Name: analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker at JoVE.co

이 연구는 미국 농무부, 동물 및 식물 건강 검사 서비스, 야생 동물 서비스, 국립 광견병 관리 프로그램 및 IDT 바이오로지카(독일 데사우-로슬라우)의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

모든 절차는 승인 된 연구 프로토콜 QA-2597에 따라 USDA 국립 야생 동물 연구 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 몽구스 혈청에서 메틸-이오페노산검출분석 절차를 기술한다. 이 방법은 몽구스 혈청에서 에틸 이오페노산의 분석으로 시작된 반복 과정의 최종 버전입니다. 에틸-이오페노산의 초기 평가 동안 사소한 변형이 이 방?...

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연구를 위해 개발된 LC-MS/MS 방법은 몽구스 혈청에서 me-IPA 및 et-IPA를 정확하게 정량화하기 위해 다중 반응 모니터링의 선택성을 활용하였다. MS/MS 검출의 선택성은 또한 분석 전에 혈청에서 단백질을 침전시키기 위하여 아세토니트릴에 전적으로 의존하는 간단한 정리 프로토콜을 허용했습니다.
이오페노산은 ACN에서 용해되지만 물에 실질적으로 용해되지 않습니다. ACN 추출로?...

광견병 바이러스(RABV)는 부정적 감각의 단일 좌초 된 lyssavirus이며, 카니보라와 치옵테라 의 주문 내에서 다양한 야생 동물 저수지 종 들 사이에서 순환한다. 몽구스의 여러 종은 RABV의 저수지이며, 작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코와 서반구 1,2,3의 다른 카리브 해 제도에서 유일한 저수지입니다 . 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략을 통해 수행됩니다. 미국(미국)에서는 이 관리 활동이 USDA/APHIS/야생 동물 서비스 국립 광견병 관리프로그램(NRMP) 4에 의해 조정됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 광견병 백신및 몽구스를 위한 다양한 미끼 종류에 대한 연구는 몽구스를 위한 ORV 프로그램이가능하다는 것을 시사하는 유망한 결과로 실시되어 5,6,7,8.
ORV의 충격을 감시하는 것은 일반적으로 RV 항체 혈청증에 있는 변경을 평가하는 관련시키는 표적 종에 의하여 미끼 옥천을 추정에 의존합니다. 그러나, 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RV가 RABV 중화 항체 (RVNA)의 enzootic 및 배경 수준이 저수지 종에서 존재하는 지역에서 도전적일 수 있습니다. 이러한 상황에서, 미끼 또는 외부 미끼 매트릭스에 포함된 바이오마커가 유용할 수 있다.
다양한 생물학적 마커는 너구리(프로시온 로터)9,10,stoats (무스텔라에르민)11,12,유럽 오소리 등 수많은 종에서 미끼 섭취를 모니터링하는 데 사용되어 왔다. 멜레스 멜레스) 13,멧돼지(수스 스크로파)14,작은 인도 몽구스15 및 대초원 개 (Cynomysludovicianus)16,17,다른 사람의 사이에서. 미국에서, 수술 ORV 미끼는 종종 미끼 매트릭스에서 1% 테트라사이클린 바이오마커를 포함하여 미끼 흡기18,19를모니터링한다. 그러나, 테트라사이클린의 사용에 대한 단점은 환경에 항생제의 분포에 대한 우려가 증가하고 테트라 사이클린의 검출이 일반적으로 침략적이라는 것을 포함, 뼈를 얻기 위해 동물의 치아 추출 또는 파괴를 요구 샘플20. 로다민 B는 다양한 조직에서 마커로 평가되어 왔으며 모발 및 수염10,21에서자외선(UV) 빛및 형광을 이용하여 검출될 수 있다.
이오페노산(IPA)은 코요테(Canis latrans)에서 미끼 소비를 평가하는 데사용되어 온백색, 결정성 분말로, 북극여우(Vulpeslagopus)23,붉은 여우(Vulpesvulpes)24,너구리 9개 , 25,멧돼지14,붉은 사슴 (세르부스elaphus scoticus)26,유럽 오소리12 및 페렛 (M.furo)27,다른 여러 포유류 종 중. IPA의 체류시간은 종에 따라 2주 미만의 28,29,26주 이상, 26주 이상 국내견(Canislupusfamiliaris)에서 52주 이상이다. 보존 시간은 또한 용량 의존적 일 수있다31. 이오페녹산은 혈청 알부민에 강하게 결합하고 역사적으로 혈중 요오드 수치32를측정하여 검출되었다. 이러한 간접접근법은 UV 검출33을통해 이오페노산 농도를 직접 측정하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 대체되었고, 결국 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(LCMS)으로 대체되었습니다. 34,35. 이 연구를 위해, 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 이용한 매우 민감하고 선택적인 액체 크로마토그래피가 개발되어 다중 반응 모니터링(MRM)을 활용하여 이오페노산의 두 가지 유사체를 정량화합니다. 우리의 목표는 2-(3-하이드록시-2,4,6-triiodobenzyl) 프로파노산(메틸-IPA 또는 me-IPA) 및 2-(3-하이드록시-2,4,6-트리오도벤실)부타노산(에틸-IPA 또는 IPA 에서 전달될 때)의 마킹 능력을 평가하기 위해 이 LC-MS/MS 방법을 사용하는 것이었습니다. 포로 몽구스에게 미끼를.
몽구스는 시판되는 훈제 소시지와 생선 기름으로 미끼를 찍은 케이지 트랩에서 라이브 포획되었습니다. 몽구스는 개별 60 cm x 60cm x 40cm 스테인레스 스틸 케이지에 보관하고 시판되는 닭 허벅지로 일주일에 두 번 보충된 상업용 건식 고양이 사료를 매일 50g씩 먹였습니다. 물은 사용할 수 있는 광고 libitum. 우리는 위약 ORV 미끼에 포로 몽구스에 IPA, 에틸-IPA와 메틸-IPA의 두 가지 유도체를 전달했다. 모든 미끼는 분말 닭 계란및 젤라틴(재료표)을 함유하는 외부 코팅(이하 "미끼 매트릭스")을 가진 28 mmx 20 mm x 9 mm 호일 블리스터 팩으로 구성되었다. 미끼는 0.7 mL의 물 또는 IPA 유도체를 포함하고 약 3 g의 무게를 가했으며, 그 중 ~2 g은 외부 미끼 매트릭스였다.
우리는 3 개의 농도에서 16 포로 몽구스 et-IPA를 제공: 0.14% (2.8 mg et-IPA ~ 2 g 미끼 매트릭스; 3 남성 [m], 3 여성 [f]), 0.4 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 2.8 mg et-IPA, 3m, 3f), 및 1.0 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 7.0 mg 에틸-IPA; 2m , 2f). 의 전반적인 복용량 2.8 mg의 복용량 속도에 해당 5 mg/kg27,36 푸에르토리코에서 560 g의 평균 몽구스 무게에 따라. 우리는 연구가 일부 바이오 마커에 대한 맛 혐오가 일부 종37에서 농도 >1%에서 발생할 수 있음을 시사하는 가장 높은 농도로 1 %를 선택했습니다. 우리는 블리스터 팩에서 1% 용량만 제공했는데, 응집은 용매에서 용해되는 용질이 미끼 매트릭스에 균등하게 통합될 만큼 충분히 용해되는 것을 방지하였다. 1개의 대조군 (2m, 1f)은 멸균수와 IPA가 없는 미끼를 받았다. 우리는 아침 (~8 시)에 매일 유지 보수 배급을 먹이기 전에 몽구스에게 미끼를 제공했습니다. 미끼는 약 24시간 후에 제거되었다. 우리는 치료 전에 혈액 샘플을 수집, 하루 후 치료 후 다음 매주 최대 8 주 후 치료. 우리는 이소플루란 가스를 흡입하여 몽구스를 마취시키고 페렛38에대해 설명된 바와 같이 두개골 정맥의 정맥에 의해 전혈의 1.0 mL까지 수집했다. 우리는 전혈 샘플을 원심 분리하고, 혈청을 극저온으로 옮기고 분석할 때까지 -80°C에서 저장했습니다. 모든 동물은 동물의 건강에 반복 혈액 무승부의 영향을 최소화하기 위해 모든 기간 동안 샘플링되지 않았습니다. 대조군 동물을 0일째에 샘플링한 다음, 매주 최대 8주 동안 치료 후 샘플링하였다.
우리는 3 개의 농도에서 me-IPA를 전달: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) 그리고 0.14% (2.8 mg), 모든 미끼 매트릭스에 통합, 와 함께 2 남성과 2 치료 그룹 당 여성. 두 남성과 두 여성은 멸균 물과 IPA로 가득 미끼를 받았다. 미끼 제공 시간과 몽구스 마취는 위에서 설명합니다. 우리는 1 일째에 치료 전에 혈액 샘플을 수집한 다음 매주 최대 4 주까지 치료 후.
우리는 정상성에 대한 혈청 농도 데이터를 테스트하고 다른 치료 그룹의 혈청 IPA 농도에 대한 추정 수단. 우리는 선형 혼합 모델을 사용하여 개인에 걸쳐 풀린 평균 혈청 et-IPA 농도를 비교했습니다. 미끼 유형(매트릭스/블리스터 팩)은 실험일 이외에 고정된 효과가었으며, 동물 ID는 무작위 효과였습니다. 모든 프로시저는 공통 통계소프트웨어(자료표)를사용하여 실행되었고 유의성은 α =0.05로 평가하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Acetonitrile, Optima grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A996</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XS204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:380px;">C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-&#181;m particle size</td>
			<td style="width:193px;">Waters Corp.</td>
			<td style="width:304px;">186003085</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">ESI Source</td>
			<td style="width:193px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:304px;">G1958-65138</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Ethyl-iophenoxic acid, 97 %</td>
			<td style="width:193px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot MKBP5399V</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A117</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:380px;">LCMS software</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR0709514717</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microanalytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XP6U</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">5415C</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">MS/MS</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">G6470A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">N-Evap</td>
			<td style="width:193px;">Organomation</td>
			<td style="width:304px;">115</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:380px;">Oral Rabies Vaccine Baits</td>
			<td style="width:193px;">IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR100612108RR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Repeat pipettor</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">M4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5190-7024</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:380px;">Sodium chloride, Certified ACS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">S271</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Statistical Software Package</td>
			<td style="width:193px;">SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">Trifluoroacetic acid, 99 %</td>
			<td style="width:193px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:304px;">L06374</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:380px;">UPLC</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">1290 Series</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:193px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:304px;">099A PV6</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.2-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.413</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">0.5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.421</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">14-666-325</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">1250-&#181;L capacity pipette tips</td>
			<td style="width:193px;">GeneMate</td>
			<td style="width:304px;">P-1233-1250</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">1-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.43</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">2-mL amber screw-top autosampler vials</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5182-0716</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.456</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">80-position microcentrifuge tube rack</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">05-541-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:380px;">8-mL amber vials with PTFE-lined caps</td>
			<td style="width:193px;">Wheaton</td>
			<td style="width:304px;">224754</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">70 % (v/v) isopropanol</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A459</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">100-1000 &#181;L air displacement pipette</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">ES-100</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker

작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코에서 광견병 바이러스 (RABV)의 저수지이며 매년보고되는 동물 광견병 사례의 70 % 이상을 포함합니다. 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략에 의해 수행됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 구강 광견병 백신 및 몽구스를 위한 각종 미끼 모형에 대한 연구는 유망한 결과로 실시되었습니다. ORV의 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 RABV 중화 항체 (RVNA) 포스트 예방 접종의 변화를 평가하는 것을 포함하는 표적 종에 의하여 미끼 섭취를 추정에 의존합니다. 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RABV가 Enzootic 및 RVNA의 배경 수준이 저수지 종에 존재하는 지역에서 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 백신 또는 미끼 매트릭스와 통합된 바이오마커가 유용할 수 있다. 우리는 미끼 내부0.4 %와 1 %의 농도에서 에틸 이오페노산 (et-IPA)을 함유 한 16 개의 포로 몽구스 위약 ORV 미끼를 외부 미끼 매트릭스에서 제공했습니다. 우리는 또한 외부 미끼 매트릭스에서 0.035 %, 0.07 %, 0.14 %의 농도로 메틸 - 이오페노산 (me-IPA)을 함유 한 12 개의 포로 몽구스 ORV 미끼를 제공했습니다. 우리는 미끼 제공 하기 전에 혈 청 샘플을 수집 하 고 최대 8 주 포스트 제공에 대 한 다음 매주. 우리는 혈청에서 아세토니트릴로 이오페노산산을 추출하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 et-IPA 또는 me-IPA에 대한 세라를 분석했습니다. 우리는 et-me-IPA에 대해 적어도 8 주와 4 주 동안 적절한 마킹 능력을 발견했습니다. 두 IPA 유도체 모두 몽구스에서 ORV 미끼 섭취량의 현장 평가에 적합할 수 있다. 몽구스 세라에서 마커의 수명으로 인해 연속 평가 중에 동일한 IPA 유도체를 사용하여 결과를 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.

me-IPA 분석에서 대표적인 이온 크로마토그램은 그림1에 제시되어 있다. 대조군 몽구스 혈청(도1A)은지시된 보존 시간에 et-IPA(대리 analyte)의 보존 시간 및 me-IPA의 부재를 도시한다. 품질 관리 샘플(그림1B)은me-IPA에 대한 정량자 및 한정자 전환뿐만 아니라 et-IPA로부터 의 me-IPA의 기준선 분리를 도시한다. <strong...

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.

작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

우리는 몽구스 혈청에서 이오페녹스산을 검출하고 정량화하는 절차를 설명했습니다. 결과는 iophenoxx산이 종에 있는 beta uptake를 확인하기 위하여 생물학 마커로 이용될 수 있다는 것을 건의합니다. 이 방법의 주요 장점은 단백질 강수 기술을 수행하기 위해 간단한 을 사용하여 10 억 수준 당 부품에서 iophenoxic 산 유사체의 정량화를 허용한다는 것입니다.이동 상 A의 경우 포믹산 1밀리리터와 1리터의 초순수수를 결합합니다. 이동 상 B의 경우 포믹산 1밀리리터와 아세토닐릴 1리터를 결합합니다. 희석제의 경우, 아세토나이트 200밀리리터와 트리플루오로아세트산 1밀리리터를 결합합니다.다음으로, 마이크로 밸런스에 메틸 IPA의 약 10 밀리그램의 무게, 플러스 또는 마이너스 0001 밀리그램질량을 기록. 메틸-IPA를 10 밀리리터 급 A 체피플라스크로 정량적으로 전송하여 아세토닐트리어의 4~5밀리리터를 사용한다. 모든 고체를 용해한 다음 아세토나이트로 볼륨을 가져오기 위해 1분 동안 초음파 처리합니다.각 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 샘플을 실온에 보관합니다. 그런 다음 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기습니다. 25X 재고의 경우 7 개의 메틸 IPA 재고는 밀리리터 당 약 200 마이크로 그램에서 메틸 IPA 및 아세토나이트 의 주식을 준비합니다.주식의 1 밀리리터를 5 밀리리터 플라스크로 옮기고 아세토닐로 부피로 희석합니다. 그런 다음, PTFE 줄 지어 모자와 8 밀리리터 호박 유리 유리 바이알에 주식을 전송하고 실온에서 저장합니다. 반복 피펫을 사용하여 PTFE 라이닝 캡이 있는 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 텍스트 프로토콜에 설명된 6개의 추가 25X 메틸-IPA 주식을 준비하고 실온에 보관합니다.25X 대리 주식의 경우, 농축 된 에틸-IPA 주식의 0.1 밀리리터를 10 밀리리터 클래스 A 볼륨 플라스크로 100 마이크로 리터 유리 주사기를 사용한 다음 아세토나이트로 부피로 희석합니다. 대리 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 실온에서 보관하십시오. 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메틸-IPA와 에틸-IPA를 모두 포함하는 4배 의 주식을 10밀리리터 스크류 톱 유리 자동 샘플러 바이알로 준비한다. 예를 들어, 재고 4X7을 준비하려면 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 2밀리리터 바이알에 25X 스톡 7개의 메틸-IPA 스톡의 0.2 밀리리터를 추가합니다. 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 25X 대리 에틸-IPA 스톡의 0.2 밀리리터를 추가합니다.1 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 0.85 밀리리터의 아세토나이트를 추가합니다. 유리병을 단단히 캡하고 혼합하려면 5번 반전합니다. 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2밀리리터 나사 상단 자동 샘플러 바이알로 표준 곡선을 준비합니다.예를 들어 표준 7을 준비하려면 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 4X7 스톡의 0.2 밀리리터를 2밀리리터 바이알에 추가합니다. 1 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 0.6 밀리리터의 초순도 이온화 물을 추가합니다. 바이알을 단단히 캡하고 혼합하려면 5번 반전합니다.각 샘플에 대해 200~300밀리그램의 염화나트륨을 함유한 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 80개의 플라스틱 랙에 튜브를 정렬합니다. 각 샘플에 대해 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 A로, 두 번째 마이크로 원심분리기 튜브를 B.는 80개의 위치 플라스틱 랙에 튜브를 정렬합니다. 혈청 추출에 필요한 다음 재료와 장비를 2개의 생물안전 캐비닛에 배치합니다: 마이크로 원심분리기 튜브, 소용돌이 믹서, 0.5 밀리리터 및 5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫, 1000 마이크로리터 팁이 있는 100~1000 마이크로리터 공기 변위 파이펫, 희석제 및 초순도 이온화 물 각각 약 100밀리리터가 있는 용기, 생체 위험 폐기물 용기.다음으로, 냉동 보관에서 혈청 샘플을 제거하고 생물 안전 캐비닛의 실온으로 따뜻하게 합니다. 소용돌이는 샘플링 전에 각 혈청 샘플을 혼합합니다. 0.5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 05 밀리리터의 몽구스 세럼을 튜브 A에 분배하고 25X 대리 스톡의 05 밀리리터를 추가합니다.그런 다음 5 밀리리터 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 튜브 A에 0.95 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 단단히 캡하고 10~15초 동안 소용돌이 믹스를 섞습니다. 다음으로, 관 A.Fortify 0.5 밀리리터 용량 팁반복 피펫을 사용하여 나-IPA와 함께 4QC 샘플각각을 포티피튜브에 컨트롤 몽구스 세럼을 추가합니다.QC 샘플에 25X 대리 스톡을 추가합니다. 그런 다음 QC 샘플에 희석제를 추가합니다. 튜브와 소용돌이 믹스를 캡.미리 계량된 염화나트륨을 튜브 A에 분배하고 소용돌이 믹스를 8-12초 동안 세 번 분배합니다. 그런 다음 70%의 이소프로판놀을 사용하여 튜브 A를 포함하는 바이알 랙의 외부 표면을 닦아냅니다. 생물 안전 캐비닛에서 샘플을 제거 한 후, 원심 분리기 튜브 A는 1 분 동안 1200 배 G에서 수성 및 아세토나이트 상을 분리합니다.파이펫 0.8 마이크로리터 공기 변위 파이펫을 사용하여 튜브 B에 상부 아세토닐트리어 위상의 파이펫 0.8 밀리리터. 튜브 A의 나머지 솔루션을 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 생물 유해 폐기물 용기에 폐기합니다. 이제 45도의 수조에서 질소 가스의 부드러운 흐름으로 튜브 B에서 아세토나이트와 삼불화를 제거하십시오.반복 피펫과 소용돌이 믹스를 사용하여 튜브 B에 0.25 밀리리터를 추가합니다. 이어서, 원심분리기는 튜브 의 바닥에 액체를 수집하기 위해 2~4초 동안 1200배 G에서 분리된다. 원심 분리에 따라, 4~5초 동안 5밀리리터 용량 팁과 소용돌이 믹스가 있는 반복 피펫터를 사용하여 튜브 B에 0.75 밀리리터의 초순수 분해물을 첨가합니다.원심분리기는 1분 동안 1200배 G의 원심분리기를 사용하여 샘플을 명확히 합니다. 이어서, 1000마이크로리터 공기 변위 파이펫을 이용하여 초산자의 0.75 밀리리터를 자동 시료 바이알로 옮기고 생체 위험 폐기물 용기의 파이펫 팁을 폐기한다. LC-MS/MS 분석을 위해 각 자동 샘플러 바이알을 안전하게 캡합니다.튜브 B의 나머지 용액을 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 생물 유해 폐기물 용기에 버려두십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 모든 매개 변수로 LC-MS/MS를 구성합니다. LC-MS/MS의 전원을 공급하고 컬럼이 섭씨 70도에 도달한 후 분당 0.8 밀리리터로 유속을 설정할 수 있습니다.데이터 수집 소프트웨어에 서열을 설정하여 품질 관리 샘플 및 알 수 없는 샘플로 구성된 각 배치 전후의 표준 곡선을 주입합니다. 모든 표준 및 샘플을 주입하고 텍스트 프로토콜에 나열된 매개 변수를 사용하여 MR 이온 크로마토그램을 획득합니다. 시퀀스 완료 후 LC-MS/MS를 끄고 유해 폐기물에 모든 자동 샘플러 바이알을 폐기하십시오.대조군 몽구스 세럼의 이온 크로마토그램은 에틸-IPA의 보존 시간과 표시된 보존 시간에 메틸-IPA의 부재를 보여줍니다. 품질 관리 샘플의 이온 크로마토그램은 메틸-IPA로부터 메틸-IPA의 기준분리뿐만 아니라 메틸-IPA에 대한 정량화 및 한정자 전환을 보여줍니다. 연구에서 대표적인 샘플의 이온 크로마토그램은 메틸-IPA의 마이크로리터 당 33.5 마이크로그램의 관찰된 혈청 농도를 나타낸다.메틸-IPA로 강화된 제어 몽구스 세럼의 정확도와 정밀도 결과는 여기에 나와 있습니다. 회복%는 96.9~109%로 3대 강화 수준에서 상대편차가 각각 3.4%1.7%, 2.3%였다. 에틸-IPA로 강화된 제어 몽구스 세럼의 정확성과 정밀도 결과는 여기에 나와 있습니다.회복%는 89.5~115%로 5대 강화 수준에서 상대기준 편차가 각각 4.3%1.5%2.3%와 1.1%였다. 모든 몽구스는 에틸-IPA와 메틸-IPA 미끼를 제공 24 시간 제약 내에서 미끼의 적어도 25 %를 소비하고 각각 자신의 세라에 에틸 IPA와 메틸 IPA의 정량화 수준을했다. 이 방법의 잠재적 인 유용성은 프로필 및 부틸 iophenoxic 산과 같은 다른 iophenoxic 산 유사체에 대한 데이터를 수집하기 위해 LC-MS를 구성하여 증가 할 수있다.우리는 예방 접종 관행에 대한 자문위원회의 가장 최근의 권고, 또는 사전 노출 광견병 예방 접종이 필요한지 여부에 대한 지침을 위해 기관 생물 안전위원회의 최신 권고사항을 자문할 것을 권장했습니다. 희석되지 않은 혈청과 관련된 이 프로토콜의 섹션 2.3~2.6항은 2급 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 한다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

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의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

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옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

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사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

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숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

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변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

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체외 방법에서 대상 바인딩 및 치료 항체 사이 CDC 유도 비교 : 응용 프로그램 생물학적 동등성 분석에

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...