Name: analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker at JoVE.co

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, servizio di ispezione della salute animale e vegetale, servizi naturali, programma nazionale di gestione della rabbia e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Germania).

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'USDA National Wildlife Research Center nell'ambito del protocollo di ricerca QA-2597.
NOTA: Il seguente protocollo descrive la procedura di analisi per rilevare l'acido metilico-fenossia nel siero di mangusta. Questo metodo è la versione finale di un processo iterativo che ha avuto inizio con l'analisi dell'acido etilico-fenofenico nel siero mangusta. Durante la valutazione iniziale dell'...

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Il metodo LC-MS/MS sviluppato per gli studi ha utilizzato la selettività del monitoraggio della reazione multipla per quantificare con precisione me-IPA ed et-IPA nel siero di mangusta. La selettività del rilevamento MS/MS ha anche permesso un semplice protocollo di pulizia basato esclusivamente sull'acetonitrile per far precipitare le proteine dal siero prima dell'analisi.
Gli acidi ifenossia sono solubili in ACN ma sono praticamente insolubili in acqua. Per escludere l'acqua dall'estrazion...

Il virus della rabbia (RABV) è un lyssavirus singolo spiaggiato e circola tra diverse specie di bacini naturali all'interno degli ordini Carnivora e Chiroptera. Molteplici specie di manguste sono serbatoi di RABV, e la piccola mangusta indiana (Herpestes auropunctatus) è l'unico serbatoio in Porto Rico e altre isole caraibiche nell'emisfero occidentale1,2,3 . Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato attraverso una strategia di vaccinazione orale della rabbia (ORV). Negli Stati Uniti (STATI Uniti), questa attività di gestione è coordinata dal USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. La ricerca sui vaccini sulla rabbia e vari tipi di esche per le manguste è stata condotta con risultati promettenti suggerendo un programma ORV per le manguste è possibile5,6,7,8.
Il monitoraggio dell'impatto dell'ORV si basa sulla stima dell'assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento nella sieroprevalenza dell'anticorpo RV. Tuttavia, questa strategia può essere difficile nelle aree con programmi ORV di fauna selvatica attivi o in aree in cui la rV è enzootica e i livelli di fondo degli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incluso nell'esca o nella matrice esterna dell'esca può essere utile.
Vari marcatori biologici sono stati utilizzati per monitorare l'assorbimento di esche in numerose specie, tra cui procioni ( lottoProcyon)9,10,stoats (Mustela ermina)11,12, tassi europei ( Meles meles) 13, cinghiali (Sus scrofa)14, piccole manguste indiane15 e cani della prateria (Cynomysludovicianus)16,17, tra gli altri. Negli Stati Uniti, le esche ORV operative spesso includono un biomarcatore tetraciclino dell'1% nella matrice delle esche per monitorare l'assorbimento delle esche18,19. Tuttavia, gli inconvenienti all'uso della tetraciclina includono una crescente preoccupazione per la distribuzione di antibiotici nell'ambiente e che l'individuazione della tetraciclina è tipicamente invasiva, richiedendo l'estrazione dei denti o la distruzione dell'animale per ottenere l'osso campioni20. La rhodamina B è stata valutata come marcatore in una varietà di tessuti e può essere rilevata utilizzando la luce ultravioletta (UV) e la fluorescenza nei capelli e nei baffi10,21.
L'acido iofenosssia (IPA) è una polvere cristallina bianca che è stata utilizzata per valutare il consumo di esche nei coyote (Canis latrans)22, volpe artica (Vulpes lagopus)23, volpe rossa (Vulpes vulpes)24, procioni 9 (in vie , 25, cinghiale14, cervo rosso (Cervus elaphus scoticus)26, tassi europei12 e furetti (M. furo)27, tra diverse altre specie di mammiferi. I tempi di ritenzione dell'IPA variano a seconda delle specie da meno di due settimane in alcuni marsupiali28,29, ad almeno 26 settimane in ungulates26 e oltre 52 settimane in cani domestici (Canis lupus familiaris)30. Tempi di ritenzione possono anche essere dose-dipendente31. L'acido iofenostico si lega fortemente all'albumina del siero ed è stato storicamente rilevato misurando i livelli di iodio nel sangue32. Questo approccio indiretto è stato soppiantato da metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per misurare direttamente le concentrazioni di acido iofenossia con rilevamento UV33, e alla fine con cromatografia liquida e spettrometria di massa (LCMS) 34,35. Per questo studio, è stata sviluppata una cromatografia liquida altamente sensibile e selettiva con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) che utilizza il monitoraggio della reazione multipla (MRM) per quantificare due analoghi di acido iofenosco. Il nostro obiettivo era quello di utilizzare questo metodo LC-MS/MS per valutare la capacità di marcatura di 2-(3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido propanoico (metil-IPA o me (3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido butanoico (ethyl-IPA o et-IPA) e quando consegnato in un ORV esca alle manguste in cattività.
Le manguste sono state catturate dal vivo in trappole a gabbia esche con salsicce affumicate e olio di pesce disponibili in commercio. Le manguste erano alloggiate in gabbie in acciaio inossidabile da 60 cm x 60 cm x 40 cm e alimentate con una razione giornaliera di cibo per gatti secchi commerciali da 50 g, completate due volte a settimana con una coscia di pollo disponibile in commercio. L'acqua era disponibile ad libitum. Abbiamo consegnato due derivati di IPA, ethyl-IPA e metil-IPA, alle manguste in cattività nelle esche ORV placebo. Tutte le esche erano composte da una confezione di blister di 28 mm x 20 mm x 9 mm con un rivestimento esterno (qui dopo "matrice di esca") contenente uova di gallina in polvere e gelatina (Tabella deimateriali). Le esche contenevano 0,7 mL di acqua o derivato IPA e pesavano circa 3 g, di cui 2 g era la matrice di esche esterne.
Abbiamo offerto 16 manguste in cattività et-IPA in tre concentrazioni: 0.14% (2.8 mg et-IPA in matrice di esche da 2 g; 3 maschi [m], 3 femmine [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml di volume blister; 3m, 3f) e 1,0% (7,0 mg ethyl-IPA in 0,7 ml volume blister; 2m , 2f). La dose complessiva di 2,8 mg corrisponde a un tasso di dose di 5 mg/kg27,36 e si basa su un peso medio mangusta di 560 g a Porto Rico. Abbiamo selezionato l'1% come la concentrazione più alta come la ricerca suggerisce avversione al gusto per alcuni biomarcatori può verificarsi a concentrazioni >1% in alcune specie37. Abbiamo offerto solo la dose dell'1% nella confezione del blister come flocculazione ha impedito al soluto di sciogliersi nel solvente sufficientemente da essere incorporato uniformemente nella matrice dell'esca. Un gruppo di controllo (2m, 1f) ha ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Abbiamo offerto esche alle manguste al mattino (8 a.m.) durante o prima dell'alimentazione della loro razione di mantenimento giornaliero. I resti di esca sono stati rimossi dopo circa 24 ore. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento, un giorno dopo il trattamento e poi settimanalmente fino a 8 settimane dopo il trattamento. Abbiamo anetizzato manguste per inalazione di gas isoflurano e raccolto fino a 1,0 mL di sangue intero da venipuncture della vena cava cranica come descritto per i furetti38. Abbiamo centrifugato campioni interi di sangue, trasferito sera ai crioviali e li abbiamo conservati a -80 gradi fino all'analisi. Non tutti gli animali sono stati campionati durante tutti i periodi di tempo per ridurre al minimo l'impatto del sangue ripetuto attinge alla salute degli animali. Gli animali di controllo sono stati campionati il giorno 0, poi settimanalmente per un massimo di 8 settimane dopo il trattamento.
Abbiamo consegnato me-IPA in tre concentrazioni: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) e 0.14% (2.8 mg), tutti incorporati nella matrice esca, con 2 maschi e 2 femmine per gruppo di trattamento. Due maschi e due femmine hanno ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Esca che offre tempi e anestesia mangusta sono descritti sopra. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento il giorno 1, e poi settimanalmente fino a 4 settimane dopo il trattamento.
Abbiamo testato i dati sulla concentrazione del siero per verificare la normalità e i mezzi stimati per le concentrazioni di IPA del siero di diversi gruppi di trattamento. Abbiamo usato un modello misto lineare per confrontare le concentrazioni medie di siero et-IPA raggruppate tra gli individui. Il tipo di esca (matrice/blister pack) era un effetto fisso oltre al giorno sperimentale, mentre l'ID animale era un effetto casuale. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando un software statistico comune (Tabella dei materiali) e la significatività è stata valutata a 0,05 USD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Acetonitrile, Optima grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A996</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XS204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:380px;">C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-&#181;m particle size</td>
			<td style="width:193px;">Waters Corp.</td>
			<td style="width:304px;">186003085</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">ESI Source</td>
			<td style="width:193px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:304px;">G1958-65138</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Ethyl-iophenoxic acid, 97 %</td>
			<td style="width:193px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot MKBP5399V</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A117</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:380px;">LCMS software</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR0709514717</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microanalytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XP6U</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">5415C</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">MS/MS</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">G6470A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">N-Evap</td>
			<td style="width:193px;">Organomation</td>
			<td style="width:304px;">115</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:380px;">Oral Rabies Vaccine Baits</td>
			<td style="width:193px;">IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR100612108RR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Repeat pipettor</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">M4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5190-7024</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:380px;">Sodium chloride, Certified ACS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">S271</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Statistical Software Package</td>
			<td style="width:193px;">SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">Trifluoroacetic acid, 99 %</td>
			<td style="width:193px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:304px;">L06374</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:380px;">UPLC</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">1290 Series</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:193px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:304px;">099A PV6</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.2-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.413</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">0.5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.421</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">14-666-325</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">1250-&#181;L capacity pipette tips</td>
			<td style="width:193px;">GeneMate</td>
			<td style="width:304px;">P-1233-1250</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">1-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.43</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">2-mL amber screw-top autosampler vials</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5182-0716</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.456</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">80-position microcentrifuge tube rack</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">05-541-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:380px;">8-mL amber vials with PTFE-lined caps</td>
			<td style="width:193px;">Wheaton</td>
			<td style="width:304px;">224754</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">70 % (v/v) isopropanol</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A459</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">100-1000 &#181;L air displacement pipette</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">ES-100</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker

La piccola mangusta indiana(Herpestes auropunctatus) è un serbatoio di virus della rabbia (RABV) a Porto Rico e comprende oltre il 70% dei casi di rabbia animale segnalati annualmente. Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato da una strategia di vaccinazione orale alla rabbia (ORV). Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. È stata condotta una ricerca sui vaccini per la rabbia orale e vari tipi di esche per le manguste con risultati promettenti. Il monitoraggio del successo dell'ORV si basa sulla stima dell'assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento negli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) dopo la vaccinazione. Questa strategia può essere difficile da interpretare in aree con un programma attivo ORV di fauna selvatica o in aree in cui RABV è enzootico e i livelli di fondo di RVNA sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incorporato con il vaccino o la matrice di esche può essere utile. Abbiamo offerto 16 manguste in cattività esche placebo ORV contenenti acido etilico-iofenico (et-IPA) in concentrazioni dello 0,4% e 1% all'interno dell'esca e dello 0,14% nella matrice esterna dell'esca. Abbiamo anche offerto 12 manguste in cattività esche ORV contenenti acido metilico-fenossia (me-IPA) in concentrazioni di 0,035%, 0,07% e 0,14% nella matrice di esca esterna. Abbiamo raccolto un campione di siero prima dell'offerta di esche e poi settimanalmente per un massimo di otto settimane dopo l'offerta. Abbiamo estratto gli acidi iofenossia dalla sera in acetonitrile e quantificato usando cromatografia liquida/spettrometria di massa. Abbiamo analizzato sera per et-IPA o me-IPA da spettrometria di cromatografia-massa liquida. Abbiamo trovato un'adeguata capacità di marcatura per almeno otto e quattro settimane rispettivamente per et- e me-IPA. Entrambi i derivati IPA potrebbero essere adatti per la valutazione sul campo dell'assorbimento delle esche ORV nelle manguste. A causa della longevità del marcatore in mangusta sera, bisogna fare attenzione a non confondere i risultati utilizzando lo stesso derivato IPA durante le valutazioni consecutive.

I cromatogrammi ionici rappresentativi da un'analisi me-IPA sono presentati nella Figura 1. Il siero di manguste di controllo (Figura 1A) illustra il tempo di conservazione di et-IPA (analitico surrogato) e l'assenza di me-IPA al tempo di conservazione indicato. L'esempio di controllo qualità (Figura 1B) illustra la separazione di base di me-IPA da et-IPA, nonché le transizioni di quantificatore e ...

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Abbiamo offerto esche da vaccino per la rabbia placebo delle manguste in cetticone con acido iofenico etilico o metilico come biomarcatore e l'assorbimento verificato delle esche utilizzando una nuova cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (metodo LC-MS/MS).

Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (Herpestes Auropunctatus) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Abbiamo delineato una procedura per rilevare e quantificare l'acido iofenossico nel siero di mangusta. I risultati suggeriscono che l'acido iofenossico può essere usato come marcatore biologico per verificare l'assorbimento beta nella specie. Il principale vantaggio di questo metodo è che consente la quantificazione degli analoghi dell'acido iofenossico a parti per miliardo di livelli, utilizzando una semplice tecnica di precipitazione proteica.Per la fase A mobile, combinare un millilitro di acido formico con un litro di acqua ultra pura. Per la fase mobile B, combinare un millilitro di acido formico con un litro di acetonitrile. Per il diluente, unire un millilitro di acido trifluoroacetico con 200 millilitri di acetonitrile.Successivamente, pesare circa 10 milligrammi di metil-IPA sul microbilanciamento e registrare la massa a più o meno 0001 milligrammi. Trasferire quantitativamente il metil-IPA in un matraccio volumetrico di classe A da 10 millilitri, utilizzando da quattro a cinque millilitri di acetonitrile. Sonicare per un minuto per sciogliere tutti i solidi e quindi portare a volume con acetonitrile.Trasferire circa otto millilitri di ogni stock in otto flaconcini di vetro ambrato millilitro con tappi rivestiti in PTFE e conservare i campioni a temperatura ambiente. Quindi, trasferire lo stock rimanente su rifiuti pericolosi. Per lo stock 25X sette stock di metil-IPA preparano uno stock di metil-IPA e acetonitrile a circa 200 microgrammi per millilitro.Trasferire un millilitro del materiale in un pallone da cinque millilitri e diluire in volume con acetonitrile. Quindi, trasferire il materiale in una fiala di vetro ambrato da otto millilitri con un cappuccio foderato in PTFE e conservare a temperatura ambiente. Utilizzando un pipettor ripetuto, preparare le sei scorte aggiuntive di metil-IPA 25X descritte nel protocollo di testo in otto flaconcini di vetro ambrato millilitro con tappi rivestiti in PTFE e conservare a temperatura ambiente.Per lo stock surrogato 25X, trasferire 0,1 millilitri del materiale etilico-IPA concentrato in un matraccio volumetrico di classe A da 10 millilitri utilizzando una siringa di vetro da 100 microlitri e quindi diluire in volume con acetonitrile. Trasferire circa otto millilitri del calcio surrogato in una fiala di vetro ambrato da otto millilitri con cappuccio foderato in PTFE e conservare a temperatura ambiente. Trasferire lo stock rimanente su rifiuti pericolosi.Successivamente, preparare scorte 4X contenenti sia metil-IPA che etile-IPA in flaconcini campionatore automatico in vetro a vite da 10 millilitri, come descritto nel protocollo di testo. Ad esempio, per preparare lo stock 4X7, aggiungere 0,2 millilitri dello stock 25X sette stock di metil-IPA a una fiala a due millilitri utilizzando il pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri. Aggiungere 0,2 millilitri del materiale etilico-IPA surrogato 25X utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri.Aggiungere 0,85 millilitri di acetonitrile utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di un millilitro. Cappucci la fiala in modo sicuro e inverti cinque volte per mescolare. In seguito, preparare la curva standard in due flaconcini campionatore automatico a vite millilitro come descritto nel protocollo di testo.Ad esempio, per preparare il sette standard, aggiungere 0,2 millilitri del materiale 4X7 a una fiala a due millilitri, utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri. Aggiungere 0,6 millilitri di acqua ionizzata ultra purezza utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di un millilitro. Fissare le fiale in modo sicuro e invertire cinque volte per mescolare.Per ogni campione, preparare un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente da 200 a 300 milligrammi di cloruro di sodio e disporre i tubi in un rack di plastica a 80 punti. Per ogni campione, etichettare un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri come A e un secondo tubo di micro centrifuga come B.Disporre i tubi in un rack di plastica a 80 posti. Posizionare i seguenti materiali e attrezzature necessari per l'estrazione del siero in un armadio per la biosicurezza di classe due: i tubi di micro centrifuga, un miscelatore a vortice, un pipettor ripetuto con punte da 0,5 milliliter e cinque punte di capacità millilitro, una pipetta di spostamento dell'aria da 100 a 1000 microlitri con punte di 1000 microlitri, contenitori con circa 100 millilitri ciascuno di acqua ionizzata diluita e ultra purezza e contenitore di rifiuti a rischio biologico.Quindi, rimuovere i campioni di siero dalla conservazione congelata e dalla temperatura calda a temperatura ambiente nell'armadio della biosicurezza. I vortici mescolano ogni campione di siero prima del campionamento. Utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri, erogare 05 millilitri di siero di mangusta nel tubo A e aggiungere 05 millilitri del calcio surrogato 25X.Quindi aggiungere 0,95 millilitri di diluente al tubo A utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di cinque millilitri. Fissare i tubi in modo sicuro e mescolare il vortice per 10-15 secondi. Aggiungere quindi il siero di mangusta di controllo al tubo A.Fortificare ciascuno dei campioni 4QC con me-IPA utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 millilitri.Aggiungere il materiale surrogato 25X ai campioni qc. Quindi, aggiungere il diluente ai campioni qc. Limitare i tubi e il mix di vortici.Distribuire il cloruro di sodio pre-pesato nel tubo A e mescolare il vortice tre volte per otto-12 secondi. Quindi, pulire le superfici esterne del rack del flaconcino contenente il tubo A utilizzando il 70% di isopropanolo. Dopo aver rimosso i campioni dall'armadio di biosicurezza, centrifugare tubo A a 1200 volte G per un minuto per separare le fasi acquose e acetonitrile.Pipetta da 0,8 millilitri della fase superiore dell'acetonitrile al tubo B, utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 100 a 1000 microlitri. Trasferire la soluzione rimanente nel tubo A in rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti rischiosi. Ora, rimuovere acetonitrile e trifluoroacetico dal tubo B con un flusso delicato di gas azoto in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius.Aggiungere 0,25 millilitri di acetonitrile al tubo B utilizzando un pipettor ripetuto e una miscela di vortici per quattro o cinque secondi. Quindi, centrifugare a 1200 volte G per due o quattro secondi per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo. Dopo la centrifugazione, aggiungere 0,75 millilitri di acqua deionizzata ultra pura al tubo B utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di cinque millilitri e una miscela di vortici per quattro o cinque secondi.Centrifuga a 1200 volte G per un minuto per chiarire il campione. Quindi, trasferire 0,75 millilitri del supernatante su una fiala del campionatore automatico utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 1000 microlitri e scartare le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti a rischio biologico. Limitare saldamente ogni flaconcino del campionatore automatico per l'analisi LC-MS/MS.Trasferire la soluzione rimanente nel tubo B in rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti rischiosi. Configurare l'LC-MS/MS con tutti i parametri descritti nel protocollo di testo. Accensione dell'LC-MS/MS e consentire alla colonna di raggiungere i 70 gradi Celsius prima di impostare la portata su 0,8 millilitri al minuto.Impostare una sequenza nel software di acquisizione dati per iniettare la curva standard prima e dopo ogni lotto costituita da campioni di controllo qualità e campioni sconosciuti. Iniettare tutti gli standard e i campioni e acquisire cromatogrammi ionici MR utilizzando parametri elencati nel protocollo di testo. Dopo il completamento della sequenza, spegnere l'LC-MS/MS e smaltire tutte le fiale del campionatore automatico nei rifiuti pericolosi.Il cromatogramma ionico del siero di mangusta di controllo illustra il tempo di ritenzione dell'etile-IPA e l'assenza di metil-IPA al tempo di ritenzione indicato. Il cromatogramma ionico del campione di controllo qualità illustra la separazione di base del metil-IPA dall'etile-IPA, nonché le transizioni quantificatore e qualificatore per il metil-IPA. Il cromatogramma ionico del campione rappresentativo dello studio mostra una concentrazione siere osservata di 33,5 microgrammi per microlitro di metil-IPA.I risultati di precisione e precisione per il controllo del siero di mangusta fortificato con metil-IPA sono mostrati qui. La percentuale di recuperi variava dal 96,9% al 109%La deviazione relativa percentuale ai tre livelli di fortificazione era rispettivamente del 3,4%1,7% e del 2,3%. I risultati di precisione e precisione per il controllo del siero di mangusta fortificato con etile-IPA sono mostrati qui.La percentuale di recuperi variava dall'89,5% al 115%La percentuale di deviazione standard relativa ai cinque livelli di fortificazione era rispettivamente del 4,3% 1,5%2,3%5,6% e dell'1,1%. Tutte le manguste offrivano etile-IPA e esche metil-IPA consumavano almeno il 25% dell'esca entro il vincolo di 24 ore e avevano livelli quantificabili di etile-IPA e metil-IPA nei loro sieri, rispettivamente. La potenziale utilità del metodo potrebbe essere aumentata configurando l'LC-MS per raccogliere dati per altri analoghi dell'acido iofenossico, come l'acido propile e butile iofenossico.Abbiamo incoraggiato il personale a consultare le più recenti raccomandazioni del comitato consultivo sulle pratiche di immunizzazione o del suo comitato istituzionale per la biosicurezza per ottenere indicazioni sulla necessità di una vaccinazione antirabbica preesposizione. Le sezioni da 2.3 a 2.6 di questo protocollo che comporta l'uso di siero non diluito devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe due.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

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An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

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Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

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Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

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Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

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Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

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Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

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Metodi in vitro per il confronto obiettivo vincolante e CDC induzione Tra terapeutiche Anticorpi: Applicazioni nel Analisi Biosimilarity

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Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

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