Name: chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי Genentech תמלוגים על עיר התקווה. עבודה זו אינה נתמכת בכללותה או בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות.

1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>להפוך 18.5% הפתרון פאראפורמלדהיד (בשיא). הוסף 0.925 g של הלאנד, 4.8 mL של מים (להשתמש במים אולטרה מטוהרים ברחבי הפרוטוקול) ו 35 μL של 1 M KOH בצינור פלסטיק באורך 50 mL. סגרו את המכסה בחוזקה והחום את הצינור בגביע 400-600 mL המכיל כ 200 מ ל של מים באמצעות מיקרוגל. להסיר את הצינור לפני המים מתחיל ר...

<ol>
	<li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+initiation:+a+structural+view.">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40:+identification+of+new+viral+gene+product.">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin:+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA.">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li><li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Genomic+DNA.">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).</li><li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation:+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate.">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation+of+DNA.">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells.">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li><li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex.">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines.">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).</li><li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin.">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li><li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells.">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li></ol>

למרות שsonication משמש בדרך כלל להשגת כרומטין מפוצלים, היא גוזלת זמן ומסורבלת כדי לזהות תנאים שאינם משתמשים. בפרוטוקול זה, השתמשנו בעיכול MNase מכיוון שעיכול האנזים צריך להיות קל יותר לזהות תנאים הניתנים לשימוש. צעד קצר sonication לאחר העיכול MNase (ראה שלב 2.2) היה הכרחי כדי לשבור את קרום התא ולשחרר את כרו...

ביטוי הגנים בתאי היונקים הוא הדוק ומוסדר באופן דינמי, ותמלול הוא אחד משלבי המפתח. תמלול הגנים מוסדר בעיקר על ידי שעתוק והאבנים. גורם שעתוק הוא חלבון הנקשר רצפי DNA ספציפיים ושולט תמלול הגנים. גורמים אלה או לקדם או לעכב את הגיוס של RNA פולימראז II (PolII), אשר יוזם סינתזה mRNA מ-DNA גנומית כתבנית1. היסטון שינויים כגון מרחרחון ומתילציה של שאריות זנב האבן באופן חיובי ולרעה להשפיע על תמלול הגנים על ידי שינוי מבנה כרומטין2. מאחר ששינויים בביטוי הגנים משפיעים על ההקשר הסלולארי, חיוני לבחון את המנגנונים המולקולריים שעליהם מוסדר התמלול.
עד היום, מספר שיטות לחקירת התקנה של שעתוק גנים זמינים. שינוי ביכולת ניידות אלקטרופיניטית (EMSA), המכונה גם שיטת שינוי ג'ל, משמשת לניתוח אינטרקציה של חלבון DNA3. תמצית גרעינית מתאי העניין היא מודמת עם איזוטופ רדיואקטיבי (לדוגמה, 32P)-התווית בדיקת DNA ו אלקטרופורציםעל ג'ל פוליאקרילמיד. הautoradiogram שלו מראה כי מורכבות ה-DNA-חלבון נודד לאט יותר מאשר הגשוש ב ג'ל. בנוכחות נוגדן נגד החלבון, מתחם ה-DNA-חלבון-נוגדן נודד בג לאט יותר מאשר מתחם ה-DNA-חלבון. הלהקה הזאת שהוזזה מגלה את הכריכה המסוימת בין הדנ א לחלבון. עם זאת, EMSA קובע רק אינטראקציה ספציפית ל-DNA-חלבון במערכת ללא תא, ולכן היא עדיין אינה ידועה אם האינטראקציה שולטת בתמלול של תאים חיים. שיטת העיתונאי החולף, המכונה בדרך כלל בשיטת לוציפראז, פותחה כדי לטפל בתקנות ביטוי גנים בתאים. בדרך כלל, אזור גנומית במעלה הזרם של גן של עניין מוכנס לתוך הפלבאמצע הכתב, מנוכר באופן מבוקר לתוך תאים, ופעילות העיתונאי נמדד. מגוון של מוטציות מחיקה מאפשר זיהוי של אזורים האחראים לתקנות גנים. אף-על-פי שיטת העיתונאי הוא כלי שימושי לזיהוי גורמי התמלול ומחייב רצפי DNA שליטה שעתוק, שיטה זו יש חיסרון משמעותי כי הכתב פלבאמצע הוא ללא מבנה כרומטין ואינו משקף "אמיתי" מכונות שעתוק. בנוסף, לא ניתן לקבוע שינויים בשינויים באבן במערכת.
הפיתוח של שיטת כרומטין immunoprecipitation (שבב) היה מבוסס על הדוחות של ג'קסון וכלקלי כי "תא שלם" קיבעון עם פורמלדהיד שימר מבנה כרומתין4,5. מאז, טכניקות רבות הקשורות פותחו והשתפרו6. ב השבב assays, תאים קבועים עם פורמלדהיד כדי להצליב קישור DNA ו חלבונים. , הכרוטין מפוצלת. ואז מimmunoprecipitated עם נוגדנים מעניינים , הקומפלקס החיסוני נשטף. והדנ א מטוהר ה-PCR הגברה עם מטרה ממוקדת באזור מסוים של הגנום חושף את התפוסה של חלבונים של עניין בגנום.
למרות שבב הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות את האינטראקציות של חלבונים כגון שעתוק גורמים ושונה יסטוניים עם ה-DNA, השיטה כרוכה בקשיים מסוימים, כגון שלב הפיצול כרומטין, בפועל. Sonication שימש רבות לחיתוך כרומטין; עם זאת, מסורבל לזהות תנאים שאינם מזהים. טיפול מmicrococcal (MNase) הוא שיטה חלופית להטיה של כרומטין. MNase הוא אנדו-אקסאוכירות שעיכול כפול תקוע, יחיד תקועים, מעגלי ו-DNA ליניארי ו-RNA. קל יחסית לקבוע את התנאים, כולל הכמויות של כרומטין ואנזימים, טמפרטורה וזמן דגירה, עבור פיצול כרומטין אופטימלי. הצלחנו לשנות ולפשט את הפרוטוקולים הקיימים, והקמנו שיטה ישירה וברורה. נייר זה מספק את הפרוטוקול עבור שיטת השבב באמצעות MNase בתאי היונקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1643px;" width="1642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td style="width:793px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2 M KCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2X iQ SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1706862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:557px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Research Product International</td>
			<td style="width:119px;">A20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">ChIP-grade protein G magnetic beads</td>
			<td style="width:173px;">Cell signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">9006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-153</td>
			<td>Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Gel Loading Dye Purple (6X)</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycine</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycogen</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1767</td>
			<td>19-22 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">High Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-155</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Histone H3K4me3 antibody (pAb)</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">LiCl Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-156</td>
			<td>Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Low Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-154</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Magna GrIP Rack (8 well)</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-400</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Micrococcal nuclease</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0247S</td>
			<td>comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 &#176;C) and 100 x BSA (10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:173px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Normal rabbit IgG</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">PIPES</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Real-time PCR system</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">CFX96, C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">SDS</td>
			<td style="width:173px;">Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">100155</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">sodium acetate</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sonicator equipped with a microtip probe</td>
			<td style="width:173px;">QSONICA</td>
			<td style="width:119px;">Q700</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15593031</td>
			<td>pH 8.05</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells

כדי לבטא פנוטיפים סלולריים באורגניזמים, תאים חיים לבצע ביטוי גנים בהתאם, ו הטרנססקריפט תוכניות לשחק תפקיד מרכזי בביטוי גנים. מכונות הסלולר והשינויים הכרומטין שלהם מתאמים לווסת את התמלול. כדי לנתח את הרגולציה ברמה המולקולרית, מספר שיטות נסיוניות כגון משמרת ניידות אלקטרופיניטית, כתב ארעי וכרומטין immunoprecipitation (שבב) בחני זמינים. אנו מתארים שינויים שבב שונה בפירוט במאמר זה בשל יתרונותיה של הצגת ישירות שינויים היסטון ואת האינטראקציות בין חלבונים DNA בתאים. אחד משלבי המפתח בתוך שיטת שבבים מוצלחת הוא הטיית כרומטין. למרות שsonication משמשת בדרך כלל לחיתוך כרומטין, קשה לזהות תנאים הנמצאים בשימוש. במקום הטיית כרומטין על ידי sonication, אנו מנוצל העיכול אנזימטיות עם מmicrococcal נוקלאז (mnase) כדי לקבל תוצאות לאחר מכן. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול שיטת שימוש ישירה של שבב באמצעות MNase.

עיכול כרומטין הוא אחד השלבים החשובים לצורך שיטת השבב. השתמשנו בפקודה MNase כדי לעכל כרומטין כדי לקבל תערובת של נוקלאוטיי מיעוט. בשלב העיכול של MNase, MNase יכול לעבור את הקרום הגרעיני לעכל כרומטין. עם זאת, כרומטין מתעכל לא יכול לעבור את הקרום נשאר גרעינים. כדי לשחרר את כרומטין מתעכל מן הגרעינים, sonic...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

בפרוטוקול זה, אנו יכולים לזהות את האינטראקציות בין חלבונים ל- DNA, ולחשוף את ויסות שעתוק של הגן. זה עוזר להבין את המנגנונים המולקולריים בתאים. אנו משנים את הפרוטוקולים הקיימים מראש ולאחר מכן קובעים פרוטוקולי תדאה ברורים וברורים יותר.אתה פשוט בצע את הפרוטוקול מהשצעד הראשון, כך ההתרגם יכול להיעשות בהצלחה. להכנת כרומטין מקושר, במכסה המנוע של אדים, הוסיפו ארבעה מיליליטר של 1%VCaP תא תרבות מדיה ו 0.229 מיליליטר של 18.5% PFA לצלחת שישה סנטימטרים. בעדינות מערבל את המנה כדי להפיץ את PFA באופן שווה.דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 10 דקות. לאחר מכן, מוסיפים 0.47 מיליליטר של תסנובת גליצין 1.25 טוחן לצלחת, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי לעצור הצלבה נוספת. לאחר שטיפת התאים על פי כתב היד, לגרד את התאים ולהעביר את ההשעיה התא צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה הצינור עם המתלה התא ב 3, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את גלולת התא. השתמש פיפטה כדי להסיר לחלוטין את PBS. רשום את מספר התא לצינור, ואחסן את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לבצע תות תא, תחילה להפשיר את כדורי תא VCAP המאוחסנים על קרח. הוסף 300 microliters של מאגר תות התא ChIP מוכן בתוספת PIC לכל צינור, ו resuspend גלולה ביסודיות. מערבולת הצינור במשך 15 שניות, ו דגירה ההשעיה על קרח במשך 10 דקות.צנטריפוגה ב 9, 000 פעמים g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין, ולהוסיף 300 microliters של מאגר עיכול MNase כדי לעכל מחדש את גלולה. לדלל MNase עם חיץ עיכול MNase בצינור 1.5 מיליליטר להניב 50 יחידות ג'ל למיקרוליטר.מוסיפים את MNase מדולל ההשעיה, ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס בדיוק 10 דקות. הגדר את הערבוב על ידי היפוך כל 2 1/2 דקות. כדי לסיים את עיכול MNase, להוסיף 30 microliters של EDTA 0.5-טוחן ב pH שמונה, ומערבולת לזמן קצר.לאחר הדגירה במשך חמש דקות על קרח, צנטריפוגה ב 9, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין, ולתלות מחדש את גלולה ב 300 microliters של מאגר דילול ChIP מוכן בתוספת PIC. לאחר מכן, על sonicator מצויד בדיקה microtip, להגדיר את תנאי sonication משרעת שתיים, זמן מעובד 15 שניות, דופק על חמש שניות, ואת הדופק כבוי 30 שניות.Sonicate ההשעיה על קרח. צייר מיקרוליטר אחד של ההשעיה, ונקודה על זכוכית שקופית. תחת מיקרוסקופ, להתבונן כדי להבטיח כי מבנה התא הוא כמעט שבור.צנטריפוגה הצינור ב 9, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר. שמור 20 microliters של כרומטין מתעכל בצינור בורג 1.5 מיליליטר להמשך טיפול, ולאחסן את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, בכל צינור בורג 1.5 מיליליטר, להוסיף 75 microliters של מים, ארבעה microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן, ומיקרוליטר אחד של proteinase K.To להסיר crosslinking בין חלבון ל- DNA, להוסיף 20 microliters של כרומטין מתעכל מכל מצב עיכול MNase לצינור בורג.סוגרים את המכסה בחוזקה, מערבבים לחלוטין, ומודרים את הצינור ב 65 מעלות צלזיוס לילה. בבוקר, לאחר צנטריפוגה הצינור ב 2 עד 3, 000 פעמים גרם במשך כמה שניות, להוסיף 100 microliters של PCI. וורטקס במרץ כדי ליצור אמולסיה.צנטריפוגה הצינור שוב במהירות מקסימלית במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל תנאי. הוסף 100 מיקרוליטרים של PCI לצינור אחד.הוסף 10 microliters של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2 ושני microliters של גליקוגן לצינור אחר. מהצינור שנלקח מהצנטריפוגה, צייר בזהירות את השלב העליון המכיל DNA, והוסף אותו לצינור המכיל PCI. מערבולת במרץ, צנטריפוגה הצינור במהירות המרבית במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להעביר את השלב העליון לצינור המכיל נתרן אצטט וגליקוגן שהוכן בעבר. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של אתנול, ומערבבים לפי היפוך. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה הצינור במהירות מקסימלית במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אשר את כדורי בתחתית הצינור. בזהירות להסיר את supernatant כדי לא להפריע את גלולה, ולהוסיף 500 microliters של 70% אתנול.צנטריפוגה הצינור במהירות מקסימלית במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את העל-טבעי לחלוטין, ומייבשים את גלולת הכדור במשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של TE כדי להמיס את גלולה.למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. לאחר הכנת כרומטין מתעכל, להפשיר את כל הדגימות על קרח. הוסף 1200 microliters של מאגר דילול ChIP מוכן בתוספת PIC כדי לדלל כרומטין מתעכל לריכוז של חמישה מיקרוגרם לכל 500 microliters.הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של הכרומטין המעוכל המדולל לצינור בורג של 1.5 מיליליטר כדגימה לקלט. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטרים כל אחד הכרומטין מתעכל מדולל צינור בורג 1.5 מיליליטר כדגימה immunoprecipitation.מוסיפים שני מיקרוגרם של נוגדן לכל צינור, וסגרו את המכסה. הדגירה את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס לילה עם ערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה. בבוקר, להוסיף 30 microliters של חלבון כיתה ChIP G חרוזים מגנטיים לכל צינור.דגירה הצינורות שוב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם ערבוב עדין. לאחר מכן, לסובב את הצינור לזמן קצר בשתיים עד 3,000 פעמים g, ולמקם את הצינור במדף פוליאתילן המכיל מגנטים ניאודימיום למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר בזהירות את העל-טבעי על-ידי שאיפה.לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של חיץ כביסה מורכב של מערכת החיסון עם מלח נמוך לכל צינור. בקצרה מערבולת הצינור כדי לפזר את חרוזים. דגירה הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה.חזור על הכביסה עם קומפלקס חיסוני מלח גבוה ותסביך חיסוני ליתיום כלורי על פי כתב היד. לאחר הסרת על-טבעי הנותר לחלוטין, להוסיף 150 microliters של חיץ אלוטיון לצינור. מערבולת הצינור כדי לפזר את חרוזים לחלוטין.סוגרים את הכובע, ו דגירה הצינור ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי לפזר את חרוזים ביסודיות, מערבבים על ידי היפוך כל חמש דקות. במהלך הדגירה, הכינו צינור בורג 1.5 מיליליטר, והוסיפו שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי חמישה טוחנים ושני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K.Thaw מדגם קלט של 1% שהוכן בעבר על קרח.הוסף 150 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון, שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי חמש טוחן, ושני מיקרוליטרים של proteinase K לדגימה קלט. לאחר הדגירה של הצינור המכיל חרוזים, להסתובב למטה. מניחים את הצינור במתלה מגנטי למשך דקה אחת, ומעבירים את העל-טבעי לצינור הברגים המכיל נתרן כלורי ומיקרופוטוגרפים של K.Representative של כדורי תאים מקושרים לפני ואחרי sonication מראים הבדלים ברורים.ללא sonication, מבנה התא נשאר שלם, המציין כי הכרומטין קיים בגרעין. sonication קצר שובר את מבנה התא. כרומטין מקושר הוכן מתאים VCaP מתעכל עם כמויות שונות של MNase.מבלי להוסיף MNase, דפוס מריחה עם משקל מולקולרי גבוה מאוד הופיע. התוספת של MNase נתנה דפוס סולם, מה שמראה כי MNase מעכל internucleosome. רק המצב שייצר שברי כרומטין עד 900 bp יכול להיחשב עיכול תקין, ואילו דפוס עיכול לא הולם מראה overdigestion בעיקר הביא ייצור mononucleosome.דפוס העיכול של כרומטין בתאי VCaP מצביע על עיכול תקין של כרומטין. התפוסה הגבוהה ביותר של H3K4methyl3 נצפתה סביב 0.5 קילו-בבס וקילובאס אחד במעלה הזרם של AR-TSS. אזורים הממוקמים ב 19 קילו-בבס ושמונה kb במעלה הזרם ו 12 קילו-בוקס במורד הזרם של AR-TSS, עם זאת, היה תפוסה מועטה של H3K4methyl3, המציין כי אלה יכולים לשמש כאזורים שליליים.קביעת מצב עיכול MNase היא החשובה ביותר. שמור על מספר תא, נפח חיץ וכמיית אנזים בכל ניסוי. יש לזהות את התנאי עבור כל סוג תא.אנחנו יכולים לבצע רצף ChIP עבור תפוסה גלובלית של הגורמים לכידת קונפורמציה כרומטין כדי לקבוע את האינטראקציות בין נגעים גנומיים דיסטליים. שיטה זו יכולה לחשוף מנגנוני תהליך של התמלול. חקירה של ChIP היא כלי רב עוצמה לחקירת רגולציה שעתוק, אך היא מסורבלת ולא ניתנת לשחזור.השיטה שלנו מעודדת חוקרים לבצע את הבדיקות באופן שגרתי וקל.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...