Name: chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

ويدعم هذا البحث من قبل الإتاوات Genentech إلى مدينة الأمل. وهذا العمل لا تدعمه المعاهد الوطنية للصحة كلياً أو جزئياً.

1. إعداد الكواشف
<ol><li>جعل 18.5٪ بارافورمالدهايد (PFA) الحل. إضافة 0.925 غرام من PFA، 4.8 مل من الماء (استخدام المياه فائقة النقاء في جميع أنحاء البروتوكول) و 35 درجة مئوية من 1 M KOH في أنبوب بلاستيكي مخروطي 50 مل. أغلق الغطاء بإحكام وسخن الأنبوب في كوب زجاجي سعة 400-600 مل يحتوي على حوالي 200 مل من الماء باستخدا...

<ol>
	<li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+initiation:+a+structural+view.">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40:+identification+of+new+viral+gene+product.">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin:+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA.">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li><li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Genomic+DNA.">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).</li><li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation:+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate.">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation+of+DNA.">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells.">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li><li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex.">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines.">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).</li><li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin.">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li><li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells.">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li></ol>

على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة للحصول على الكروماتين مجزأة، فإنه من تستغرق وقتا طويلا ومرهقة لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. في هذا البروتوكول، استخدمنا هضم MNase لأن هضم الإنزيم يجب أن يكون أسهل لتحديد الظروف القابلة للاستنساخ. كانت خطوة سونيكيشن قصيرة بعد الهضم MNase (انظر الخطوة 2.2) ?...

يتم تنظيم التعبير الجيني في خلايا الثدييات بشكل محكم وديناميكي، والنسخ هو واحد من الخطوات الرئيسية. يتم تنظيم النسخ الجيني بشكل رئيسي من قبل عوامل النسخ والنغمات. عامل النسخ هو البروتين الذي يربط تسلسل اتّساط الحمض النووي المحدد ويتحكم في نسخ الجينات. هذه العوامل إما تعزيز أو تثبيط تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (PolII)، الذي يبدأ توليف الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الجيني كقالب1. تعديلات الهيستون مثل الأسيتيل ومثيلة مخلفات ذيل الهيستون تؤثر بشكل إيجابي وسلبي على نسخ الجينات عن طريق تغيير هيكل الكروماتين2. وبما أن التعديلات في التعبير الجيني تؤثر على السياق الخلوي، فمن الضروري فحص الآليات الجزيئية التي يتم من خلالها تنظيم النسخ.
وحتى الآن، تتوفر عدة طرق للتحقيق في تنظيم النسخ الجيني. يتم استخدام فحص التحول التنقل الكهربائي (EMSA)، ويسمى أيضا اختبار التحول هلام، لتحليل التفاعل بين البروتين والحمض النووي3. يتم احتضان استخراج نووي من الخلايا ذات الأهمية مع نظير مشع (على سبيل المثال، 32P) المسمى الحمض النووي التحقيق والكهربائي على هلام polyacrylamide. يظهر الرسم البياني التلقائي أن مجمع بروتين الحمض النووي يهاجر أبطأ من المسبار في هلام. في وجود جسم مضاد ضد البروتين، يهاجر مركب الحمض النووي البروتيني والأجسام المضادة في هلام ببطء أكثر من مجمع بروتين الحمض النووي. هذه الفرقة supershifted يكشف عن ربط محددة بين الحمض النووي والبروتين. ومع ذلك، EMSA يحدد فقط تفاعل الحمض النووي البروتين محددة في نظام خال من الخلايا، وبالتالي فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان التفاعل يتحكم في النسخ في الخلايا الحية. تم تطوير اختبار المراسل العابر، الذي يُطلق عليه عادة ً اختبار مراسل لوسيفيراز، لمعالجة تنظيم التعبير الجيني في الخلايا. عادة، يتم إدخال منطقة جينية في المنبع من جين ذات أهمية في بلازميد مراسل، يتم نقلها بشكل عابر إلى الخلايا، ويتم قياس نشاط المراسل. مجموعة متنوعة من المسوخ الحذف يسمح بتحديد المناطق المسؤولة عن تنظيم الجينات. على الرغم من أن اختبار مراسل هو أداة مفيدة لتحديد عوامل النسخ وتسلسل الحمض النووي ملزمة السيطرة على النسخ، وهذا الأسلوب لديه عيب كبير في أن بلازميد مراسل خال من بنية الكروماتين ولا يعكس "حقيقي" آلات النسخ. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تحديد التغييرات في تعديلات الهستون من قبل النظام.
ويستند تطوير طريقة الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP) على تقارير جاكسون وتشاكلي أن "خلية كاملة" التثبيت مع الفورمالديهايد الحفاظ على هيكل الكروماتين4،5. ومنذ ذلك الحين، تم تطوير وتحسين العديد من التقنيات ذات الصلة6. في اختبارات ChIP، يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد لعبور ربط الحمض النووي والبروتينات. الكروماتين مجزأة ومن ثم مناعية مع الأجسام المضادة للاهتمام. يتم غسل المجمع المناعي، ويتم تنقية الحمض النووي. ويكشف تضخيم PCR مع المواد التمهيدية الموجهة إلى منطقة معينة من الجينوم عن شغل البروتينات ذات الأهمية في الجينوم.
على الرغم من أن ChIP هو أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتينات مثل عوامل النسخ وتعديل النغمات مع الحمض النووي، فإن الطريقة تنطوي على بعض الصعوبات، مثل خطوة تجزئة الكروماتين، في الممارسة العملية. وقد استخدمت سونيكيشن على نطاق واسع لقص الكروماتين. ومع ذلك، فمن المرهق تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. علاج النوكليس ميكروكوكال (MNase) هو طريقة بديلة لقص الكروماتين. MNase هو بطانة exonuclease أن يهضم مزدوجة تقطعت بهم السبل، واحدة تقطعت بهم السبل، والحمض النووي الدائري والخطي والحمض النووي الريبي. فمن السهل نسبيا لتحديد الظروف، بما في ذلك كميات الكروماتين والانزيم، ودرجة الحرارة، ووقت الحضانة، لتجزئة الكروماتين الأمثل. قمنا بتعديل وتبسيط البروتوكولات القائمة، وأنشأنا طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ. توفر هذه الورقة بروتوكولًا لـ ChIP باستخدام MNase في خلايا الثدييات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1643px;" width="1642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td style="width:793px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2 M KCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2X iQ SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1706862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:557px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Research Product International</td>
			<td style="width:119px;">A20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">ChIP-grade protein G magnetic beads</td>
			<td style="width:173px;">Cell signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">9006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-153</td>
			<td>Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Gel Loading Dye Purple (6X)</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycine</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycogen</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1767</td>
			<td>19-22 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">High Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-155</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Histone H3K4me3 antibody (pAb)</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">LiCl Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-156</td>
			<td>Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Low Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-154</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Magna GrIP Rack (8 well)</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-400</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Micrococcal nuclease</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0247S</td>
			<td>comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 &#176;C) and 100 x BSA (10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:173px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Normal rabbit IgG</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">PIPES</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Real-time PCR system</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">CFX96, C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">SDS</td>
			<td style="width:173px;">Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">100155</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">sodium acetate</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sonicator equipped with a microtip probe</td>
			<td style="width:173px;">QSONICA</td>
			<td style="width:119px;">Q700</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15593031</td>
			<td>pH 8.05</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells

للتعبير عن الأنماط الظاهرية الخلوية في الكائنات الحية، تقوم الخلايا الحية بتنفيذ التعبير الجيني وفقا لذلك، وتلعب البرامج النسخية دورا ً محورياً في التعبير الجيني. وتنسق الآلات الخلوية النسخية وبروتينات تعديل الكروماتين لتنظيم النسخ. لتحليل التنظيم النسخي على المستوى الجزيئي، تتوفر العديد من الطرق التجريبية مثل تحول التنقل الكهربائي، ومراسل عابر واختبارات الترسيب المناعي الكروماتين (ChIP). نحن نصف فحص ChIP المعدلة بالتفصيل في هذه المقالة بسبب مزاياه في إظهار مباشرة تعديلات الهيستون والتفاعلات بين البروتينات والحمض النووي في الخلايا. واحدة من الخطوات الرئيسية في اختبار ChIP ناجحة هو القص الكروماتين. على الرغم من أن سونيكيشن يستخدم عادة لقص الكروماتين، فمن الصعب تحديد الظروف القابلة للاستنساخ. بدلا من القص الكروماتين عن طريق سونيكيشن، استخدمنا الهضم الأنزيمي مع نوكليسال ميكروكوكال (MNase) للحصول على نتائج أكثر استنساخا. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول CHIP مباشرة باستخدام MNase.

هضم الكروماتين هي واحدة من الخطوات الهامة لاختبار ChIP. استخدمنا MNase لهضم الكروماتين للحصول على خليط من oligomers النيوكليوسوم. في خطوة الهضم MNase، MNase يمكن أن تذهب من خلال الغشاء النووي وهضم الكروماتين. ومع ذلك، فإن الكروماتين المهضوم لا يمكن أن تذهب من خلال الغشاء ويبقى في النوى. للافراج عن الكرو...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

الكروماتين المناعية الترسيب (ChIP) هو أداة قوية لفهم الآليات الجزيئية لتنظيم الجينات. ومع ذلك، فإن الطريقة تنطوي على صعوبات في الحصول على تجزئة الكروماتين القابلة للاستنساخ عن طريق القص الميكانيكي. هنا، نحن نقدم بروتوكول محسن ة لـ ChIP باستخدام الهضم الأنزيمي.

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

في هذا البروتوكول، يمكننا تحديد التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي، والكشف عن التنظيم النسخي للجين. وهذا يساعد على فهم الآليات الجزيئية في الخلايا. نقوم بتعديل البروتوكولات الموجودة من قبل ومن ثم إنشاء بروتوكولات فحص واضحة وواضحة.يمكنك ببساطة اتباع البروتوكول من الخطوة الأولى بحيث يمكن إجراء الفحص بنجاح. لإعداد كروماتين عبر الصلصال، في غطاء الدخان، إضافة أربعة ملليلتر من 1٪ VCaP وسائل الإعلام ثقافة الخلية و 0.229 ملليلتر من 18.5٪ PFA إلى طبق ستة سنتيمترات. دوامة بلطف الطبق لتوزيع PFA بالتساوي.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة بالضبط. ثم، إضافة 0.47 ملليلتر من محلول الجليسين 1.25-مولر إلى الطبق، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لوقف مزيد من الربط المتبادل. بعد غسل الخلايا وفقا للمخطوطة، كشط الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروسنتريفوغ 1.5 ملليلتر.الطرد المركزي أنبوب مع تعليق الخلية في 3،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لاسترداد بيليه الخلية. استخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني تماما. سجل رقم الخلية لكل أنبوب، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية.لأداء تحلل الخلية، أولا ذوبان الكريات خلية VCaP المخزنة على الجليد. إضافة 300 microliters من الخلية ChIP إعداد العازلة تحلل تكملة مع الموافقة المسبقة عن علم إلى كل أنبوب، وإعادة ربط بيليه بدقة. دوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية، واحتضان تعليق على الجليد لمدة 10 دقائق.جهاز طرد مركزي في 9،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة supernatant تماما، وإضافة 300 ميكرولترات من المخزن المؤقت الهضم MNase إلى resuspend بيليه. تخفيف MNase مع MNase الهضم العازلة في أنبوب 1.5 ملليلتر لتحقيق 50 وحدات هلام لكل ميكرولتر.أضف MNase المخفف إلى التعليق ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بالضبط. تعيين خلط عن طريق عكس كل 2 1/2 دقيقة. لإنهاء الهضم MNase، إضافة 30 ميكرولترات من 0.5-EDTA مولا في ثمانيه pH، ودوة لفترة وجيزة.بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد، والطرد المركزي في 9،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة supernatant تماما، وإعادة فرض بيليه في 300 ميكرولترات من العازلة تخفيف ChIP المعدة تكملها الموافقة المسبقة عن علم. ثم، على sonicator مجهزة مسبار microtip، تعيين شروط sonication إلى السعة اثنين، الوقت معالجة 15 ثانية، نبض على خمس ثوان، ونبض قبالة 30 ثانية.سونيكات التعليق على الجليد. رسم ميكرولتر واحد من التعليق، وعلى الفور على الزجاج الشريحة. تحت المجهر، لاحظ للتأكد من أن هيكل الخلية مكسورة تقريبا.الطرد المركزي الأنبوب في 9، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، ونقل سوبرانت إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge. حفظ 20 ميكرولترات من الكروماتين هضمها في أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر لمزيد من العلاج, وتخزين ما تبقى في ناقص 80 درجة مئوية. أولاً، في كل أنبوب برغي 1.5 ملليلتر، أضف 75 ميكرولترات من الماء، وأربعة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الخماسي، وميكر واحد من البروتينات K.To إزالة الربط المتبادل بين البروتين والحمض النووي، أضف 20 ميكرولترات من الكروماتين المهضم من كل حالة هضم MNase إلى أنبوب برغي.أغلق الغطاء بإحكام، اخلطي تماما، وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في الصباح، بعد الطرد المركزي للأنبوب في 2-3، 000 مرات ز لبضع ثوان، إضافة 100 ميكرولترات من PCI. دوامة بقوة لتشكيل مستحلب.الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم, إعداد اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لكل حالة. إضافة 100 ميكرولترات من PCI إلى أنبوب واحد.إضافة 10 ميكرولترات من خلات الصوديوم ثلاثة المولر في الأسك 5.2 واثنين من ميكرولترات من الجليكوجين إلى أنبوب آخر. من الأنبوب الذي تم إخراجه من جهاز الطرد المركزي، قم برسم المرحلة العليا التي تحتوي على الحمض النووي بعناية وإضافتها إلى الأنبوب الذي يحتوي على PCI. دوامة بقوة، والطرد المركزي أنبوب في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، نقل المرحلة العليا إلى أنبوب يحتوي على خلات الصوديوم والجليكوجين أعدت سابقا. إضافة 250 ميكرولترات من الإيثانول، ومزيج من الانقلاب. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.جهاز طرد مركزي الأنبوب في السرعة القصوى لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. تأكيد الكريات على الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية من عظمى حتى لا يزعج بيليه، وإضافة 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول.جهاز طرد مركزي الأنبوب في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة ناظر تماما، وتجفيف بيليه لمدة خمس دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من TE إلى حل بيليه.قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. بعد إعداد الكروماتين المهضم ، ذوبان جميع العينات على الجليد. إضافة 1200 ميكرولترات من العازلة تخفيف ChIP المعدة تكملها الموافقة المسبقة عن علم لتخفيف الكروماتين هضمها إلى تركيز خمسة ميكروغرام لكل 500 ميكرولترات.إضافة خمسة ميكرولترات من الكروماتين المهضمة المخففة إلى أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر كعينة المدخلات. تخزين العينة في ناقص 80 درجة مئوية. أضف 500 ميكرولترات كل من الكروماتين المهضم المخفف إلى أنبوب برغي 1.5 ملليلتر كعينة مناعية.إضافة اثنين من ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل أنبوب، وإغلاق الغطاء. احتضان الأنابيب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الاختلاط بلطف على منصة هزاز. في الصباح، إضافة 30 ميكرولترات من ChIP من الدرجة البروتين G الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب.احتضان الأنابيب مرة أخرى في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين مع خلط لطيف. بعد ذلك، تدور أسفل الأنبوب لفترة وجيزة في 2-3، 000 مرات ز، ووضع الأنبوب في رف البولي إيثيلين التي تحتوي على مغناطيس النيودميوم لمدة دقيقة واحدة. ثم، إزالة بعناية فائقة من الطموح.المقبل, إضافة 0.5 ملليلتر من انخفاض الملح منيع مجمع عازلة غسل لكل أنبوب. دوامة لفترة وجيزة الأنبوب لتفريق الخرز. احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق مع خلط لطيف على منصة هزاز.كرر الغسيل مع مجمع المناعة عالي الملح ومجمع مناعي كلوريد الليثيوم وفقًا للمخطوطة. بعد إزالة ما تبقى من عظمى تماما، إضافة 150 ميكرولترات من عازلة elution إلى الأنبوب. دوامة الأنبوب لتفريق الخرز تماما.أغلق الغطاء، وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتفريق الخرز جيدا، مزيج من قبل عكس كل خمس دقائق. أثناء الحضانة، إعداد أنبوب المسمار 1.5 ملليلتر، وإضافة ستة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولر واثنين من microliters من البروتينات K.Thaw عينة 1٪ مدخلات أعدت سابقا على الجليد.إضافة 150 ميكرولتردات من عازلة elution، وستة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولار، واثنين من microliters من البروتينات K إلى عينة المدخلات. بعد حضانة أنبوب يحتوي على الخرز ، تدور أسفل. وضع الأنبوب في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، ونقل عظمى إلى أنبوب المسمار التي تحتوي على كلوريد الصوديوم والبروتينات K.ممثل microphotos من الكريات خلية عبر الربط قبل وبعد سونيكيشن تظهر اختلافات متميزة.بدون صوتنة، لا يزال هيكل الخلية سليمة، مما يشير إلى أن الكروماتين موجود في النوى. و sonication وجيزة يكسر بنية الخلية. تم إعداد الكروماتين المتداخلة من خلايا VCaP وهضمها بكميات مختلفة من MNase.دون إضافة MNase، ظهر نمط مسحة مع وزن جزئي مرتفع جدا. أعطى إضافة من MNase نمط سلم, مما يدل على أن MNase هضم internucleosome. يمكن اعتبار الحالة الوحيدة التي أنتجت شظايا الكروماتين تصل إلى 900 BP هضم مناسب ، في حين أن نمط الهضم غير الملائم يظهر إفراط في الهضم أدى بشكل رئيسي إلى إنتاج مونونووزوم.نمط الهضم من الكروماتين في خلايا VCaP تشير إلى الهضم السليم من الكروماتين. ولوحظ أن أعلى شغل لـ H3K4methyl3 قد لوحظ حوالي 0.5 كيلوبيس وقاعدة كيلو واحدة في المنبع من AR-TSS. المناطق الواقعة في 19 كيلوبيس و8 كيلو بايت المنبع و 12 كيلوبيس أسفل المصب من AR-TSS، ومع ذلك، كان شغل القليل من H3K4methyl3، مما يشير إلى أن هذه يمكن استخدامها كالمناطق السلبية.تحديد حالة الهضم MNase هو الأكثر أهمية. الاحتفاظ برقم الخلية وحجم المخزن المؤقت ومقدار الإنزيم في كل تجربة. يجب تحديد الشرط لكل نوع خلية.يمكننا إجراء تسلسل ChIP للإشغال العالمي للعوامل والتقاطات التشطيب الكروماتين لتحديد التفاعلات بين الآفات الجينومية البعيدة. ويمكن أن تكشف هذه الطريقة عن آليات عملية النسخ. ChIP المقايسة هو أداة قوية للتحقيق في التنظيم النسخي ، لكنه مرهق وغير قابل للتكرار.طريقتنا تشجع الباحثين على إجراء الفحص بشكل روتيني وبسهولة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

اكتشاف الأهداف التنظيمية CsgD في السالمونيلا biofilm باستخدام كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن والتسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

رسم خرائط عالية الدقة للتفاعلات البروتينية-الحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس باستخدام Chromatin immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...