Name: analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker at JoVE.co

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa de pesquisa intramural do departamento de agricultura dos EUA, serviço de inspeção de saúde animal e vegetal, serviços de vida selvagem, programa nacional de gestão da raiva e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemanha).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do USDA National Wildlife Research Center o protocolo de pesquisa aprovado QA-2597.
Nota: o seguinte protocolo descreve o procedimento de análise para detectar o ácido metil-iofenoxico no soro de mangusto. Este método é a versão final de um processo iterativo que começou com a análise do ácido etil-iofenoxico no soro do Mongoose. Durante a avaliação inicial do ácido etil-iofenoxico foram f...

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O método de LC-MS/MS desenvolvido para os estudos utilizou a seletividade da monitoração múltipla da reação para quantificar com precisão o me-IPA e o et-IPA no soro do Mongoose. A seletividade da detecção de MS/MS também permitiu um protocolo simples de limpeza que dependesse unicamente de acetonitrila para precipitar proteínas do soro antes da análise.
Os ácidos iofenóxicos são solúveis em ACN, mas são praticamente insolúveis em água. Para excluir a água da extração da ...

O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos (EUA), esta atividade de gestão é coordenada pelo USDA/APHIS/Wildlife Services programa nacional de gestão da raiva (NRMP)4. Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. Pesquisa em vacinas contra a raiva e vários tipos de isca para mangustos tem sido conduzido com resultados promissores sugerindo um programa ORV para mangustos é possível5,6,7,8.
O monitoramento do impacto da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração na soroprevalência de anticorpos RV. No entanto, essa estratégia pode ser desafiadora em áreas com programas ativos de ORV de vida selvagem ou em áreas onde o VD é enzoótico e níveis de fundo de anticorpos neutralizantes RABV (RVNA) estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incluído na isca ou a matriz de isca externa pode ser útil.
Vários marcadores biológicostêm sido utilizados para monitorizar a captação de iscas em numerosas espécies, incluindo guaxinins (Procyon lotor)9,10, Estats (Mustela arminho)11,12, texugos europeus ( Meles) 13, javalis selvagens (Sus scrofa)14, pequenos mangustos indianos15 e cães da pradaria (cynomysludovicianus)16,17, entre outros. Nos EUA, as iscas operacionais de ORV freqüentemente incluem um biomarcador de tetraciclina a 1% na matriz de isca para monitorar a captação de iscas18,19. Entretanto, os inconvenientes ao uso do tetraciclina incluem uma preocupação crescente sobre a distribuição dos antibióticos no ambiente e que a deteção do tetraciclina é tipicamente invasora, exigindo a extração ou a destruição do dente do animal para obter o osso amostras20. A rhodamina B foi avaliada como um marcador em uma variedade de tecidos e pode ser detectada usando luz ultravioleta (UV) e fluorescência no cabelo e bigodes10,21.
O ácido iofenoxico (IPA) é um pó branco, cristalino que tem sido utilizado para avaliar o consumo de iscas em coiotes (Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, Red Fox (VulpesVulpes)24, guaxinins 9 anos de , 25, javali14, cervos vermelhos (Cervus elaphus scoticus)26, Badgers europeus12 e furões (M. furo)27, entre várias outras espécies de mamíferos. Os tempos de retenção do IPA variam por espécies de menos de duas semanas em alguns marsupiais28,29, para pelo menos 26 semanas em ungulados26 e mais de 52 semanas em cães domésticos (Canis lupus familiaris)30. Os tempos de retenção também podem ser dependentes da dose31. O ácido iofenoxico liga-se fortemente à albumina sérica e foi historicamente detectado pela medição dos níveis de iodo no sangue32. Esta aproximação indireta foi suplantada por métodos da cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) para medir diretamente concentrações do ácido iophenoxic com deteção UV33, e eventualmente com cromatografia líquida e espectrometria maciça (LCMS) 34,35. Para este estudo, foi desenvolvida uma cromatografia líquida altamente sensível e seletiva com método de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) que utiliza o monitoramento de múltiplas reações (MRM) para quantificar dois análogos do ácido iofenoxico. Nosso objetivo foi usar este método LC-MS/MS para avaliar a capacidade de marcação de 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido propanoico (metil-IPA ou me-IPA) e 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido butanóico (etil-IPA ou et-IPA) e quando entregues em um ORV isca para Mongooses em cativeiro.
Os Mongooses foram capturados vivos em armadilhas da gaiola iscas com as salsichas fumadas comercialmente disponíveis e o óleo de peixes. Mongooses foram alojados em individuais 60 cm x 60 cm x 40 cm gaiolas de aço inoxidável e alimentados com uma ração diária de ~ 50 g alimento de gato seco comercial, suplementado duas vezes por semana com uma coxa de frango disponível comercialmente. A água estava disponível ad libitum. Nós entregamos dois derivados de IPA, de ethyl-IPA e de methyl-IPA, aos mangustos cativos em baits do placebo ORV. Todas as iscas foram compostas de um blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm com revestimento externo (doravante "matriz de isca") contendo ovo de frango em pó e gelatina (tabela de materiais). As iscas continham 0,7 mL de água ou derivado do IPA e pesaram aproximadamente 3 g, dos quais ~ 2 g foi a matriz de isca externa.
Nós oferecemos 16 mangustos cativas et-IPA em três concentrações: 0,14% (2,8 mg et-IPA em ~ 2 g de matriz de isca; 3 machos [m], 3 fêmeas [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 3M, 3F) e 1,0% (7,0 mg de etil-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 2m , 2f). A dose global de 2,8 mg corresponde a uma taxa de dose de 5 mg/kg27,36 e baseia-se num peso médio de mangusto de 560 g em Porto Rico. Nós selecionamos 1% como a concentração a mais elevada como a pesquisa sugere a aversão do gosto a alguns biomarcadores pode ocorrer em concentrações > 1% em algumas espécies37. Nós oferecemos somente a dose de 1% no bloco de bolha como a floculação impediu o soluto de dissolver-se no solvente suficientemente para ser incorporado uniformente na matriz da isca. Um grupo controle (2m, 1f) recebeu iscas cheias de água estéril e sem IPA. Nós oferecemos iscas para mangustos na parte da manhã (~ 8 a.m.) durante ou antes da alimentação de sua ração de manutenção diária. Restos de isca foram removidos após aproximadamente 24 horas. Foram coletadas amostras de sangue antes do tratamento, um dia após o tratamento e, em seguida, semanalmente até 8 semanas após o tratamento. Nós Anestesiaram mangustos pela inalação do gás do isoflurano e coletamos até 1,0 ml do sangue inteiro pelo punção venosa da veia craniana oca como descrita para furões38. Nós centrifugados amostras inteiras do sangue, sera transferido aos cryovials e armazenamos-os em-80 ° c até a análise. Nem todos os animais foram amostrados durante todos os períodos de tempo para minimizar os impactos do sangue repetido se baseia na saúde dos animais. Os animais de controle foram amostrados no dia 0, depois semanalmente por até 8 semanas após o tratamento.
Nós entregamos o me-IPA em três concentrações: 0, 35% (0,7 MGS), 0, 7% (1,4 MGS) e 0,14% (2,8 MGS), todos incorporados na matriz da isca, com 2 machos e 2 fêmeas por o grupo do tratamento. Dois machos e duas fêmeas receberam iscas cheias de água estéril e sem IPA. Os tempos de oferecimento da isca e a anestesia do Mongoose são descritos acima. Nós coletamos amostras de sangue antes do tratamento no dia 1, e então semanalmente até 4 semanas após o tratamento.
Foram testados dados de concentração sérica para normalidade e médias estimadas para concentrações séricas de IPA de diferentes grupos de tratamento. Utilizou-se um modelo linear misto para comparar as concentrações médias de et-IPA sérica agrupadas em indivíduos. O tipo da isca (matriz/bloco de bolha) era um efeito fixo além do que o dia experimental, visto que a identificação animal era um efeito aleatório. Todos os procedimentos foram executados utilizando software estatístico comum (tabela de materiais) e a significância foi avaliada em α = 0, 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Acetonitrile, Optima grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A996</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XS204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:380px;">C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-&#181;m particle size</td>
			<td style="width:193px;">Waters Corp.</td>
			<td style="width:304px;">186003085</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">ESI Source</td>
			<td style="width:193px;">Agilent&#160;</td>
			<td style="width:304px;">G1958-65138</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Ethyl-iophenoxic acid, 97 %</td>
			<td style="width:193px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot MKBP5399V</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A117</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:380px;">LCMS software</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:380px;">Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR0709514717</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microanalytical balance</td>
			<td style="width:193px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:304px;">XP6U</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">5415C</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">MS/MS</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">G6470A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">N-Evap</td>
			<td style="width:193px;">Organomation</td>
			<td style="width:304px;">115</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:380px;">Oral Rabies Vaccine Baits</td>
			<td style="width:193px;">IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)</td>
			<td style="width:193px;">PR EuroChem Ltd.</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;">Lot PR100612108RR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Repeat pipettor</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">M4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5190-7024</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:380px;">Sodium chloride, Certified ACS grade</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">S271</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:380px;">Statistical Software Package</td>
			<td style="width:193px;">SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td>
			<td style="width:304px;">N/A</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:380px;">Trifluoroacetic acid, 99 %</td>
			<td style="width:193px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:304px;">L06374</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:380px;">UPLC</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">1290 Series</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:193px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:304px;">099A PV6</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.2-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.413</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">0.5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.421</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">14-666-325</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">1250-&#181;L capacity pipette tips</td>
			<td style="width:193px;">GeneMate</td>
			<td style="width:304px;">P-1233-1250</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:380px;">1-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.43</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">2-mL amber screw-top autosampler vials</td>
			<td style="width:193px;">Agilent</td>
			<td style="width:304px;">5182-0716</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">5-mL pipettor tips</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">30089.456</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">80-position microcentrifuge tube rack</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">05-541-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:380px;">8-mL amber vials with PTFE-lined caps</td>
			<td style="width:193px;">Wheaton</td>
			<td style="width:304px;">224754</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:380px;">70 % (v/v) isopropanol</td>
			<td style="width:193px;">Fisher</td>
			<td style="width:304px;">A459</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">100-1000 &#181;L air displacement pipette</td>
			<td style="width:193px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:304px;">ES-100</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of iophenoxic acid analogues in small indian mongoose (herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker

O Mongoose indiano pequeno (auropunctatus de Herpestes) é um reservatório do vírus da raiva (rabv) em Puerto Rico e compreende sobre 70% de casos animais da raiva relatados anualmente. O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado por uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. A pesquisa em vacinas orais da raiva e em vários tipos da isca para mangustos foi conduzida com resultados prometedores. O monitoramento do sucesso da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração nos anticorpos neutralizantes da RABV (RVNA) pós-vacinação. Esta estratégia pode ser difícil de interpretar em áreas com um programa ORV de vida selvagem ativa ou em áreas onde o RABV é enzoótico e níveis de fundo de RVNA estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incorporado com a vacina ou a matriz de isca pode ser útil. Nós oferecemos 16 mangustos em cativeiro placebo ORV iscas contendo ácido etil-iofenoxico (et-IPA) em concentrações de 0,4% e 1% dentro da isca e 0,14% na matriz de isca externa. Nós também oferecemos 12 mangustos cativos ORV iscas contendo ácido metil-iofenoxico (me-IPA) em concentrações de 0, 35%, 0, 7% e 0,14% na matriz de isca externa. Nós coletamos uma amostra do soro antes da oferta da isca e então semanalmente por até oito semanas de oferta do borne. Nós extraímos ácidos iophenoxic dos soros no acetonitrila e quantificamos usando a cromatografia líquida/espectrometria maciça. Foram analisados soros para et-IPA ou me-IPA por cromatografia líquida-espectrometria de massas. Nós encontramos a habilidade adequada da marcação por pelo menos oito e quatro semanas para o et-e o me-IPA, respectivamente. Ambos os derivados IPA poderia ser adequado para avaliação de campo de captação de isca ORV em Mongooses. Devido à longevidade do marcador em soros de Mangusto, o cuidado deve ser tomado para não confundir os resultados usando o mesmo derivado IPA durante avaliações consecutivas.

Os cromatogramas de íons representativos de uma análise do me-IPA são apresentados na Figura 1. O soro do Mongoose do controle (Figura 1a) ilustra o tempo de retenção de et-IPA (analyte substituto) e a ausência de me-IPA no tempo de retenção indicado. A amostra de controle de qualidade (Figura 1b) ilustra a separação de linha de base do me-IPA do et-IPA, bem como as transições de quantifi...

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Nós oferecemos mangustos prisionais placebo iscas de vacina contra a raiva oral com ácido etílico ou metil iofenóxico como um biomarcador e verificado captação de isca usando uma nova cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) método.

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Delineamos um procedimento para detectar e quantificar o ácido iofenoxico no soro de mangusto. Os resultados sugerem que o ácido iofenoxico pode ser usado como um marcador biológico para verificar a absorção beta na espécie. A principal vantagem deste método é que ele permite a quantificação de análogos de ácido iofenoxico em partes por bilhão de níveis, usando uma técnica simples de executar precipitação proteica.Para a fase móvel A, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de água ultra pura. Para a fase móvel B, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de acetonitrila. Para o diluente, combine um mililitro de ácido trifluoroacético com 200 mililitros de acetonitrilo.Em seguida, pese aproximadamente 10 miligramas de metil-IPA em microequilípmo, e registe a massa para mais ou menos 0001 miligramas. Transfira quantitativamente o metil-IPA para um frasco volumoso classe A de 10 mililitros, usando quatro a cinco mililitros de acetonitrilo. Sonicate por um minuto para dissolver todos os sólidos e, em seguida, trazer a volume com acetonitrilo.Transfira aproximadamente oito mililitros de cada estoque para oito frascos de vidro âmbar mililitro com tampas forradas com PTFE e armazene as amostras à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o estoque restante para resíduos perigosos. Para o estoque 25X, sete estoques de metil-IPA preparam um estoque de metil-IPA e acetonitrilo a aproximadamente 200 microgramas por mililitro.Transfira um mililitro do estoque para um frasco de cinco mililitros e dilua para volume com acetonitrilo. Em seguida, transfira o estoque para um frasco de vidro âmbar de oito mililitros com uma tampa forrada com PTFE e armazene à temperatura ambiente. Usando um pipettor repetido, prepare os seis estoques adicionais de metil-IPA de 25X descritos no protocolo de texto em oito frascos de vidro âmbar mililitro com tampas alinhadas ao PTFE e armazene à temperatura ambiente.Para o estoque substituto de 25X, transfira 0,1 mililitro do estoque concentrado de etila-IPA para um frasco volutrico classe A de 10 mililitros usando uma seringa de vidro de 100 microliter e, em seguida, diluir para volume com acetonitrila. Transfira aproximadamente oito mililitros do estoque de substitutos para um frasco de vidro âmbar de oito mililitros com tampa forrada com PTFE e armazene à temperatura ambiente. Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.Em seguida, prepare os estoques 4X contendo tanto methyl-IPA quanto etil-IPA em frascos de amostrador automático de vidro de 10 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Por exemplo, para preparar o estoque 4X7, adicione 0,2 mililitros do estoque de 25X sete estoques de metil-IPA a um frasco de dois mililitros usando o pipettor repetitivo com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro. Adicione 0,2 mililitros do estoque de 25X etil-IPA substituto usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro.Adicione 0,85 mililitros de acetonitrila usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de mililitro. Tampe o frasco com segurança e inverta cinco vezes para misturar. A seguir, prepare a curva padrão em dois frascos de amostrador automático de rosca mililitro, conforme descrito no protocolo de texto.Por exemplo, para preparar o padrão sete, adicione 0,2 mililitros do estoque 4X7 a um frasco de dois mililitros, usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro. Adicione 0,6 mililitros de água ionizada de ultra pureza usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de mililitro. Tampe os frascos com segurança e inverta cinco vezes para misturar.Para cada amostra, prepare um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo 200 a 300 miligramas de cloreto de sódio e disponha os tubos em um rack plástico de 80 posições. Para cada amostra, rotule um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro como A e um segundo tubo de micro centrífuga como B.Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições. Coloque os seguintes materiais e equipamentos necessários para extração de soro em um armário de biossegurança classe dois: os tubos de micro centrífuga, um misturador de vórtice, um pipettor repetido com 0,5 mililitro e cinco pontas de capacidade mililitro, uma pipeta de deslocamento de ar de 100 a 1000 microlitres com pontas de 1000 microliteres, recipientes com aproximadamente 100 mililitros cada de água diluída e ultra pureza, e recipiente de resíduos de risco biológico.Em seguida, remova amostras de soro do armazenamento congelado e aqueça até a temperatura ambiente no armário de biossegurança. Misture cada amostra de soro antes da amostragem. Usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro, distribua 05 mililitros de soro de mangusto no tubo A e adicione 05 mililitros do estoque de substitutos de 25X.Em seguida, adicione 0,95 mililitros de diluente ao tubo A usando um pipettor repetitivo com uma ponta de capacidade de cinco mililitros. Tampe os tubos com segurança e misture o vórtice por 10 a 15 segundos. Em seguida, adicione o soro de mangusto de controle ao tubo A.Fortify cada uma das amostras de 4QC com me-IPA usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro.Adicione 25X de estoque de substituto às amostras de QC. Em seguida, adicione o diluente às amostras de QC. Tampa os tubos e a mistura de vórtice.Distribua o cloreto de sódio pré-pesado no tubo A e no vórtice de mistura três vezes por oito a 12 segundos. Em seguida, limpe as superfícies externas do frasco contendo tubo A usando isopropanol de 70%. Depois de remover as amostras do armário de biossegurança, o tubo de centrífuga A a 1200 vezes G por um minuto para separar as fases aquosas e acetonitrilos.Pipeta 0,8 mililitros da fase de acetonitrila superior para o tubo B, usando uma pipeta de deslocamento de ar de 100 a 1000 microlitres. Transfira a solução restante no tubo A para resíduos perigosos e descarte o tubo vazio em um recipiente de resíduos de risco biológico. Agora, remova acetonitrilo e trifluoroacético do tubo B com um fluxo suave de gás nitrogênio em um banho de água de 45 graus Celsius.Adicione 0,25 mililitros de acetonitrilo ao tubo B usando uma mistura de pipettor e vórtice repetidos por quatro a cinco segundos. Em seguida, centrífuga a 1200 vezes G por dois a quatro segundos para coletar o líquido na parte inferior do tubo. Após a centrifugação, adicione 0,75 mililitros de água deionizada ultra pura ao tubo B usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de cinco mililitros e mistura de vórtice por quatro a cinco segundos.Centrifugar a 1200 vezes G por um minuto para esclarecer a amostra. Em seguida, transfira 0,75 mililitros do supernatante para um frasco de amostrador automático usando uma pipeta de deslocamento de ar de 1000 microlitres e descarte as pontas de pipeta no recipiente de resíduos de risco biológico. Limite cada frasco de amostrador automático com segurança para análise de LC-MS/MS.Transfira a solução restante no tubo B para resíduos perigosos e descarte o tubo vazio em um recipiente de resíduos de risco biológico. Configure o LC-MS/MS com todos os parâmetros descritos no protocolo de texto. Ligue o LC-MS/MS e permita que a coluna atinja 70 graus Celsius antes de definir a taxa de fluxo para 0,8 mililitros por minuto.Configure uma sequência no software de aquisição de dados para injetar a curva padrão antes e depois de cada lote consistindo de amostras de controle de qualidade e amostras desconhecidas. Injete todas as normas e amostras e adquira cromatogramas de íons mr usando parâmetros listados no protocolo de texto. Após a conclusão da sequência, desligue o LC-MS/MS e descarte todos os frascos de amostrador automático em resíduos perigosos.O cromatógrama de íon do soro de mangusto de controle ilustra o tempo de retenção da etil-IPA e a ausência de metil-IPA no tempo de retenção indicado. O cromatógrafo de íon da amostra de controle de qualidade ilustra a separação da linha de base do metil-IPA da etíe-IPA, bem como as transições do quantificador e qualificatório para metil-IPA. O cromatógrafo de íon da amostra representativa do estudo mostra uma concentração de soro observada de 33,5 microgramas por microlitera de metila-IPA.Os resultados de precisão e precisão para controle do soro mangusto fortificado com metil-IPA são mostrados aqui. Percentual de recuperações variou de 96,9 a 109% O desvio percentual nos três níveis de fortificação foi de 3,4%1,7% e 2,3%, respectivamente. Os resultados de precisão e precisão para controle do soro mangusto fortificado com etil-IPA são mostrados aqui.Percentual de recuperações variou de 89,5 a 115% O desvio padrão percentual nos cinco níveis de fortificação foi de 4,3%1,5%2,3%5,6% e 1,1%, respectivamente. Todas as mangustos ofereciam iscas de etil-IPA e metil-IPA consumiam pelo menos 25% da isca dentro da restrição de tempo de 24 horas e tinham níveis quantificáveis de etil-IPA e metil-IPA em sua soro, respectivamente. A utilidade potencial do método poderia ser aumentada configurando o LC-MS para coletar dados para outros análogos de ácido iofênico, como propil e ácido iofenóxico butil.Encorajamos o pessoal a consultar as recomendações mais recentes do comitê consultivo sobre práticas de imunização, ou de seu comitê institucional de biossegurança para orientação sobre se a vacinação antirraiva é necessária. As seções 2.3 a 2.6 deste protocolo envolvendo trabalhar com soro não diluído devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança classe dois.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...