Name: analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker at JoVE.co

Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du Us Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Rabies Management Program et IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Allemagne).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre national de recherche sur la faune de l'USDA dans le cadre du protocole de recherche approuvé QA-2597.
REMARQUE : Le protocole suivant décrit la procédure d'analyse pour détecter l'acide méthyl-iophénoxique dans le sérum de mangouste. Cette méthode est la version finale d'un processus itératif qui a commencé par l'analyse de l'acide éthylo-iophenoxique dans le s...

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La méthode LC-MS/MS développée pour les études a utilisé la sélectivité de la surveillance des réactions multiples pour quantifier avec précision l'IpA et l'IPA dans le sérum de mangouste. La sélectivité de la détection de la SP/MS a également permis un protocole de nettoyage simple qui repose uniquement sur l'acétonitrile pour précipiter les protéines du sérum avant l'analyse.
Les acides iophénoxiques sont solubles dans l'ACN mais sont pratiquement insolubles dans l'eau. Po...

Le virus de la rage (RABV) est un lyssavirus échoué unique de sens négatif, et circule parmi diverses espèces de réservoir satifieux dans les ordres Carnivora et Chiroptera. Plusieurs espèces de mangouste sont des réservoirs de RABV, et la petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est le seul réservoir à Porto Rico et d'autres îles des Caraïbes dans l'hémisphère occidental1,2,3 . Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé grâce à une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). Aux États-Unis, cette activité de gestion est coordonnée par l'USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. À l'heure actuelle, il n'existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques et divers types d'appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs suggérant qu'un programme de VVA pour les mangoustes est possible5,6,7,8.
La surveillance de l'impact de la VCO repose sur l'estimation de l'étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l'évaluation d'un changement dans la séroprévalence des anticorps RV. Cependant, cette stratégie peut être difficile dans les zones où les programmes de vRO de la faune sont actifs ou dans les zones où les niveaux de RV sont enzootiques et où les niveaux de fond des anticorps neutralisants RABV (RVNA) sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur inclus dans l'appât ou la matrice externe d'appât peut être utile.
Divers marqueurs biologiques ont été utilisés pour surveiller l'utilisation des appâts chez de nombreuses espèces, y compris les ratons laveurs (Procyon lotor)9,10, stoats (Mustela ermine)11,12, blaireaux européens ( Meles Meles) 13, sangliers (Sus scrofa)14, petites mangoustes indiennes15 et chiens de prairie (Cynomysludovicianus)16,17, entre autres. Aux États-Unis, les appâts OPÉRATIONNELS de l'ORV comprennent souvent un biomarqueur de tétracycline de 1 % dans la matrice d'appâts pour surveiller l'accumulation d'appâts18,19. Cependant, les inconvénients de l'utilisation de la tétracycline comprennent une préoccupation croissante au sujet de la distribution d'antibiotiques dans l'environnement et que la détection de la tétracycline est généralement invasive, nécessitant l'extraction dentaire ou la destruction de l'animal pour obtenir des os échantillons20. Rhodamine B a été évalué comme marqueur dans une variété de tissus et peut être détecté à l'aide de la lumière ultraviolette (UV) et la fluorescence dans les cheveux et les moustaches10,21.
L'acide iophénoxique (API) est une poudre blanche et cristalline qui a été utilisée pour évaluer la consommation d'appâts chez les coyotes (Canis latrans)22, renard arctique (Vulpes lagopus)23, renard roux (Vulpes vulpes)24, ratons laveurs 9 (en) , 25, sanglier14, cerf rouge (Cervus elaphus scoticus)26, blaireaux européens12 et furets (M. furo)27, parmi plusieurs autres espèces de mammifères. Les temps de rétention de l'API varient selon les espèces de moins de deux semaines dans certains marsupiaux28,29, à au moins 26 semaines en ongulés26 et plus de 52 semaines chez les chiens domestiques (Canis lupus familiaris)30. Les temps de rétention peuvent également dépendre de la dose31. L'acide iophénoxique se lie fortement à l'albumine de sérum et a été historiquement détecté en mesurant des niveaux d'iode de sang32. Cette approche indirecte a été supplantée par des méthodes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour mesurer directement les concentrations d'acide iophénoxique avec détection UV33, et éventuellement avec la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LCMS) 34,35. Pour cette étude, une chromatographie liquide très sensible et sélective avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) méthode a été développée qui utilise la surveillance de réaction multiple (MRM) pour quantifier deux analogues de l'acide iophenoxique. Notre objectif était d'utiliser cette méthode LC-MS/MS pour évaluer la capacité de marquage de l'acide propanoïque 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl) (méthyl-IPA ou moi-IPA) et 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)l'acide butanoïque (éthyl-IPA ou et-IPA) et lorsqu'il est livré dans un ORV appât pour les mangoustes en captivité.
Les mangoustes ont été capturées vivantes dans des pièges à cages appâtés avec des saucisses fumées et de l'huile de poisson disponibles dans le commerce. Les mangoustes étaient logées dans des cages individuelles de 60 cm x 60 cm x 40 cm en acier inoxydable et nourrissaient une ration quotidienne de 50 g d'aliments commerciaux secs pour chats, complétées deux fois par semaine par une cuisse de poulet disponible dans le commerce. L'eau était disponible ad libitum. Nous avons livré deux dérivés de l'IPA, l'éthyle-IPA et le méthyle-IPA, aux mangoustes captives dans les appâts ORV placebo. Tous les appâts étaient composés d'un blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm avec un revêtement externe (ci-après « matrice d'appâts ») contenant de l'œuf de poulet en poudre et de la gélatine (Tableaudes matériaux). Les appâts contenaient 0,7 ml d'eau ou de dérivés de l'API et pesaient environ 3 g, dont 2 g étaient la matrice externe de l'appât.
Nous avons offert 16 mangoustes captives et-IPA en trois concentrations : 0,14 % (2,8 mg et-IPA dans une matrice d'appâts de 2 g; 3 mâles [m], 3 femelles [f]), 0,4 % (2,8 mg et IPA en volume blister de 0,7 mL; 3 ml, 3f) et 1,0 % (7,0 mg d'éthyl-IPA en volume de 0,7 mL; , 2f). La dose globale de 2,8 mg correspond à un taux de dose de 5 mg/kg27,36 et est basée sur un poids moyen de mangouste de 560 g à Porto Rico. Nous avons choisi 1% comme la concentration la plus élevée que la recherche suggère l'aversion du goût à certains biomarqueurs peuvent se produire à des concentrations de 'gt;1% chez certaines espèces37. Nous avons seulement offert la dose de 1% dans le paquet de blister car la flocculation a empêché le soluté de se dissoudre dans le solvant suffisamment pour être uniformément incorporé dans la matrice d'appât. Un groupe témoin (2m, 1f) a reçu des appâts remplis d'eau stérile et pas d'IPA. Nous avons offert des appâts aux mangoustes le matin (8 heures du matin) pendant ou avant l'alimentation de leur ration d'entretien quotidien. Les restes d'appâts ont été enlevés après environ 24 heures. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement, un jour après le traitement, puis chaque semaine jusqu'à 8 semaines après le traitement. Nous avons anesthésié les mangoustes par inhalation de gaz isoflurane et recueillijusqu'à 1,0 ml de sang entier par venipuncture du cava de véa crânienne comme décrit pour les furets38. Nous avons centrifugé des échantillons de sang entier, transféré le sérum aux cryovials et les avons stockés à -80 oC jusqu'à l'analyse. Tous les animaux n'ont pas été échantillonnés pendant toutes les périodes afin de minimiser les impacts des prélèvements répétés de sang sur la santé des animaux. Les animaux témoins ont été échantillonnés le jour 0, puis hebdomadaires pendant jusqu'à 8 semaines après le traitement.
Nous m'avons livré l'IPA en trois concentrations : 0,035 % (0,7 mg), 0,07 % (1,4 mg) et 0,14 % (2,8 mg), tous incorporés dans la matrice d'appâts, avec 2 mâles et 2 femelles par groupe de traitement. Deux mâles et deux femelles ont reçu des appâts remplis d'eau stérile et pas d'IPA. Les heures d'offrande d'appât et l'anesthésie de mangouste sont décrites ci-dessus. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement le jour 1, puis chaque semaine jusqu'à 4 semaines après le traitement.
Nous avons testé des données de concentration de sérum pour la normalité et les moyens estimés pour des concentrations d'IPA de sérum de différents groupes de traitement. Nous avons utilisé un modèle mixte linéaire pour comparer les concentrations moyennes de sérum et d'IPA mises en commun entre les individus. Le type d'appât (matrice/blister pack) était un effet fixe en plus de la journée expérimentale, tandis que l'iD animal était un effet aléatoire. Toutes les procédures ont été exécutés à l'aide d'un logiciel statistique commun (tableaudes matériaux)et l'importance a été évaluée à 0,05 euro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Acetonitrile, Optima grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A996</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XS204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:380px;">C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-&#181;m particle size</td>
			<td style="width:193px;">Waters Corp.</td>
			<td style="width:304px;">186003085</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">ESI Source</td>
			<td style="width:193px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:304px;">G1958-65138</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Ethyl-iophenoxic acid, 97 %</td>
			<td style="width:193px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot MKBP5399V</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A117</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:380px;">LCMS software</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR0709514717</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microanalytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XP6U</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">5415C</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">MS/MS</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">G6470A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">N-Evap</td>
			<td style="width:193px;">Organomation</td>
			<td style="width:304px;">115</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:380px;">Oral Rabies Vaccine Baits</td>
			<td style="width:193px;">IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR100612108RR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Repeat pipettor</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">M4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5190-7024</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:380px;">Sodium chloride, Certified ACS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">S271</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Statistical Software Package</td>
			<td style="width:193px;">SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">Trifluoroacetic acid, 99 %</td>
			<td style="width:193px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:304px;">L06374</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:380px;">UPLC</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">1290 Series</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:193px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:304px;">099A PV6</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.2-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.413</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">0.5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.421</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">14-666-325</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">1250-&#181;L capacity pipette tips</td>
			<td style="width:193px;">GeneMate</td>
			<td style="width:304px;">P-1233-1250</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">1-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.43</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">2-mL amber screw-top autosampler vials</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5182-0716</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.456</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">80-position microcentrifuge tube rack</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">05-541-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:380px;">8-mL amber vials with PTFE-lined caps</td>
			<td style="width:193px;">Wheaton</td>
			<td style="width:304px;">224754</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">70 % (v/v) isopropanol</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A459</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">100-1000 &#181;L air displacement pipette</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">ES-100</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker

La petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est un réservoir de virus de la rage (RABV) à Porto Rico et comprend plus de 70% des cas de rage animale signalés chaque année. Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé par une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). À l'heure actuelle, il n'existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques oraux et divers types d'appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs. La surveillance du succès de l'ORV repose sur l'estimation de l'étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l'évaluation d'un changement dans les anticorps neutralisants RABV (RVNA) après la vaccination. Cette stratégie peut être difficile à interpréter dans les zones ayant un programme actif de VRO pour la faune ou dans les zones où le RABV est enzootique et où les niveaux de fond de l'ARV sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur incorporé avec le vaccin ou la matrice d'appâtpeut-nous peut être utile. Nous avons offert 16 appâts ORV placebo de mangouste captifs contenant de l'acide éthylo-iophenoxique (et-IPA) dans des concentrations de 0,4 % et 1 % à l'intérieur de l'appât et de 0,14 % dans la matrice externe de l'appât. Nous avons également offert 12 appâts ORV en captivité contenant de l'acide méthyl-iophénoxique (me-IPA) dans des concentrations de 0,035%, 0,07% et 0,14% dans la matrice d'appâts externes. Nous avons recueilli un échantillon de sérum avant l'offre d'appâts, puis hebdomadaire pour un jusqu'à huit semaines après l'offre. Nous avons extrait des acides iophenoxic de sérum dans l'acétonitrile et quantifiés utilisant la chromatographie liquide/spectrométrie de masse. Nous avons analysé le sérum pour et-IPA ou moi-IPA par spectrométrie liquide de chromatographie-masse. Nous avons trouvé la capacité de marquage adéquate pendant au moins huit et quatre semaines pour et- et- et moi-IPA, respectivement. Les deux dérivés de l'API pourraient convenir à l'évaluation sur le terrain de l'utilisation des appâts ORV chez les mangoustes. En raison de la longévité du marqueur dans le sérum de mangouste, il faut veiller à ne pas confondre les résultats en utilisant le même dérivé DE l'API lors d'évaluations consécutives.

Les chromatogrammes ioniques représentatifs d'une analyse me-IPA sont présentés à la figure 1. Le sérum de mangouste de contrôle (figure 1A) illustre le temps de rétention de et-IPA (analyte de substitution) et l'absence de me-IPA au moment de rétention indiqué. L'échantillon de contrôle de la qualité (figure 1B) illustre la séparation de base de l'API-et-IPA ainsi que les transitions de...

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Nous avons offert aux mangoustes captives des appâts vaccinales contre la rage buccale placebo avec de l'acide éthylique ou méthyle iophenoxique comme biomarqueur et vérifié l'utilisation d'appâts à l'aide d'une nouvelle chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).

Analyse des analogues de l'acide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Nous avons décrit une procédure pour détecter et quantifier l’acide iophenoxic dans le sérum de mangouste. Les résultats suggèrent que l’acide iophénoxique peut être utilisé comme marqueur biologique pour vérifier l’absorption bêta chez l’espèce. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet la quantification des analogues de l’acide iophénoxique à des parties par milliard de niveaux, en utilisant une technique simple de précipitation protéique.Pour la phase A mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’eau ultra pure. Pour la phase B mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’acétylonitrile. Pour le diluant, mélanger un millilitre d’acide trifluoroacétique avec 200 millilitres d’acétyltrile.Ensuite, pesez environ 10 milligrammes de méthyle-IPA sur le microbalance, et enregistrez la masse à plus ou moins 0001 milligrammes. Transférer quantitativement le méthyle-IPA dans un flacon volumétrique de classe A de 10 millilitres, à l’aide de quatre à cinq millilitres d’acétyltrile. Sonicate pendant une minute pour dissoudre tous les solides, puis mettre en volume avec de l’acétyltrile.Transférer environ huit millilitres de chaque bouillon sur des flacons de verre ambré de huit millilitres avec des bouchons doublés ptfe et conserver les échantillons à température ambiante. Ensuite, transférez le stock restant aux déchets dangereux. Pour le stock 25X sept stocks de méthyle-IPA préparer un stock de méthyl-IPA et d’acétyltrile à environ 200 microgrammes par millilitre.Transférer un millilitre du stock dans un flacon de cinq millilitres et diluer en volume avec de l’acétyltrile. Ensuite, transférez le bouillon dans un flacon de verre ambré de huit millilitres avec un bouchon doublé PTFE et rangez-le à température ambiante. À l’aide d’un pipettor à répétition, préparez les six stocks supplémentaires de méthyle-IPA de 25 X décrits dans le protocole texte en flacons de verre ambré de huit millilitres avec bouchons doublés ptfe et rangez-les à température ambiante.Pour le stock de substitution 25X, transférer 0,1 millilitre du stock concentré d’éthyl-IPA à un flacon volumétrique de classe A de 10 millilitres à l’aide d’une seringue en verre de 100 microlitres, puis diluer en volume avec de l’acétylisation. Transférer environ huit millilitres du stock de substitution dans un flacon de verre ambré de huit millilitres avec bouchon doublé PTFE et les conserver à température ambiante. Transférer le reste du stock vers des déchets dangereux.Ensuite, préparez des stocks 4X contenant à la fois du méthyle-IPA et de l’éthyl-IPA dans des flacons d’échantillonneurs de verre en verre de 10 millilitres, tel que décrit dans le protocole de texte. Par exemple, pour préparer le stock 4X7, ajouter 0,2 millilitres du stock 25X sept stock méthylique-IPA à un flacon de deux millilitres à l’aide du pipettor de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre. Ajouter 0,2 millilitres du stock d’éthyl-IPA de substitution 25X à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre.Ajouter 0,85 millilitres d’acétylonitrile à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité d’un millilitre. Capuchon le flacon solidement et inverser cinq fois pour mélanger. Par la suite, préparez la courbe standard en flacons d’échantillonneurs automatiques à vis de deux millilitres tels que décrits dans le protocole texte.Par exemple, pour préparer la norme sept, ajouter 0,2 millilitres du stock 4X7 à un flacon de deux millilitres, à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre. Ajouter 0,6 millilitres d’eau ionisée ultra pureté à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité d’un millilitre. Capuchon les flacons solidement et inverser cinq fois pour mélanger.Pour chaque échantillon, préparer un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant de 200 à 300 milligrammes de chlorure de sodium et disposer les tubes dans une grille en plastique à 80 position. Pour chaque échantillon, étiquetez un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre comme tube de centrifugeuse A et un deuxième tube de micro centrifugeuse comme B.Arrangez les tubes dans une grille en plastique de 80 position. Placez les matériaux et l’équipement suivants nécessaires à l’extraction du sérum dans une armoire de biosécurité de classe deux : les tubes de micro centrifugeuse, un mélangeur vortex, un pipettor à répétition avec des pointes de capacité de 0,5 millilitre et de cinq millilitres, une pipette de déplacement d’air de 100 à 1000 microlitres avec des pointes de 1000 microlitres, des contenants avec environ 100 millilitres chacun d’eau ionisée diluante et ultra pureté, et un récipient à déchets biodangereux.Ensuite, retirez les échantillons de sérum de l’entreposage congelé et réchauffez-les à température ambiante dans l’armoire de biosécurité. Vortex mélanger chaque échantillon de sérum avant l’échantillonnage. À l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre, distribuez 05 millilitres de sérum mangouste dans le tube A et ajoutez 05 millilitres du stock de substitution 25X.Ajouter ensuite 0,95 millilitres de diluant au tube A à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de cinq millilitres. Capuchon des tubes solidement et mélange vortex pendant 10 à 15 secondes. Ensuite, ajoutez le sérum mongoose de commande au tube A.Fortify chacun des échantillons de 4QC avec me-IPA utilisant un pipettor de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre.Ajouter 25X stock de substitution aux échantillons qc. Ensuite, ajouter le diluant aux échantillons qc. Capuchon des tubes et mélange vortex.Distribuez le chlorure de sodium pré-pesé dans le tube A et le mélange de vortex trois fois pendant huit à 12 secondes. Puis, essuyez les surfaces extérieures de la grille de flacon contenant le tube A à l’aide de 70% d’isopropanol. Après avoir retiré les échantillons de l’armoire de biosécurité, le tube de centrifugeuse A à 1200 fois G pendant une minute pour séparer les phases aqueuse et acétytrile.Pipette 0,8 millilitres de la phase supérieure de l’acétylonitrile au tube B, à l’aide d’une pipette de déplacement d’air de 100 à 1000 microlitres. Transférer le reste de la solution dans le tube A aux déchets dangereux et jeter le tube vide dans un contenant de déchets biodangereux. Maintenant, retirez l’acétylonitrile et le trifluoroacétique du tube B avec un léger flux de gaz azoté dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius.Ajouter 0,25 millilitres d’acétylonitrile au tube B à l’aide d’un mélange de pipettor et de vortex répété pendant quatre à cinq secondes. Puis, centrifugeuse à 1200 fois G pendant deux à quatre secondes pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Après centrifugation, ajouter 0,75 millilitres d’eau déionisée ultra pure au tube B à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de cinq millilitres et un mélange de vortex pendant quatre à cinq secondes.Centrifugeuse à 1200 fois G pendant une minute pour clarifier l’échantillon. Ensuite, transférez 0,75 millilitres du supernatant sur un flacon d’échantillonneur automatique à l’aide d’une pipette de déplacement d’air de 1 000 microlitres et jetez les pointes de pipette dans le contenant de déchets biorisques. Plafonnez chaque flacon d’échantillonneur automatique en toute sécurité pour l’analyse LC-MS/MS.Transférer le reste de la solution dans le tube B vers les déchets dangereux et jeter le tube vide dans un contenant de déchets biodangereux. Configurer le LC-MS/MS avec tous les paramètres décrits dans le protocole texte. Puissance sur le LC-MS/MS et permettre à la colonne d’atteindre 70 degrés Celsius avant de fixer la vitesse d’écoulement à 0,8 millilitres par minute.Configurer une séquence dans le logiciel d’acquisition de données pour injecter la courbe standard avant et après chaque lot composé d’échantillons de contrôle de la qualité et d’échantillons inconnus. Injectez toutes les normes et échantillons et acquérez des chromatogrammes d’ion MR à l’aide des paramètres énumérés dans le protocole texte. Après l’achèvement de la séquence, éteignez le LC-MS/MS et éliminez tous les flacons d’échantillonneur automatique dans les déchets dangereux.Le chromatogramme iion du sérum mongoose de contrôle illustre le temps de rétention de l’éthyl-IPA et l’absence de méthyl-IPA au moment de rétention indiqué. Le chromatogramme iion de l’échantillon de contrôle de la qualité illustre la séparation de base du méthyle-IPA de l’éthyl-IPA, ainsi que les transitions quantificatives et qualificatives pour le méthyle-IPA. Le chromatogramme iion de l’échantillon représentatif de l’étude montre une concentration observée de sérum de 33,5 microgrammes par microlitre de méthyle-IPA.La précision et les résultats de précision pour le sérum mongoose de contrôle enrichi de méthyle-IPA sont montrés ici. Les recouvrements pour cent allaient de 96,9 à 109 %, l’écart relatif en pourcentage aux trois niveaux d’enrichissement était de 3,4 % respectivement de 1,7 % et de 2,3 %. La précision et les résultats de précision pour le sérum mongoose de contrôle enrichi d’éthyl-IPA sont montrés ici.Les recouvrements pour cent allaient de 89,5 à 115 %L’écart type relatif en pourcentage aux cinq niveaux d’enrichissement était de 4,3 %, 1,5 %, 2,3 %, 5,6 % et 1,1 % respectivement. Toutes les mangoustes offraient des appâts éthyliques-IPA et méthylique-IPA consommaient au moins 25 % de l’appât dans les 24 heures et avaient des niveaux quantifiables d’éthyl-IPA et de méthyl-IPA dans leur sera, respectivement. L’utilité potentielle de la méthode pourrait être accrue en configurant le LC-MS pour recueillir des données pour d’autres analogues de l’acide iophénoxique, tels que le propyl et l’acide iophénoxique butyle.Nous avons encouragé le personnel à consulter les recommandations les plus récentes du comité consultatif sur les pratiques d’immunisation ou de son comité de biosécurité institutionnelle pour obtenir des conseils sur la nécessité d’une vaccination contre la rage avant l’exposition. Les articles 2.3 à 2.6 de ce protocole impliquant le travail avec le sérum non dilué devraient être exécutés dans un coffret de biosécurité de classe deux.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Une analyse boîte à outils de l&#39;évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Une introduction à guêpes parasites<em&gt; Drosophila</em&gt; Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Intralymphatique Immunothérapie et vaccination chez la souris

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l&#39; analyse biosimilarité

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...