Name: chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

Cette recherche est appuyée par les redevances de Genentech à la Ville de l'Espoir. Ce travail n'est pas soutenu en tout ou en partie par les National Institutes of Health.

1. Préparation des réactifs
<ol><li>Faire une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 18,5 %. Ajouter 0,925 g de PFA, 4,8 ml d'eau (utiliser de l'eau ultrapurifiée tout au long du protocole) et 35 L de 1 M KOH dans un tube en plastique conique de 50 ml. Fermez le bouchon hermétiquement et chauffez le tube dans un bécher en verre de 400 à 600 ml contenant environ 200 ml d'eau à l'aide d'un four à micro-ondes. Retirez le tube avant que l'eau commence à bouillir et vortex le tube pour dissoudre PFA. Laisser le PFA...

<ol>
	<li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+initiation:+a+structural+view.">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. 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B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Genomic+DNA.">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).</li><li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation:+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate.">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation+of+DNA.">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells.">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li><li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex.">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines.">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).</li><li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin.">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li><li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells.">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li></ol>

Bien que la sonication soit couramment utilisée pour obtenir la chromatine fragmentée, il est long et lourd d'identifier les conditions reproductibles. Dans ce protocole, nous avons utilisé la digestion MNase parce que la digestion enzymatique devrait être plus facile d'identifier les conditions reproductibles. Une brève étape de sonication après la digestion de MNase (voir étape 2.2) a été nécessaire pour casser la membrane cellulaire et pour libérer la chromatine digérée. Par conséquent, la puissance de ...

L'expression génique dans les cellules de mammifères est étroitement et dynamiquement réglée, et la transcription est l'une des étapes clés. La transcription génique est principalement réglementée par des facteurs de transcription et des histones. Un facteur de transcription est une protéine qui se lie à des séquences d'ADN spécifiques et contrôle la transcription des gènes. Ces facteurs favorisent ou inhibent le recrutement de la polymérase II (PolII), qui initie la synthèse de l'ARNm à partir de l'ADN génomique comme modèle1. Les modifications d'histone telles que l'acétylation et la méthylation des résidus de queue d'histone affectent positivement et négativement la transcription de gène en changeant la structuredechromatine 2. Puisque les altérations de l'expression génique affectent le contexte cellulaire, il est essentiel d'examiner les mécanismes moléculaires par lesquels la transcription est réglementée.
À ce jour, plusieurs méthodes d'étude de la régulation de la transcription génétique sont disponibles. L'analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), également appelée analyse de changement de gel, est utilisée pour analyser une interaction protéine-ADN3. Un extrait nucléaire de cellules d'intérêt est incubé avec une sonde d'ADN étiquetée par isotope radioactif (par exemple, 32P) et électrophoresed sur un gel de polyacrylamide. Son autoradiogramme montre que le complexe ADN-protéine migre plus lentement que la sonde dans un gel. En présence d'un anticorps contre la protéine, le complexe ADN-protéine-anticorps migre dans un gel plus lentement que le complexe ADN-protéine. Cette bande superdécalée révèle une liaison spécifique entre l'ADN et la protéine. Cependant, l'EMSA détermine seulement une interaction ADN-protéine spécifique dans un système sans cellules, et par conséquent on ne sait pas si l'interaction contrôle la transcription dans les cellules vivantes. L'exemple de journaliste transitoire, communément appelé test de journaliste de luciferase, a été développé pour aborder la régulation d'expression de gène dans les cellules. Typiquement, une région génomique en amont d'un gène d'intérêt est insérée dans un plasmide de journaliste, transfectée transitoirement dans les cellules, et l'activité de journaliste est mesurée. Une variété de mutants de suppression permet l'identification des régions qui sont responsables de la régulation des gènes. Même si un test de journaliste est un outil utile pour identifier les facteurs de transcription et lier les séquences d'ADN contrôlant la transcription, cette méthode a un inconvénient majeur en ce qu'un plasmide journaliste est exempt de structure de chromatine et ne reflète pas «réel» machines de transcription. En outre, les modifications apportées aux modifications de l'histone ne peuvent pas être déterminées par le système.
Le développement de la méthode d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) a été basé sur les rapports de Jackson et Chalkley que la fixation de « cellule entière » avec la structure préservée de chromatine de formaldéhyde4,5. Depuis lors, de nombreuses techniques connexes ont été développées et améliorées6. Dans les analyses ChIP, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde pour relier l'ADN et les protéines. La chromatine est fragmentée puis immunoprécipitée avec des anticorps d'intérêt. Le complexe immunitaire est lavé, et l'ADN est purifié. L'amplification de PCR avec des amorces ciblées à une région particulière du génome indique l'occupation des protéines d'intérêt dans le génome.
Bien que ChIP soit un outil puissant pour identifier les interactions des protéines telles que les facteurs de transcription et les histones modifiées avec l'ADN, la méthode implique quelques difficultés, telles qu'une étape de fragmentation de chromatine, dans la pratique. Sonication a été largement utilisé pour la chromatine de cisaillement; cependant, il est difficile d'identifier les conditions reproductibles. Le traitement de nucléase micrococcique (MNase) est une méthode alternative pour le tonte de chromatine. MNase est une endo-exonucléase qui digère l'ADN et l'ARN à double brin, à brin unique, circulaire et linéaire. Il est relativement facile de déterminer les conditions, y compris les quantités de chromatine et d'enzyme, la température et le temps d'incubation, pour une fragmentation optimale de la chromatine. Nous avons modifié et simplifié les protocoles existants, et nous avons établi une méthode simple et reproductible. Cet article fournit le protocole pour un examen ChIP en utilisant MNase dans les cellules de mammifères.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1643px;" width="1642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td style="width:793px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2 M KCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2X iQ SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1706862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:557px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Research Product International</td>
			<td style="width:119px;">A20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">ChIP-grade protein G magnetic beads</td>
			<td style="width:173px;">Cell signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">9006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-153</td>
			<td>Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Gel Loading Dye Purple (6X)</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycine</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycogen</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1767</td>
			<td>19-22 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">High Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-155</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Histone H3K4me3 antibody (pAb)</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">LiCl Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-156</td>
			<td>Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Low Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-154</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Magna GrIP Rack (8 well)</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-400</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Micrococcal nuclease</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0247S</td>
			<td>comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 &#176;C) and 100 x BSA (10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:173px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Normal rabbit IgG</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">PIPES</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Real-time PCR system</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">CFX96, C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">SDS</td>
			<td style="width:173px;">Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">100155</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">sodium acetate</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sonicator equipped with a microtip probe</td>
			<td style="width:173px;">QSONICA</td>
			<td style="width:119px;">Q700</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15593031</td>
			<td>pH 8.05</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells

Pour exprimer les phénotypes cellulaires dans les organismes, les cellules vivantes exécutent l'expression de gène en conséquence, et les programmes transcriptionnels jouent un rôle central dans l'expression de gène. La machinerie transcriptionnelle cellulaire et ses protéines de modification de chromatine coordonnent pour réguler la transcription. Pour analyser la régulation transcriptionnelle au niveau moléculaire, plusieurs méthodes expérimentales telles que le déplacement de mobilité électrophorétique, le report transitoire et l'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sont disponibles. Nous décrivons un test modifié de ChIP en détail dans cet article en raison de ses avantages en montrant directement des modifications d'histone et des interactions entre des protéines et l'ADN dans les cellules. L'une des étapes clés d'un succès d'un jeu d'enfant est le cisaillement de la chromatine. Bien que la sonication soit couramment utilisée pour la chromatine de cisaillement, il est difficile d'identifier les conditions reproductibles. Au lieu de tonte de chromatine par sonication, nous avons utilisé la digestion enzymatique avec la nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir des résultats plus reproductibles. Dans cet article, nous fournissons un protocole d'assay ChIP simple en utilisant MNase.

La digestion de la chromatine est l'une des étapes importantes d'un résultat d'analyses ChIP. Nous avons utilisé MNase pour digérer la chromatine pour obtenir un mélange d'oligomères nucléosomes. Dans l'étape de digestion MNase, MNase peut passer par la membrane nucléaire et digérer la chromatine. Cependant, la chromatine digérée ne peut pas passer par la membrane et reste dans les noyaux. Pour libérer la chromatine digérée des noyaux, une brève sonication est nécessaire. La figure 1...

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Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Dans ce protocole, nous pouvons identifier les interactions entre les protéines et l’ADN, révélant la régulation transcriptionnelle du gène. Cela aide à comprendre les mécanismes moléculaires dans les cellules. Nous modifions les protocoles préexistants, puis établissons des protocoles d’analyse simples et plus clairs.Il vous suffit de suivre le protocole dès la première étape afin que l’analyse peut être fait avec succès. Pour préparer la chromatine croisée, dans une hotte de fumée, ajoutez quatre millilitres de 1% de médias de culture cellulaire VCaP et 0,229 millilitres de 18,5% PFA à un plat de six centimètres. Faites pivoter doucement le plat pour répartir le PFA uniformément.Incuber à température ambiante pendant exactement 10 minutes. Ajouter ensuite 0,47 millilitres de solution glycine molaire de 1,25 molar au plat et incuber à température ambiante pendant cinq minutes pour arrêter d’autres liens croisés. Après avoir lavé les cellules selon le manuscrit, racler les cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Centrifugez le tube avec la suspension cellulaire à 3000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante pour récupérer la pastille cellulaire. Utilisez une pipette pour enlever complètement le PBS. Enregistrez le numéro de cellule par tube et stockez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius.Pour effectuer la lyse cellulaire, décongelez d’abord les granulés de cellules VCaP stockés sur la glace. Ajouter 300 microlitres du tampon de lyse cellulaire ChIP préparé complété par pic à chaque tube, et resuspendre la pastille à fond. Vortex le tube pendant 15 secondes, et incuber la suspension sur la glace pendant 10 minutes.Centrifugeuse à 9000 fois g pendant trois minutes à 4 degrés Celsius. Retirez complètement le supernatant et ajoutez 300 microlitres de tampon de digestion MNase pour résuspendre la pastille. Diluer le MNase avec le tampon de digestion MNase dans un tube de 1,5 millilitre pour produire 50 unités de gel par microlitre.Ajouter le MNase dilué à la suspension, et incuber à 37 degrés Celsius pendant exactement 10 minutes. Réglez le mélange par inversion toutes les 2 1/2 minutes. Pour terminer la digestion mnase, ajouter 30 microlitres de 0,5 molaire EDTA au pH huit, et vortex brièvement.Après incubation pendant cinq minutes sur la glace, centrifugeuse à 9000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille dans 300 microlitres du tampon de dilution ChIP préparé complété par pic. Puis, sur un sonicator équipé d’une sonde micro-pointe, réglez les conditions de sonication à l’amplitude deux, le temps traité 15 secondes, impulsion sur cinq secondes, et pulse OFF 30 secondes.Sonicate la suspension sur la glace. Dessinez un microlitre de la suspension et placez-le sur un verre à glissière. Au microscope, observez pour vous assurer que la structure cellulaire est presque brisée.Centrifugez le tube à 9000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Économisez 20 microlitres de la chromatine digérée dans un tube à vis de 1,5 millilitre pour un traitement plus long, et conservez le reste à moins 80 degrés Celsius. Tout d’abord, dans chaque tube à vis de 1,5 millilitre, ajouter 75 microlitres d’eau, quatre microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et un microlitre de proteinase K.To éliminer les liaisons entre les protéines et l’ADN, ajouter 20 microlitres de chromatine digérée de chaque condition de digestion MNase à un tube à vis.Fermez le bouchon hermétiquement, mélangez complètement et incubez le tube à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin, après avoir centrifugé le tube à 2 à 3000 fois g pendant quelques secondes, ajouter 100 microlitres de PCI. Vortex vigoureusement pour former une émulsion.Centrifugez à nouveau le tube à vitesse maximale pendant 30 secondes à température ambiante. Ensuite, préparez deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par condition. Ajouter 100 microlitres de PCI à un tube.Ajouter 10 microlitres d’acétate de sodium trois molaires au pH 5,2 et deux microlitres de glycogène à un autre tube. À partir du tube sorti de la centrifugeuse, dessinez soigneusement la phase supérieure contenant de l’ADN et ajoutez-le au tube contenant du PCI. Vortex vigoureusement, et centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 30 secondes à température ambiante.Ensuite, transférez la phase supérieure au tube contenant de l’acétate de sodium et du glycogène préparés précédemment. Ajouter 250 microlitres d’éthanol et mélanger par inversion. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Confirmez les granulés sur le fond du tube. Retirer soigneusement le supernatant afin de ne pas déranger la pastille, et ajouter 500 microlitres de 70% d’éthanol.Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirer complètement le surnatant et sécher la pastille pendant environ cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 20 microlitres de TE pour dissoudre la pastille.Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Après la préparation de la chromatine digérée, décongeler tous les échantillons sur la glace. Ajouter 1200 microlitres du tampon de dilution ChIP préparé complété par pic pour diluer la chromatine digérée à la concentration de cinq microgrammes par 500 microlitres.Ajouter cinq microlitres de la chromatine digérée diluée à un tube à vis de 1,5 millilitre comme échantillon d’entrée. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres chacun de la chromatine digérée diluée à un tube à vis de 1,5 millilitre comme échantillon d’immunoprécipitation.Ajouter deux microgrammes d’anticorps à chaque tube et fermer le bouchon. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit en mélangeant doucement sur une plate-forme berçante. Le matin, ajouter 30 microlitres de protéines G de qualité ChIP à chaque tube.Incuber les tubes à nouveau à quatre degrés Celsius pendant deux heures avec un mélange doux. Après cela, tournez le tube brièvement à deux à 3000 fois g, et placez le tube dans un support en polyéthylène contenant des aimants au néodymium pendant une minute. Ensuite, retirez soigneusement le surnatant par aspiration.Ensuite, ajoutez 0,5 millilitres de tampon de lavage complexe immunitaire à faible teneur en sel à chaque tube. Vortex brièvement le tube pour disperser les perles. Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avec un mélange doux sur une plate-forme berçante.Répétez le lavage avec le complexe immunitaire à haute teneur en sel et le complexe immunitaire au chlorure de lithium selon le manuscrit. Après avoir complètement enlevé le supernatant restant, ajouter 150 microlitres de tampon d’élitution au tube. Vortex le tube pour disperser les perles complètement.Fermez le bouchon et incubez le tube à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour bien disperser les perles, mélanger par inversion toutes les cinq minutes. Pendant l’incubation, préparer un tube à vis de 1,5 millilitre et ajouter six microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et deux microlitres de proteinase K.Thaw l’échantillon d’entrée de 1 % précédemment préparé sur la glace.Ajouter 150 microlitres de tampon d’élitution, six microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et deux microlitres de proteinase K à l’échantillon d’entrée. Après l’incubation du tube contenant des perles, tournez vers le bas. Placez le tube dans un support magnétique pendant une minute, et transférez le supernatant dans le tube à vis contenant du chlorure de sodium et des microphotographes proteinase K.Representative de granulés cellulaires reliés entre eux avant et après que la sonication montre des différences distinctes.Sans sonication, la structure cellulaire reste intacte, ce qui indique que la chromatine est présente dans les noyaux. Une brève sonication brise la structure cellulaire. La chromatine croisée a été préparée à partir de cellules VCaP et digérée avec diverses quantités de MNase.Sans ajouter MNase, un modèle de frottis avec un poids moléculaire très élevé est apparu. L’ajout de MNase a donné un modèle d’échelle, ce qui montre que MNase digère internucléosome. Seule la condition qui a produit des fragments de chromatine jusqu’à 900 bp peut être considérée comme une bonne digestion, tandis qu’un modèle de digestion inapproprié montre une surdigestion principalement entraîné une production mononucléosome.Le modèle de digestion de la chromatine dans les cellules VCaP indiquent une bonne digestion de la chromatine. L’occupation la plus élevée de H3K4methyl3 a été observée autour de 0,5 kilobase et d’un kilobase en amont de l’AR-TSS. Toutefois, les régions situées à 19 kilobases et à huit kb en amont et à 12 kilobases en aval de l’AR-TSS avaient peu d’occupation du H3K4methyl3, ce qui indique qu’elles peuvent être utilisées comme régions négatives.La détermination de l’état de digestion de MNase est la plus importante. Maintenez le nombre de cellules, le volume tampon et la quantité d’enzymes dans chaque expérience. La condition doit être identifiée pour chaque type de cellule.Nous pouvons effectuer le séquençage de ChIP pour l’occupation globale des facteurs et des captures de conformation de chromatine pour déterminer les interactions entre les lésions génomiques distales. Cette méthode pourrait révéler les mécanismes de processus de la transcription. L’essai de ChIP est un outil puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle, mais il est lourd et non reproductible.Notre méthode encourage les chercheurs à effectuer l’analyse régulièrement et facilement.

Research

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Genetics

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