Name: analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker at JoVE.co

この研究は、米国農畜動植物衛生検査局、野生生物サービス、国立狂犬病管理プログラム、IDTビオロジカ(ドイツ・デッサウ・ロスラウ)の内部研究プログラムの一部によって支援されました。

すべての手順は、承認された研究プロトコルQA-2597の下でUSDA国立野生生物研究センターの機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。
注:以下のプロトコルは、マングース血清中のメチル-イオフェノシン酸を検出するための分析手順について説明する。この方法は、マングース血清中のエチル-イオフェノシン酸の分析から始まった反復プロセスの最終版である。...

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研究のために開発されたLC-MS/MS法は、マングース血清中のme-IPAおよびet-IPAを正確に定量するために、多重反応モニタリングの選択性を利用した。MS/MS検出の選択性はまた、分析前に血清からタンパク質を沈殿させるアセトニトリルのみに依存する簡単なクリーンアッププロトコルを可能にしました。
イオフェノキ酸はACNに溶け込みますが、実質的に水中に不溶性です。ACN?...

狂犬病ウイルス(RABV)は、負の感覚一本鎖リサウイルスであり、カルニヴォラとチロプテラの順序内の多様な野生生物貯水池種の間で循環する。マングースの複数の種はRABVの貯水池であり、小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、西半球のプエルトリコと他のカリブ海の島々で唯一の貯水池です 1,2,3.野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略を通じて達成される。米国(米国)では、この管理活動はUSDA/APHIS/野生生物サービス国家狂犬病管理プログラム(NRMP)4によって調整されています。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。狂犬病ワクチンとマングースの様々な餌の種類に関する研究は、マングースのためのORVプログラムが可能であることを示唆する有望な結果で行われてきました 5,6,7,8.
ORVの影響を監視することは、標的種による餌摂取の推定に依存し、これは通常、RV抗体血清の変化を評価することを含む。しかし、この戦略は、活性野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRVが活性化し、RABV中和抗体(RVNA)のバックグラウンドレベルが貯蔵所種に存在する地域において困難である可能性がある。このような状況では、餌または外部餌マトリックスに含まれるバイオマーカーが有用であり得る。
様々な生物学的マーカーは、アライグマ(プロシオンローター)9、10、ストット(ムステラエルミン)11、12、ヨーロッパのバッジ()を含む多数の種の餌の取り込みを監視するために使用されています。メレスメレス)13、イノシシ(Ssscroofa)14,小さなインドのマングース15と草原の犬 (シノミスルドビシアヌス)16,17, とりわけ.米国では、オペレーショナルORV餌は、餌の取り込み18、19を監視するために餌マトリックスに1%テトラサイクリンバイオマーカーを含むことが多い。しかし、テトラサイクリンの使用に対する欠点は、環境への抗生物質の分布に対する懸念の高まりと、テトラサイクリンの検出は典型的に侵襲的であり、骨を得るために動物の歯の抽出または破壊を必要とする。サンプル20.ローダミンBは、種々の組織におけるマーカーとして評価されており、毛髪及びウィスカー10、21における紫外線(UV)光および蛍光を用いて検出することができる。
イオフェノキ酸(IPA)は、コヨーテ(Canislatrans)22、北極キツネ(ヴァルペス・ラゴプス)23、赤キツネ(ヴァルペス・ヴァルペス)24、アライグマの餌消費量を評価するために使用されている白色の結晶性粉末です。9,25、イノシシ14、赤鹿(セルヴス・エラフス・スコティカス)26、ヨーロッパのバッジ12およびフェレット(M.フロ)27、他のいくつかの哺乳類種の中で。IPAの保持時間は、一部のマーシャル28、29、無秩序26で少なくとも26週間、家畜犬で52週間以上(Canis lupus familiaris)30で2週間未満の種によって異なる。保持時間はまた、用量依存性31であってもよい。イオフェノキ酸は血清アルブミンに強く結合し、血中ヨウ素レベル32を測定することによって歴史的に検出された。この間接的アプローチは、UV検出33でイオフェノキ酸濃度を直接測定する高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)法に取って代わられ、最終的には液体クロマトグラフィーおよび質量分析(LCMS)を用いた。34、35。本研究では、多重反応モニタリング(MRM)を利用してイオフェノク酸の2つの類似体を定量化する、アンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた高感度かつ選択的液体クロマトグラフィーを開発した。私たちの目的は、このLC-MS/MS法を使用して、2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨードベンジル)プロパニン酸(メチル-IPAまたはme-IPA)および2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリリオドベンジル)ブタノイン酸(エチル-IPAまたはOR-IPA)およびAl-IPAのマーキング能力を評価することにした。捕獲マングースに餌。
マングースは、市販のスモークソーセージと魚油で餌付けされたケージトラップで捕獲されました。マングースは、個々の60 cm x 60 cm x 40 cmステンレス鋼ケージに収容され、約50gの市販の乾燥キャットフードの毎日の配給を供給し、市販の鶏もも肉で週2回補充した。水はアドリビタムを利用できました。我々は、IPAの2つの誘導体、エチル-IPAおよびメチル-IPAをプラセボORV餌で捕獲マングースに送達した。すべての餌は、粉末状の鶏卵とゼラチン(材料の表)を含む外部コーティング(以下「餌マトリックス」)を含む28mm x 20mm x 9mm箔ブリスターパックで構成されました。餌は0.7mLの水またはIPA誘導体を含み、約3gの重量を量り、そのうち約2gは外部餌マトリックスであった。
我々は3つの濃度で16捕獲マングースet-IPAを提供しました: 0.14% (2.8 mg et-IPA〜2g餌マトリックス; 3 オス [m],3 メス [f]], 0.4% (0.7 mL ブリスターパック体積で 2.8 mg et-IPA; 3m, 3f), 1.0% (0.7 mL ブリスターパック体積で 7.0 mg エチル-IPA; 2m)、2f)。2.8 mgの全体的な用量は5 mg/kg 27,36の用量率に対応し、プエルトリコで560gの平均マングース重量に基づいています。我々は、研究がいくつかのバイオマーカーに対する味の嫌悪感が一部の種で発生する可能性があることを示唆しているように、最高濃度として1%を選択しました >1%は、いくつかの種37で発生する可能性があります。我々は、凝集が十分に溶媒に溶解するのを防ぎ、餌マトリックスに均等に組み込まれるのを防ぐため、ブリスターパック内の1%の用量のみを提供した。1つの対照群(2m、1f)は、無菌水とIPAなしで満たされた餌を受け取った。私たちは、毎日のメンテナンス配給の間または前に午前中(〜午前8時)にマングースに餌を提供しました。餌の残骸は約24時間後に取り除かれた。治療前に血液サンプルを採取し、治療後1日、治療後8週間まで毎週採取した。我々は、イソムランガスの吸入によってマングースを麻酔し、フェレット38について説明するように頭蓋静脈カバの静脈穿刺によって全血の1.0 mLまで集めた。全血サンプルを遠心分離し、血精膜を凍結物に移し、分析するまで-80°Cで保存した。すべての動物が、繰り返し発生する血液が動物の健康に与える影響を最小限に抑えるために、すべての期間中にサンプリングされたわけではありません。対照動物を0日目にサンプリングし、その後毎週最大8週間の治療後にサンプリングした。
私たちは、0.035%(0.7mg)、0.07%(1.4mg)、0.14%(2.8mg)の3つの濃度でme-IPAを送達し、いずれも餌マトリックスに組み込まれ、治療群当たり2人の男性と2人の女性を含む。2人の男性と2人の女性は、無菌の水で満たされた餌を受け取り、IPAはありません。餌提供時間とマングース麻酔は、上記で説明します。1日目に治療前に血液サンプルを採取し、治療後4週間まで毎週採取した。
異なる治療群の血清IPA濃度の正常性と推定手段について血清濃度データを試験した。我々は、線形混合モデルを使用して、個人間でプールされた平均血清et-IPA濃度を比較した。餌型(マトリックス/ブリスターパック)は実験日に加えて固定効果であったのに対し、動物IDはランダム効果であった。すべての手順は、共通の統計ソフトウェア(材料の表)を使用して実行され、有意性はα= 0.05で評価された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Acetonitrile, Optima grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A996</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XS204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:380px;">C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-&#181;m particle size</td>
			<td style="width:193px;">Waters Corp.</td>
			<td style="width:304px;">186003085</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">ESI Source</td>
			<td style="width:193px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:304px;">G1958-65138</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Ethyl-iophenoxic acid, 97 %</td>
			<td style="width:193px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot MKBP5399V</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A117</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:380px;">LCMS software</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR0709514717</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microanalytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XP6U</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">5415C</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">MS/MS</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">G6470A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">N-Evap</td>
			<td style="width:193px;">Organomation</td>
			<td style="width:304px;">115</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:380px;">Oral Rabies Vaccine Baits</td>
			<td style="width:193px;">IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR100612108RR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Repeat pipettor</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">M4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5190-7024</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:380px;">Sodium chloride, Certified ACS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">S271</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Statistical Software Package</td>
			<td style="width:193px;">SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">Trifluoroacetic acid, 99 %</td>
			<td style="width:193px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:304px;">L06374</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:380px;">UPLC</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">1290 Series</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:193px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:304px;">099A PV6</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.2-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.413</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">0.5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.421</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">14-666-325</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">1250-&#181;L capacity pipette tips</td>
			<td style="width:193px;">GeneMate</td>
			<td style="width:304px;">P-1233-1250</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">1-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.43</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">2-mL amber screw-top autosampler vials</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5182-0716</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.456</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">80-position microcentrifuge tube rack</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">05-541-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:380px;">8-mL amber vials with PTFE-lined caps</td>
			<td style="width:193px;">Wheaton</td>
			<td style="width:304px;">224754</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">70 % (v/v) isopropanol</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A459</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">100-1000 &#181;L air displacement pipette</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">ES-100</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker

小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、プエルトリコの狂犬病ウイルス(RABV)の貯水池であり、毎年報告される動物狂犬病症例の70%以上を占めています。野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略によって達成される。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。口腔狂犬病ワクチンやマングースの各種餌型の研究が有望な結果で行われました。ORVの成功のモニタリングは、標的種による餌摂取の推定に依存しており、これは通常、RABV中和抗体(RVNA)後のワクチン接種後の変化を評価することを含む。この戦略は、アクティブな野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRABVが活性化し、RVNAのバックグラウンドレベルが貯水池種に存在する地域では解釈が困難な場合があります。このような状況では、ワクチンまたは餌マトリックスに組み込まれたバイオマーカーが有用であり得る。エチル-イオフェノク酸(et-IPA)を含む16個の捕虜マングースプラセボORV餌を、餌の中に0.4%と1%、外餌マトリックスで0.14%の濃度で提供しました。また、メチル-イオフェノク酸(me-IPA)を含む12個の捕虜マングースORV餌を、外部餌マトリックスに0.035%、0.07%、0.14%の濃度で提供しました。餌の提供の前に血清サンプルを収集し、その後、最大8週間のポストオファリングのために毎週。セラからイオフェノキ酸をアセトニトリルに抽出し、液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いて定量した。液体クロマトグラフィー質量分析により、et-IPAまたはme-IPAのセラを分析した。et-IPAとme-IPAに対して、少なくとも8週間と4週間は適切なマーキング能力を見出した。いずれのIPA誘導体も、マングースにおけるORV餌取り込みのフィールド評価に適している可能性がある。マングースセラのマーカーの寿命が長いため、連続した評価中に同じIPA誘導体を使用して結果を混乱させないように注意する必要があります。

me-IPA分析からの代表的なイオンクロマトグラムを図1に示す。対照マングース血清(図1A)は、et-IPA(サロゲートアナリテ)の保持時間および示された保持時間におけるme-IPAの不在を示す。品質管理サンプル(図1B)は、et-IPAからのme-IPAのベースライン分離と、me-IPAの定量子および修飾子遷移を示しています。<s...

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

バイオマーカーとしてエチルまたはメチルイオフェノシン酸を用いた捕虜マングースプラセボ経口狂犬病ワクチンを提供し、タンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた新規液体クロマトグラフィーを用いた餌取り込みを検証した。

小さなインドのマングースにおけるイオフェノキ酸類似体の分析 (ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)経口狂犬病ワクチン接種生物学的マーカーとしての使用のためのセラ

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

マングース血清中のイオフェノキ酸を検出し定量する手順を概説した。結果は、イオフェノキシン酸が種のベータ摂取量を確認するための生物学的マーカーとして使用され得ることを示唆している。この方法の主な利点は、タンパク質沈殿技術を簡単に行うため、10億レベルあたりの部分でイオフェノキシン酸アナログの定量を可能にすることです。移動相Aの場合は、1ミリリットルのギ酸と1リットルの超純水を組み合わせます。移動相Bの場合は、1ミリリットルのギ酸と1リットルのアセトニトリルを組み合わせます。希釈剤の場合は、トリフルオロ酢酸1ミリリットルとアセトニトリル200ミリリットルを組み合わせます。次に、マイクロバランスでメチル-IPAの約10ミリグラムの重量を量り、プラスマイナス0001ミリグラムに質量を記録します。メチル-IPAを10ミリリットル級A体積フラスコに定量的に移し、4〜5ミリリットルのアセトニトリルを使用する。すべての固体を溶解し、アセトニトリルでボリュームに持って来るために1分間ソニッケート。各ストックの約8ミリリットルをPTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルに移し、サンプルを室温で保管します。次に、残りの在庫を有害廃棄物に移します。25Xストックの7つのメチル-IPAストックは、1ミリリットル当たり約200マイクログラムでメチルIPAとアセトニトリルの在庫を準備します。ストックの1ミリリットルを5ミリリットルのフラスコに移し、アセトニトリルで分ける。その後、PTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルにストックを移し、室温で保管します。繰り返しピペットを使用して、テキストプロトコルに記載されている6つの追加の25XメチルIPAストックを、PTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色ガラスバイアルで準備し、室温で保管します。25X代理ストックの場合、濃縮エチルIPAストックの0.1ミリリットルを10ミリリットル級Aボリュームフラスコに100マイクロリットルガラスシリンジを使用して移し、アセトニトリルで体積に希釈します。代理ストックの約8ミリリットルをPTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルに移し、室温で保管します。残りの在庫を有害廃棄物に転送します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、メチル-IPAとエチルIPAの両方を含む4X株を10ミリリットルスクリュートップガラスオートサンプラーバイアルで調製する。例えば、ストック4X7を準備するには、0.5ミリリットル容量のチップを有する繰り返しピペットを使用して、25Xストック7個のメチルIPAストックを2ミリリットルバイアルに0.2ミリリットル添加します。0.5ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用して25X代理エチル-IPAストックの0.2ミリリットルを追加します。1ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用してアセトニトリルの0.85ミリリットルを追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5回反転して混ぜます。これに続いて、テキストプロトコルに記載されているように、2ミリリットルスクリュートップオートサンプラーバイアルで標準曲線を準備します。例えば、標準の7を準備するには、0.5ミリリットル容量のチップを持つ繰り返しピペットを使用して、2ミリリットルバイアルに4X7ストックの0.2ミリリットルを追加します。1ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用して、超純度イオン化水の0.6ミリリットルを追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5回反転して混ぜます。各サンプルに対して、200~300ミリグラムの塩化ナトリウムを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管を準備し、80位置のプラスチックラックにチューブを配置します。各サンプルに対して、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをAとラベル付けし、2番目のマイクロ遠心分離管をB.80位置のプラスチックラックにチューブを配置します。クラス2のバイオセーフティキャビネットに血清抽出に必要な材料と機器を次に配置します:マイクロ遠心分離管、ボルテックスミキサー、0.5ミリリットルと5ミリリットル容量チップを備えた繰り返しピペット、1000マイクロリットル先端を備えた100〜1000マイクロリットルの空気変位ピペット、約100ミリリットルの希釈剤と超純度の容器を含む容器、次に、凍結した貯蔵から血清サンプルを取り除き、バイオセーフティキャビネット内の室温まで温めます。渦はサンプリング前に各血清サンプルを混合する。0.5ミリリットルの容量の先端の反復ピペットを使用して、05ミリリットルのマングース血清をチューブAに分配し、25Xサロゲートストックの05ミリリットルを加える。その後、5ミリリットルの容量の先端を持つ繰り返しピペットを使用してチューブAに希釈剤の0.95ミリリットルを加えます。チューブをしっかりとキャップし、渦ミックスを10~15秒間キャップします。次に、コントロールマングース血清をチューブAに加え、0.5ミリリットルの容量チップを備えた繰り返しピペットを使用してme-IPAで4QCサンプルをそれぞれFortifyします。QC サンプルに 25X サロゲート ストックを追加します。次に、QC サンプルに希釈剤を加えます。チューブと渦ミックスをキャップします。計量済みの塩化ナトリウムをチューブAに分配し、渦ミックスを3回8~12秒間混合します。次に、70%イソプロパノールを使用して、チューブAを含むバイアルラックの外側の表面を拭き取ります。バイオセーフティキャビネットからサンプルを取り出した後、遠心管Aを1200倍Gで1分間、水相とアセトニトリル相を分離した。上部アセトニトリル相のピペット0.8ミリリットルをチューブBに、100〜1000マイクロリットルの空気変位ピペットを用いた。残りの溶液をチューブA内で有害廃棄物に移し、空のチューブを生物危険廃棄物容器に捨てます。さて、45°Cの水浴で窒素ガスの穏やかな流れでチューブBからアセトニトリルとトリフルオロ酢を取り除きます。繰り返しピペットと渦ミックスを4〜5秒間使用して、チューブBにアセトニトリルの0.25ミリリットルを加えます。次いで、1200倍Gで1200倍のGで遠心分離機を2〜4秒間、チューブの底に液体を集めた。遠心分離後、5ミリリットルの容量チップと渦ミックスを5〜5秒間繰り返しピペットを使用して、チューブBに0.75ミリリットルの超純脱イオン水を加えます。遠心分離機を1200倍Gで1分間、試料を明らかにする。次に、1000マイクロリットルの空気変位ピペットを使用して、上清の0.75ミリリットルをオートサンプラーバイアルに移し、バイオハザード廃棄物容器内のピペットチップを廃棄します。LC-MS/MS分析のために、各自動サンプラーバイアルを安全にキャップします。残りの溶液をチューブB内で有害廃棄物に移し、空のチューブを生物危険廃棄物容器に捨てます。テキスト プロトコルで説明されているすべてのパラメータを使用して、LC-MS/MS を設定します。LC-MS/MSの電源を入れ、列を70°Cに達してから、流量を毎分0.8ミリリットルに設定します。データ収集ソフトウェアでシーケンスを設定し、品質管理サンプルと未知のサンプルからなる各バッチの前後に標準曲線を挿入します。すべての標準とサンプルを注入し、テキストプロトコルに記載されているパラメータを使用してMRイオンクロマトグラムを取得します。シーケンスが完了したら、LC-MS/MSをオフにし、すべてのオートサンプラーバイアルを有害廃棄物に廃棄します。対照マングース血清のイオンクロマトグラムは、エチルIPAの保持時間および示された保持時間におけるメチルIPAの欠如を示す。品質管理サンプルのイオンクロマトグラムは、メチル-IPAとエチル-IPAのベースライン分離、ならびにメチルIPAの量化および修飾子遷移を示しています。本研究の代表的サンプルのイオンクロマトグラムは、メチル-IPAのマイクロリットル当たり33.5マイクログラムの観察された血清濃度を示す。メチル-IPAで強化されたマングース血清の精度と精度を示します。回収率は96.9%から109%の範囲で、3つの要塞レベルでの相対偏差の割合はそれぞれ3.4%1.7%と2.3%であった。エチル-IPAで強化されたマングース血清の精度と精度の結果をここに示します。回収率は89.5~115%の範囲で、5つの要塞レベルでの相対標準偏差の割合はそれぞれ4.3%1.5%2.3%5.6%と1.1%であった。すべてのマングースは、エチルIPAとメチルIPA餌を提供し、24時間の時間制約内で餌の少なくとも25%を消費し、それぞれセラにエチルIPAとメチルIPAの定量可能なレベルを有していた。この方法の潜在的な有用性は、プロピルおよびブチルイオフェノキシン酸などの他のイオフェノキシン酸類似体のデータを収集するようにLC-MSを構成することによって増加することができる。我々は、予防接種の実施に関する諮問委員会の最新の勧告、または彼らの機関バイオセーフティ委員会に相談して、暴露前狂犬病ワクチン接種が必要かどうかのガイダンスを求めることを奨励した。このプロトコルのセクション 2.3 から 2.6 は、希釈されていない血清を使用して作業を行うクラス 2 のバイオセーフティ キャビネットで実行する必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

の寄生蜂の紹介<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;と抗寄生虫免疫応答

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...