Поэтому мы приходим к заключению, что фак – это не только маркер для активированных фибробласты, но и нормальных фибробласты тканей.
Следует отметить, что в фак-CD90- Cell популяции, оставшейся после применения вышеописанной стратегии исключения-и стробирования, не содержит фибробласты, так как эти клетки не размножаются в фибродоменной среде культивирования в пробирке, но большинство вероятно, смешанные ячейки населения, включая лимфатические клетки и перициты среди других16.
Урожайность клетки полученная пользой вышеописанного протокола может поменять в зависимости от тела-части которую часть кожи используемая для изоляции возникает от. Дерма из различных частей тела отличается относительно его структуры, толщины, а также коллагена состава. Например, кожа лица или плеча намного тоньше, чем кожа живота или бедра, которые также часто демонстрируют более толстый слой подкожно-жировой клетчатки. Кроме того, возраст и пол кожи доноров может еще больше не влияет на эффективность диссоциации ткани, но также может повлиять на распределение три фибродоменные субпопуляций (рис. 3), когда изолированы от полной толщины кожи. Это приводит к тому, что папиарная дерма сжимается и что общее количество фибровзрыва уменьшается с возрастом11,26,27,28. Кроме того, гранулы ячейки из папиарной дермы, вероятно, будет больше, чем от ретикулярной дермы, так как верхняя дерма более плотно заселена фибробласты, чем Ретикулярная дерма. Кроме того, Нижняя дерма также жестче и плотнее упакован с коллагеном, что затрудняет отделить ткани и освободить фибробласты. Следует отметить, что ячейка гранул может появиться очень красный, поэтому лизиса красных кровяных клеток рекомендуется.
В дополнение к идентификации трех субпопуляций в неповрежденной человеческой коже, мы также показываем, что в дерматомед кожи, каждая фиброза взрыва подмножество обогащается либо в папиарной или ретикулярной дермы16. Точная нарезка кожи с помощью дерматома имеет решающее значение для получения правильного обогащения каждого субпопуляции из различных кожных слоев. Так как папиарная дерма очень тонкая, то срез дерматомед, представляющий его, не должен превышать толщину 300 мкм. Верхняя Ретикулярная и Нижняя Ретикулярная фибробласты как представляют ретикулярную родословную, так и отображают схожие функции и сигнатуры генов, Таким образом, можно было бы также рассмотреть, не разделяя их.
Важно отметить, что все три фибробласты популяции находятся на всей территории дермы и не присутствуют исключительно в одном слое, поэтому эксфолиант культур от папилломы или Ретикулярная дерма приводит к смешанным культурам фибровзрыва. Однако, фак+CD90- папиарный фибровзрыв наиболее обильны в папиарной дерме и следуют градиенту от поверхностных до нижних кожных слоев, в то время как фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты следуют Обратный градиент от нижнего к поверхностным слоям16. Кроме того, большинство CD90+ фибробласты из папиарной дермы почти исключительно обнаружены окружающие кровеносные сосуды и выражают периваскулярные фибромы маркер CD14629, и, следовательно, вероятно, демонстрируют различные функции, чем оставшиеся CD146- ретикулярные фибробласты16. CD146 может быть использован в качестве дополнительного маркера в стратегии стробирования, чтобы исключить эту популяцию.
После диссоциации кожных слоев, изолированные клетки окрашиваются в специально разработанный антитело-коктейль, содержащий различные антитела для исключения иммунных клеток, эндотелиальных и лимфатических клеток, клеток эпидермального, эритроцитов и МСК, чтобы получения чистого популяции фиброза. Следует отметить, что выбор маркера для идентификации и исключения ММСК может быть сложным из-за высокого количества опубликованных маркеров МСЦ30,31. Поскольку ММСК выражают CD90 как фибробласты, дополнительные маркеры МСЦ, такие как CD105 или CD271, могут оказаться полезными для их идентификации. Однако, МСК только представляют очень низкий процент всех кожных клеток и с CD90+ фибробласты отображения типичных морфологических особенностей фибробласты при сортировке, можно утверждать, что исключение МСК путем использования отдельных маркеров поверхности клеток может быть ненужным.
Важно отметить, что мы проанализировали экспрессии гена фак и CD90 после сохранения клеток в культуре в течение 7-14 дней после сортировки (данные не показаны) и обнаружили, что выражение обоих маркеров upregulated в соответствующих отсортированных одного положительного (фак+CD90- или Фак-CD90+) клетки16. Поэтому мы подчеркиваем, что описанные выше маркер наборы и протокол позволяют изоляции первичных фиброза подмножеств непосредственно из ткани, но не от ранее культивируемых смешанных популяций фиброза.
Тем не менее, мы демонстрируем, что функциональность всех трех субпопуляций сохраняется в клеточной культуре независимо от изменения экспрессии маркеров поверхности клетки, так как фибробласты сортируются как фак+CD90- папиарные фибробласты не приобретают способность проходить адипогенез после длительного периода культуры, в то время как фибробласты сортируются как фак+CD90+ или ФАГ-CD90+ Ретикулярная фибробласты сохраняют свою способность дифференцироваться в адипоциты 16 . Важно, что мы также обнаружили, что папилломы и ретикулярные специфические гены все еще выражены в более высокой степени в ФАГ+CD90- и CD90+ соответственно.
В заключении, мы установили протокол для изоляции функционально выраженных фибродоменных подмножеств через FACS, который впервые позволяет изоляцию и анализ чистого и наивного субпопуляций фиброза от человеческой кожи дермы. Этот метод устанавливает основные улучшения для широко используемого фибровзрыва эксентант культуры изоляции протокол от верхнего и нижнего дермы как (i) противоположные градиент папиарной и ретикулярной фибробласты существует от поверхности кожи к гидермии и (II) фибробласты изменить их ген подпись в пробирке.

В качестве основной клеточной составляющей соединительной ткани, фибробласты несут главную ответственность за осаждение коллагена и эластичных волокон, которые в конечном итоге образуют внеклеточной матрицы1, и, таким образом, их роль в ткани гомеостаза, регенерации и болезнь была недооценена в течение длительного времени. Тем не менее, фибробласты в последнее время в центре внимания исследователей, не только потому, что они представляют собой видный клеточный источник индуцированных плюрипотентных стволовых клеток2 , но и из-за их высокой пластичности и прикосновенность в патогенезе большое количество заболеваний, таких как фиброз органов3,4,5 или рак6,7.
Человеческая кожа состоит из многослойного эпителия, эпидермис, и его основной соединительной ткани, дермы, которые могут быть гистологически подразделяются на верхнюю папениари и нижней ретикулярной дермы и в основном состоит из фибробласты и внеклеточной матрицы8 и гидермы. Согласно их положению внутри ткань, кожные фибробласты грубо были расклассифицированы в папиарные и ретикулярные фибробласты1.
Важно отметить, что последние данные свидетельствуют о том, что эти субпопуляции фиброза кожного не только гистологически различимы, но и их функции значительно разнообразны. В коже мыши, папиарные и ретикулярные фибробласты возникают из двух различных линий во время эмбриогенеза9. Несколько строк доказательств свидетельствуют о том, что две линии преемственности выполняют различные роли не только в ткани гомеостаза, морфогенез волосяного фолликула, рана ремонта и фиброза7,9,10, но они также реагируют на различные сигналы от неопластических эпидермального стволовых клеток11, предлагая расходящиеся роли в патогенезе рака. Удобно, обе линии выражают отдельный набор взаимоисключающих клеточных маркеров в коже взрослого мыши, что позволяет изоляция чистого популяции фиброза кожи и последующего обширного анализа их специфических функций в пробирке9 , 11-ое.
Соответственно, по крайней мере две различные фибродоменной подмножества с отчетливыми морфологии и функций, в том числе расходящиеся темпы распространения, ткань ремоделирования мощностей12,13, а также способность поддерживать рост эпидермального стволовых клеток в пробирке, были описаны для кожи человека дермы14,15. Однако, большая часть из опубликованных изучений на людских дермальных фибробласты была дирижирована использующ смешанные популяции фиброза изолированное от эксентант культур от дерматомед кожи, в виду того что специфические комплекты маркера поверхности клетки позволяющ изоляцию чисто людской папиарной или ретикулярных субпопуляций фиброза по аналогии с мышью дермы еще предстоит установить.
Недавно мы продемонстрировали, что кожа человека папиарной и Ретикулярная фибробласты характеризуются специфическими поверхностными маркерами, которые позволяют изоляцию соответствующих субпопуляций с помощью сортировки флуоресцентной ячейки (FACS)16: фак + CD90- фибробласты представляют собой папиарные фибробласты, расположенные главным образом в верхнем дерме, представляя более высокие уровни распространения, отдельную сигнатуру генов, но не имеющий адипогенного потенциала. Фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты принадлежат к ретикулярной линии нижних кожных отсеков, которые менее пролиферативные, но легко претерпевают адипогенез — признак ретикулярной фибробласты. Этот метод позволяет экстенсивно изучать эти отчетливые субпопуляции фиброза не только в отношении их специфических функций в физиологических условиях, но и в контексте патогенеза кожных заболеваний, включая рак кожи.
Однако, так как фибробласты изменить их выражение поверхности маркера ячейки в двумерной в пробирке культуры16,17,19, применение нашего протокола ограничивается изоляцией первичных фибробласты от человека дерме и не допускает идентификации папиарной или ретикулярной фибробласты в популяциях смешанной клеточной культуры. Важно отметить, что, хотя выражение клеточной поверхности маркеров изменений в пробирке, мы показали, что фибромы подмножеств изолированы в соответствии с протоколом, описанным ниже сохранить их конкретной функциональности при культивируется16, таким образом, позволяя в пробирке исследования свойств подмножества конкретных в физиологических или патологических состояний.
В заключение, мы разработали протокол для изоляции отдельных фиброподных подмножеств через FACS, что в первый раз позволяет изоляции чистого популяции фиброза от человеческой кожи дермы в наивное состояние.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9718</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax-C100 (1x) Basal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17001-074</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME0095</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100 Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12556015</td>
			<td>used for fibroblast growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8216;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>! CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,096,341,011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OilRed O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline without Ca++ &#38; Mg++</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237205</td>
			<td>used for selfmade ACK Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA MicroKit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman 2xUniversal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4324018</td>
			<td>! CAUTION Skin and eye irritant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD31-AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303109</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD45-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304029</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit human CD49f/ITGA6-PE</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA699PE</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD90/Thy-1-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328120</td>
			<td>Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD106-AF421</td>
			<td>BD</td>
			<td>744309</td>
			<td>Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human CD235ab-Pacific blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>306611</td>
			<td>Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human E-cadherin-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>147304</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti human FAP-APC</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>FAB3715A</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422302</td>
			<td>Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mL micronic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,692,405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene canonical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Acculan 3Ti Dermatome</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGA670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap Dermatome blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AESCGB228R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96well</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tea strainer</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin by fluorescence-activated cell sorting

Фибробласты будут высоки гетерогенными населенностью вовлечено в патогенезе много людских заболеваний. В коже человека дерме, фибробласты традиционно приписывается к поверхностной папиарной или нижней ретикулярной дерме в соответствии с их гистологическим локализацией. В мыши дермы, папиарные и ретикулярные фибробласты происходят из двух различных линий с расходящимися функциями в отношении физиологических и патологических процессов и отдельный профиль маркера поверхности ячейки, с помощью которого они могут быть различена.
Важно отметить, что данные из эксфолиант культур из поверхностных и нижних кожных слоев предположить, что по крайней мере два функционально различных дермальных фибробласты линий существуют в коже человека дермы, а также. Однако, в отличие от кожи мыши, маркеры клеточной поверхности, позволяющие дискриминацию различных фиброподных подмножеств еще не были созданы для кожи человека. Мы разработали новый протокол для изоляции человека папиарной и ретикулярной популяции фиброза с помощью флуоресцентной активации ячейки сортировки (FACS) с использованием двух клеток поверхности маркеры фиброза активации белка (фак) и Thymocyte антиген 1 (Thy1)/CD90. Этот метод позволяет изоляцию чистого фиброзирующие подмножества без экстракорпорального манипулирования, который, как было показано, влияет на экспрессию генов, таким образом, позволяя точный функциональный анализ подмножества фибровзрыва кожных заболеваний человека в отношении ткани гомеостаза или болезни Патологии.

Обзор основных шагов для обработки ткани кожи для получения одной клеточную суспензию показан на рисунке 1, отображая дерматоминг кожи (рис. 1a), различные кожные слои (рис. 1a), удаление подкожно-жировой клетчатки слой (рис. 1C) и разделение эпидермиса и папиарной дермы (рис. 1c), а также различные этапы ручного диссоциации и ферментативной ткани (рис. 1c, F). Схема трех кожных слоев представлена на рисунке 2.
На рисунке 3 отображается стратегия стробирования потока цитометрии окраски панели для анализа различных фибродоменной подмножеств из кожи человека. Дополнительные маркеры поверхности клеток, которые не выражаются на фибробласты разрешения исключения различных других клеток, присутствующих в коже, таких как иммунные клетки, эпидермальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток (МСК), эритроцитов или эндотелиальных клеток для достижения максимальной чистоты в изолированных популяциях. Не критично использовать идентичную панель FACS, которая используется на рисунке 2 для идентификации субпопуляций фибровзрыва, однако это наша рекомендация. Можно использовать антитела, маркированные различными флуоресцентными красителями или изменять комбинацию маркеров исключения.
Следует отметить, что этот протокол позволяет идентифицировать три популяции фиброза в коже человека, которые присутствуют с различной внутрикожные локализацией, профилями экспрессии генов, а также функциями (рис. 4). Фак+CD90- обогащаются в папиарной дерме, тогда как фак+CD90+ и фак-CD90+ более обильны в ретикулярной дерме (рис. 4A). Все три субпопуляции демонстрируют типичную морфологию фиброза при сортировке клеточной культуры (Рисунок 4B). Интересно, что они различаются относительно их способности дифференцироваться в адипоцитов, который является отличительной чертой для ретикулярной фибробласты. Совмещение этих результатов с экспрессией генов в режиме реального времени на полимеразной цепной реакции (RT-СР)16 (Рисунок 4c), показывающая, что фак+CD90- клетки выражают высокий уровень маркеров, обычно приписываемых папиарные фибробласты, такие как CD26, NTN и PDF, в то время как CD90+ клетки выражают известные ретикулярные маркеры, такие как CD36, ACTA2 и ппарγ на высоких уровнях, мы приходим к выводу, что фак+CD90- клетки принадлежат к папиарной и CD90+ клетки принадлежат к ретикулярной линии.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig1.jpg"> Рисунок 1: изолированность кожных одноклеточных суспензии из нетронутой человеческой кожи. (A) кожа нарезается электрическим дерматомом в папиарные и ретикулярные дермы. (B) папиарная дерма с прилегающим эпидермисом 300 мкм толщиной (вверху), а верхняя Ретикулярная дерма составляет 700 мкм толщиной (снизу). (C) подкожный жир слой является царапины-офф нижней ретикулярной дермы с скальпелем. (D) после инкубации папилломы дермы в растворе диссоциативной фермента при температуре 37 ° c для 1 ч, эпидермис может быть легко удален с помощью щипцов. E) различные кожные слои измельченные ножницами и передаются в смесь фермента пищеварения, состоящую из коллагеназы I, II и IV и гиалуронидазы. (F) после 1 h диссоциации при температуре 37 ° c, ткань пищеварения остановлен и подвеска выливают через чай стрейнер для удаления непереваренной части кожи. (G) клеточную суспензию фильтруют еще раз через 70 мкм сетчатый фильтр и центрифугирования при 500 х G при температуре 4 °c в течение 10 мин. (ч) после центрифугирования, клетка гранулы промывают с 1x PBS с 10% СУО и готов к FACS окрашивания. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig2.jpg"> Рисунок 2: секционирование человеческой кожи дермы в папиарной и ретикулярных слоях с дерматомом. Схема, показывающая три кожных слоя, полученные путем нарезки полной толщины кожи на папиарную дерму (в том числе эпидермис; 0 \ u2012300 мкм; дермальный слой 1), верхняя Ретикулярная (300 \ u20121 000 мкм; дермальный слой 2) и Нижняя Ретикулярная дерма (> 1000 мкм; дерматома. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig3.jpg"> Рисунок 3: стратегия FACS в отношении подпопуляций кожных фиброза для человека. (А\u-e) Во-первых, ячейки закрытого типа в одиночных (B) и жизнеспособных (DAPI-) клетках (C). Иммунные клетки (CD45+), мезенхимальные стволовые клетки (CD106+), эритроциты (CD235ab+) исключены (C) и тихоокеанские синие отрицательные клетки защищены дальше E-кадхерин (ECAD) и ITGA6 двойные отрицательные клетки (PE канал, D ). E-кадхерин и ITGA6 – это маркеры, выраженные на клетках эпидермиса. Далее, CD31-FITC положительных клеток (эндотелиальных и лимфатических клеток) исключены (D) в результате чего три фиброза популяции, выражающие один или оба из двух клеток поверхности фиброза маркеров фак и CD90: фак+CD90-, Фак+CD90+ и фак-CD90+ (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig4.jpg"> Рисунок 4: фак+CD90-, фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты отличаются комальной локализацией, экспрессией генов и функциональностью. (A) представитель FACS участков закрытого фибробласты изолированы от папиарной, верхней ретикулярной и нижней ретикулярной дермы. Стратегия стробирования объяснена в рисунке 3. Фак+CD90- фибробласты обогащаются в папиарной дерме (19,2%) по сравнению с нижней ретикулярной дермой (0,83%). Фак+CD90+ клетки можно найти на протяжении дермы, но их высокое изобилие в верхней ретикулярной дермы (40,7%). Фак-CD90+ обогащаются нижней ретикулярной дермой (64,4%). (B) к сведению, все три сортированные субпопуляции отображают типичную морфологию фибровзрыва на культуре в течение 7 дней (слева). Интересно, что они ведут себя по-разному в анализ адипогенеза. После 14 дней в культуре, фак+CD90- не дифференцируются в адипоциты в то время как фак+CD90+ и фак-CD90+ легко пройти адипогенез (справа; Нефть красный O пятна липидных клеток красный). Шкала баров = 1 000 мкм. (C) непосредственно сортируется фак+CD90- ФИБРОБЛАСТЫ Экспресс ПАПИЛЛОМЫ фиброза маркеры CD26, NTN1 и PDF, в то время как фак-CD90+ клетки выражают CD36, ACTA2 и ппарγ, как известно, выраженные ретикулярные линии. * p 0,05; p 0,0005 по сравнению с фак+/90- клетками; # p 0,05; # # # p 0,0005 по сравнению с фак-/CD90 90+ ячейки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Эта рукопись описывает протокол на основе FACS для изоляции папиарной и ретикулярной фибробласты из человеческой кожи. Он обходит в пробирке культуры, которая была неизбежна с широко используемым протоколом изоляции через эксфолианта культур. Исходящие фибродоменные подмножества функционально различны и отображают дифференциальное выражение генов и локализацию внутри дермы.

Изоляция Папиарной и Ретикулярная фибробласты от человеческой кожи путем флуоресценции активированной ячейки сортировка

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Этот протокол облегчает изоляцию функционально различных фибробластов от кожи человека путем сортировки FAC на основе выражения маркера поверхности клетки. Впервые папиллярные и ретикулярные фибробласты могут быть изолированы непосредственно от кожи без манипуляций с пробирки. Это огромный прогресс по сравнению с ранее установленными методами изоляции с использованием культур explant.Дермальные подмножества фибробластов питают различные функции в гомеостатической обстановке. С помощью этого инструмента можно исследовать функциональные различия в патологиях кожи, включая рак или воспалительные заболевания кожи. Поскольку обработка человеческой ткани требует некоторой практики для достижения удовлетворительных урожаев клеток, мы хотели бы обеспечить визуальную демонстрацию для облегчения и ускорения этого процесса.Чтобы подготовить полную толщину дермы, поместите кусок человеческой кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом лицом вниз. Держите эпидермис плотно с типсами, и соскребать подкожный слой жира скальпелем. Затем нарежьте ткань полосками шириной в пять миллиметров, прежде чем положить их в чашку Петри.Чтобы раздел дермы на папиллярные и ретикулярные слои, поместите кусок кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом, обращенным вверх. Держите кожу плотно по краям с типсами, и нарезать раздел толщиной 300 микрометров с электрическим дерматомом. Перенесите первый слой, состоящий из эпидермиса и папиллярной дермы, в чашку Петри.Затем немедленно перейти к отделить эпидермис и дермы, или добавить 1x PBS держать ткани от высыхания. Затем отрегулируйте дерматом до толщины резки 700 микрометров и нарежьте оставшуюся дерму. Поместите верхний кусочек, который определяется как верхний ретикулярный дермы, в отдельную чашку Петри.Впоследствии, соскребать подкожный слой жира скальпелем из остаточного нижнего ретикулярного дермального слоя, и отбросить его. Соберите нижнюю ретикулярную дерму в другом блюде Петри. Немедленно приступайте к процедуре энзиматической пищеварения или добавьте 1x PBS, чтобы ткань не высохла.Для выполнения ферментативного пищеварения поместите пятимиллиметровые полоски кожи или эпидермис/папиллярную дерму с эпидермисом, обращенным вверх, в чашку Петри с 10 миллилитров диссоциирующего ферментного раствора. Затем инкубировать чашку Петри при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации перенесите эпидермис/папиллярную дерму на крышку чашки Петри.Отделить эпидермис от верхней дермы с двумя типсами, каждый из которых держит край дермы. Впоследствии, фарш каждого дермального слоя как можно тщательнее. Чем меньше кусочки, тем лучше пищеварение тканей.Затем приготовьте смесь пищеварения. Перенесите рубленую ткань с 10 миллиметрами подготовленной смеси пищеварения в 50-миллиметровую трубку. Инкубировать ткани при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа под возбуждение.Переверните трубку несколько раз во время пищеварения. Чтобы подготовить одноклеточную суспензию, прекратите переваривание энзиматической ткани, добавив 10 миллилитров фибробластовой среды в переваренную ткань на льду. Затем налейте содержимое каждой трубки через обычный стерильный нержавеющий чай ситечко, и собирать подвеску клетки в чистой чашке Петри.Вымойте ситечко со средним, и пюре непереваренных частей ткани с краем шприца поршень. После этого пипетка собрала подвеску клетки через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Промыть ситечко клетки со средним, и собирать поток через ту же трубку.Затем центрифуга трубки при 500 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант и вымойте клеточные гранулы пятью миллилитров фибробластовой среды. Повторите шаг центрифугации еще раз.После этого удалите супернатант и повторно снимите гранулы в один миллилитр буфера эритроцитов ACK. Оставьте клетки в буфере лиза примерно на одну минуту при температуре окружающей среды. Затем, остановитьлиз, добавив девять миллилитров 1x PBS с 10%FCS.Центрифуга трубки снова в 500 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта впоследствии. После того, как клетки были окрашены для сортировки FAC следующие стандартные протоколы, сортировать три фибробластов субпопуляции в отдельные микроцентрифуг трубки заполнены либо с 350 микролитров лиза буфера для изоляции РНК или 350 микролитров фибробластовой среды роста для клеточной культуры. Инвертировать трубы немедленно, и либо положить лиза буферных труб в жидкий азот, или положить фибробласта роста средних труб на льду.После FACS, спина клетки вниз на 500 раз g в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию. Затем, пластины равное количество клеток в фибробластовой среды роста в 24-хорошо клеточной культуры блюдо, и оставить их расти, пока они не достигнут 70% слияния. Затем замените культурную клеточную среду средой дифференциации адипоцитов и дайте клеткам продифференцироваться в течение 14 дней.При дифференциации день 14, исправить клетки с 4%PFA в течение 20 минут. Вымойте скважины 60%изопропанолом, и дайте ему полностью испариться. Затем, пятно клеток с пятью миллимоларами фильтрованного масла Red O в течение 20 минут.Через 20 минут промойте окрашенные клетки четыре раза дистиллированной водой. Изображение клеток, погруженных в воду с перевернутым микроскопом при 10-м увеличении с передаваемым светом. Этот протокол позволяет идентифицировать три популяции фибробластов в коже человека, что представляет собой различную интрадерматальную локализацию, профили экспрессии генов и функции.FAP-положительный CD90-отрицательный обогащены в сосочковой дерме, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный более обильны в ретикулярной дерме. Все три отсортированы субпопуляции отображения типичных фибробластов морфологии на культуру в течение семи дней. Интересно, что они ведут себя по-разному в анализе адипогенза.После 14 дней в культуре, FAP-положительный CD90-отрицательный не дифференцируются в адипоциты, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный легко проходят адипогенез. Профилирование экспрессии генов показывает, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки выражают высокий уровень маркеров, обычно приписываемых папиллярным фибробластам, таким как CD26, NTN и PDPN, в то время как CD90-положительные клетки выражают известные ретикулярные маркеры, такие как CD36, гладкий актин мышц и PPAR-гамма на высоких уровнях. Мы приходим к выводу, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки принадлежат к сосочковой и CD90-положительной клетки принадлежат к ретикулярной линии.Пищеварение работает лучше всего, если кожные кусочки тщательно фарш и инкубируется в достаточном количестве пищеварения среды. Дермальные фибробластые подмножества функционально разнообразны. Изучение их функции в контексте патогенеза болезни проложит путь для новых диагностических и терапевтических вмешательств.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Genetics

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Выделение Giant хромосомы типа ламповых щёток из живых ооцитов Лягушки и саламандры

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Изоляция ядра жировой ткани для одноклеточных геномных приложений

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Прямое перепрограммирование фибробластов человека в миобласты для исследования терапии нервно-мышечных расстройств

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...