Name: chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

Denna forskning stöds av Genentech royalties till City of Hope. Detta arbete stöds inte helt eller delvis av National Institutes of Health.

1. beredning av reagenser
<ol><li>Gör 18,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning. Tillsätt 0,925 g PFA, 4,8 mL vatten (Använd ultrapurified vatten i hela protokollet) och 35 μL av 1 M KOH i en 50 mL konisk plaströr. Stäng locket tätt och värm röret i en 400-600 mL glasbägare som innehåller cirka 200 mL vatten med hjälp av en mikrovågsugn. Ta bort röret innan vattnet börjar koka och Vortexblanda röret för att lösa upp PFA. Låt PFA svalna till rumstemperatur och förvara på isen. Anmärkning:</st...

<ol>
	<li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II+transcription+initiation:+a+structural+view.">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40:+identification+of+new+viral+gene+product.">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li><li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin:+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA.">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li><li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Genomic+DNA.">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).</li><li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation:+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate.">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+Precipitation+of+DNA.">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells.">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li><li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex.">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines.">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).</li><li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin.">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li><li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells.">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li></ol>

Även ultraljudsbehandling används ofta för att få fragmenterad kromatin, det är tidskrävande och besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. I detta protokoll, vi använde MNase matsmältning eftersom enzym nedbrytning bör vara lättare att identifiera reproducerbara villkor. En kort ultraljudsbehandling steg efter MNase matsmältning (se steg 2,2) var nödvändigt att bryta cellmembranet och att frigöra den smälta kromatin. Därför bör ultraljudsbehandling makten i vårt protokoll vara så låg...

Genuttryck i däggdjursceller är tätt och dynamiskt reglerad, och transkription är en av de viktigaste stegen. Gentranskription regleras huvudsakligen av transkriptionsfaktorer och histones. En transkriptionsfaktor är ett protein som binder till specifika DNA-sekvenser och kontrollerar gentranskription. Dessa faktorer antingen främja eller hämma rekryteringen av RNA-polymeras II (polii), som initierar mRNA syntes från genomisk DNA som mall1. Histonmodifikationer såsom acetylering och metylering av histonstjärtrester positivt och negativt påverka gentranskription genom att ändra kromatin struktur2. Eftersom förändringar i genuttryck påverkar det cellulära sammanhanget är det viktigt att undersöka de molekylära mekanismer genom vilka transkription regleras.
Hittills finns det flera metoder för att undersöka regleringen av gentranskription. Electrophoretic Mobility Shift assay (EMSA), även kallad en gel Skift analys, används för att analysera en protein-DNA interaktion3. Ett kärn extrakt från celler av intresse inkuberas med en radioaktiv isotop (till exempel 32P)-märkt DNA-sond och electrophoresed på en polyakrylamidgel. Dess autoradiogram visar att DNA-proteinkomplexet migrerar långsammare än sonden i en gel. I närvaro av en antikropp mot proteinet, DNA-protein-antikroppskomplexet migrerar i en gel långsammare än DNA-proteinkomplexet. Detta superskiftade band avslöjar specifik bindning mellan DNA och protein. Emellertid, EMSA endast bestämmer en specifik DNA-proteininteraktion i ett cellfritt system, och därför är det fortfarande okänt om interaktionen styr transkription i levande celler. Transitorisk reporter analys, vanligen kallad luciferas reporter assay, utvecklades för att hantera gen uttrycks reglering i celler. Typiskt, en uppströms genomisk region av en gen av intresse sätts in i en reporter plasmid, transitivt transfekterade i celler, och reporter aktiviteten mäts. En mängd olika raderingsmutanter gör det möjligt att identifiera regioner som är ansvariga för genreglering. Även om en reporter analys är ett användbart verktyg för att identifiera transkriptionsfaktorer och bindande DNA-sekvenser kontrollera transkription, denna metod har en stor nackdel i att en reporter plasmid är fri från kromatin struktur och inte återspeglar "riktiga" maskiner för transkription. Dessutom kan ändringar i histonmodifieringar inte bestämmas av systemet.
Utvecklingen av kromatin immunoprecipitation (chip) metoden baserades på Jackson och chalkley rapporter att "hela cellen" fixering med formaldehyd bevarade kromatin struktur4,5. Sedan dess har många relaterade tekniker utvecklats och förbättrats6. I Spånanalyser fixeras celler med formaldehyd för att korslänka DNA och proteiner. Den kromatin är fragmenterad och sedan immunopreciated med antikroppar av intresse. Immun komplexet tvättas och DNA renas. PCR-förstärkning med primers riktade till en viss region av genomet avslöjar beläggning av proteiner av intresse i genomet.
Även chip är ett kraftfullt verktyg för att identifiera samspelet mellan proteiner som transkriptionsfaktorer och modifierade histoner med DNA, metoden innebär vissa svårigheter, såsom en kromatin fragmentering steg, i praktiken. Ultraljudsbehandling har ofta används för klippning kromatin; Det är dock besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. Micrococcal Nuclease (MNase) behandling är en alternativ metod för kromatin klippning. MNase är en endo-exonukleas som smälter dubbelsträngad, enkelsträngad, cirkulär och linjär DNA och RNA. Det är relativt lätt att bestämma villkoren, inklusive mängden kromatin och enzym, temperatur, och inkubering tid, för optimal kromatin fragmentering. Vi ändrade och förenklade de befintliga protokollen, och vi etablerade en enkel och reproducerbar metod. Detta dokument innehåller protokollet för en ChIP-analys med hjälp av MNase i däggdjursceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1643px;" width="1642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td style="width:793px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2 M KCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">2X iQ SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1706862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">50 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:557px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Research Product International</td>
			<td style="width:119px;">A20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">ChIP-grade protein G magnetic beads</td>
			<td style="width:173px;">Cell signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">9006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-153</td>
			<td>Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Gel Loading Dye Purple (6X)</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycine</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Glycogen</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1767</td>
			<td>19-22 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">78445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">High Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-155</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Histone H3K4me3 antibody (pAb)</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">LiCl Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-156</td>
			<td>Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Low Salt Immune Complex Wash Buffer</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-154</td>
			<td>Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Magna GrIP Rack (8 well)</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">20-400</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Micrococcal nuclease</td>
			<td style="width:173px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0247S</td>
			<td>comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 &#176;C) and 100 x BSA (10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:173px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Normal rabbit IgG</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">PIPES</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Real-time PCR system</td>
			<td style="width:173px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">CFX96, C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody</td>
			<td style="width:173px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">39749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">SDS</td>
			<td style="width:173px;">Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">100155</td>
			<td>Electropheresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">sodium acetate</td>
			<td style="width:173px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sonicator equipped with a microtip probe</td>
			<td style="width:173px;">QSONICA</td>
			<td style="width:119px;">Q700</td>
			<td style="width:793px;">Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15593031</td>
			<td>pH 8.05</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay using micrococcal nucleases in mammalian cells

För att uttrycka cellulära fenotyper i organismer, levande celler utföra genuttryck i enlighet därmed, och transkriptionella program spelar en central roll i genuttryck. Den cellulära transcriptionella maskiner och dess kromatin modifiering proteiner samordna för att reglera transkription. För att analysera transkriptionell reglering på molekylär nivå finns flera experimentella metoder såsom elektroforetisk rörlighet Skift, övergående reporter och kromatin immunoprecipitation (ChIP) analyser. Vi beskriver en modifierad chip analys i detalj i denna artikel på grund av dess fördelar i direkt visar Histon modifieringar och samspelet mellan proteiner och DNA i celler. En av de viktigaste stegen i en lyckad ChIP-analys är kromatin klippning. Även ultraljudsbehandling används ofta för klippning kromatin, det är svårt att identifiera reproducerbara förhållanden. Istället för klippning kromatin av ultraljudsbehandling, utnyttjade vi enzymatisk matsmältning med micrococcal Nuclease (mnase) för att få mer reproducerbara resultat. I den här artikeln ger vi en enkel ChIP assay protokoll med MNase.

Smälta kromatin är en av de viktigaste stegen för en ChIP-analys. Vi använde MNase att smälta kromatin för att få en blandning av nukleosome oligomerer. I MNase uppslutning steg, MNase kan gå igenom kärn membranet och smälta kromatin. Men den smälta kromatin kan inte gå igenom membranet och förblir i kärnorna. För att frigöra den smälta kromatin från atomkärnor, kort ultraljudsbehandling behövs. Figur 1a visar mikrofotografier före och efter ultraljudsbehandling av VCAP ...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära mekanismerna för genreglering. Metoden innebär dock svårigheter att få reproducerbar kromatinfragmentering genom mekanisk klippning. Här ger vi ett förbättrat protokoll för en ChIP-analys med enzymatisk matsmältning.

Kromatin immunoprecipitation analys med hjälp av Micrococcal nukleaser i däggdjursceller

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

I detta protokoll kan vi identifiera samspelet mellan proteiner och DNA, avslöjar transkriptional reglering av genen. Detta hjälper till att förstå de molekylära mekanismerna i cellerna. Vi ändrar de redan existerande protokollen och upprättar sedan ett okomplicerat och tydligare analysprotokoll.Du bara helt enkelt följa protokollet från det första steget så att analysen kan göras med framgång. För att förbereda crosslinked kromatin, i en rök huva, tillsätt fyra milliliter av 1%VCaP cellodling media och 0,229 milliliter på 18,5%PFA till en sex centimeter maträtt. Snurra försiktigt skålen för att fördela PFA jämnt.Inkubera i rumstemperatur i exakt 10 minuter. Tillsätt sedan 0,47 milliliter 1,25 molar glycinlösning till skålen och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter för att stoppa ytterligare korsbindning. Efter att ha tvättat cellerna enligt manuskriptet, skrapa cellerna och överföra cellupphängningen till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Centrifugera röret med cellupphängningen vid 3, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur för att återvinna cellpelleten. Använd en pipett för att helt ta bort PBS. Registrera cellnumret per rör, och förvara cellpelleten vid minus 80 grader Celsius.För att utföra celllys, tina först de lagrade VCaP-cellpelletsen på is. Tillsätt 300 mikroliter av den beredda ChIP-cellens lysbuffert kompletterad med PIC till varje rör, och resuspend pelleten noggrant. Vortexa röret i 15 sekunder, och inkubera suspensionen på is i 10 minuter.Centrifugera vid 9, 000 gånger g i tre minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och tillsätt 300 mikroliter av MNase digestionsbuffert för att återanvända pelleten. Späd MNase med MNase digestionsbuffert i ett 1,5-milliliter rör för att ge 50 gelenheter per mikroliter.Tillsätt den utspädda MNase till suspensionen, och inkubera vid 37 grader Celsius i exakt 10 minuter. Ställ in blandningen genom inversion var 2 1/2 minut. För att avsluta MNase matsmältningen, tillsätt 30 mikroliter av 0,5-molar EDTA vid pH åtta, och virvel kort.Efter inkubation i fem minuter på is, centrifug vid 9, 000 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och resuspend pelleten i 300 mikroliter av den beredda ChIP-spädningsbufferten kompletterad med PIC. Sedan, på en sonicator utrustad med en mikrotopp sond, ställa in ultraljudsbehandling villkor till amplitud två, bearbetad tid 15 sekunder, puls PÅ fem sekunder, och puls OFF 30 sekunder.Sonikera suspensionen på is. Rita en mikroliter av fjädringen, och plats på ett objektglas. Under ett mikroskop, observera för att säkerställa att cellstrukturen är nästan bruten.Centrifugera röret vid 9, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius, och överför supernatanten till ett nytt 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Spara 20 mikroliter av det smälta kromatin i en 1,5-milliliter skruvrör för ytterligare behandling, och lagra resten på minus 80 grader Celsius. Först, i varje 1,5-milliliter skruvrör, tillsätt 75 mikroliter vatten, fyra mikroliter av fem-molar natriumklorid, och en mikroliter proteinas K.To ta bort tvärbindning mellan protein och DNA, tillsätt 20 mikroliter av rötat kromatin från varje MNase matsmältningen villkor till ett skruvrör.Stäng locket tätt, blanda helt och inkubera röret i 65 grader Celsius över natten. På morgonen, efter centrifugering röret vid två till 3, 000 gånger g i några sekunder, tillsätt 100 mikroliter pci. Vortex kraftfullt för att bilda en emulsion.Centrifugera röret igen vid högsta hastighet i 30 sekunder vid rumstemperatur. Sedan, förbereda två 1,5-milliliter mikrocentrifugrör per villkor. Lägg till 100 mikroliter pci till ett rör.Tillsätt 10 mikroliter av tre-molar natriumacetat vid pH 5.2 och två mikroliter av glykogen till ett annat rör. Från röret tas ut ur centrifug, försiktigt dra den övre fasen som innehåller DNA, och lägga till den i röret som innehåller PCI. Vortex kraftigt, och centrifug röret vid högsta hastighet i 30 sekunder vid rumstemperatur.Därefter överför den övre fasen till röret som innehåller natriumacetat och glykogen beredd tidigare. Tillsätt 250 mikroliter av etanol, och blanda genom inversion. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.Centrifugera röret vid högsta hastighet i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Bekräfta pellets på botten av röret. Ta försiktigt bort supernatanten för att inte störa pelleten, och tillsätt 500 mikroliter med 70%etanol.Centrifugera röret vid högsta hastighet i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och torka pelleten i cirka fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt sedan 20 mikroliter TE för att lösa upp pelleten.Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en UV-spektrofotometer. Efter beredning av smält kromatin, tina alla prover på is. Tillsätt 1200 mikroliter av den beredda ChIP-spädningsbufferten kompletterad med PIC för att späda ut rötskromatin till koncentrationen av fem mikrogram per 500 mikroliter.Tillsätt fem mikroliter av det utspädda rötade kromatin till ett 1,5-milliliter skruvrör som ett ingående prov. Förvara provet vid minus 80 grader Celsius. Tillsätt 500 mikroliter var av det utspädda rötade kromatin till ett 1,5-milliliter skruvrör som ett immunoprecipitationsprov.Tillsätt två mikrogram antikroppar till varje rör, och stäng locket. Inkubera rören i fyra grader Celsius över natten med försiktigt blandning på en gungande plattform. På morgonen, tillsätt 30 mikroliter av ChIP-grade protein G magnetiska pärlor till varje rör.Inkubera rören igen vid fyra grader Celsius i två timmar med skonsam blandning. Efter det, snurra ner röret kort vid två till 3, 000 gånger g, och placera röret i en polyeten rack som innehåller neodymmet magneter i en minut. Sedan försiktigt ta bort supernatanten genom aspiration.Därefter lägger du till 0,5 milliliter lågsalt immunkomplex tvättbuffert till varje rör. Kort virvel röret för att skingra pärlorna. Inkubera röret i fyra grader Celsius i fem minuter med skonsam blandning på en gungande plattform.Upprepa tvätten med högsalt immunkomplex och litiumklorid immunkomplex enligt manuskriptet. När du har tagit bort resterande supernatant helt, tillsätt 150 mikroliter av elueringsbuffert till röret. Vortexa röret för att skingra pärlorna helt.Stäng locket, och inkubera röret i 65 grader Celsius i 30 minuter. För att skingra pärlorna noggrant, blanda genom inversion var femte minut. Under inkubationen, förbereda en 1,5-milliliter skruvrör, och tillsätt sex mikroliter av fem-molar natriumklorid och två mikroliter proteinas K.Thaw den 1%input provet tidigare beredd på is.Tillsätt 150 mikroliter elueringsbuffert, sex mikroliter av fem-molarnatriumklorid, och två mikroliter proteinas K till ingående prov. Efter inkubationen av röret som innehåller pärlor, snurra ner. Placera röret i ett magnetiskt rack i en minut, och överför supernatanten till skruvröret som innehåller natriumklorid och proteinas K.Representative mikrobildsgrafier av korslänkade cellpellets före och efter ultraljudsbehandling visar distinkta skillnader.Utan ultraljudsbehandling förblir cellstrukturen intakt, vilket indikerar att kromatin finns i kärnorna. En kort ultraljudsbehandling bryter cellstrukturen. Crosslinked kromatin var beredd från VCaP celler och smält med olika mängder MNase.Utan att lägga till MNase, ett utstryk mönster med en mycket hög molekylvikt dök upp. Tillsats av MNase gav en stege mönster, som visar att MNase smälter internukleosom. Endast det villkor som producerade kromatin fragment upp till 900 bp kan anses vara korrekt matsmältning, medan en olämplig matsmältning mönster visar översmältning främst resulterade i mononucleosome produktion.Matsmältningsmönster av kromatin i VCaP celler indikerar korrekt matsmältning av kromatin. Den högsta beläggningen av H3K4methyl3 observerades runt 0,5 kilobase och en kilobase uppströms AR-TSS. Regioner som ligger på 19 kilobase och åtta kb uppströms och 12 kilobase nedströms AR-TSS, hade dock liten beläggning av H3K4methyl3, vilket tyder på att dessa kan användas som negativa regioner.Att bestämma MNase matsmältningen tillstånd är viktigast. Underhåll cellnummer, buffertvolym och enzymmängd i varje experiment. Villkoret måste identifieras för varje celltyp.Vi kan utföra ChIP sekvensering för globala beläggning av de faktorer och kromatin konformation fångar att bestämma interaktioner mellan distala genomiska skador. Denna metod kunde avslöja processmekanismer av transkriptionen. ChIP-analys är ett kraftfullt verktyg för att undersöka transkriptionell reglering, men det är besvärligt och inte reproducerbart.Vår metod uppmuntrar forskare att utföra analysen rutinmässigt och enkelt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Kromatinimmunutfällning (ChIP) i mus-T-celllinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-assisted isolering av reglerande element till åtgärd kromatin tillgänglighet i däggdjursceller

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation av murina Brun fettvävnad

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Upptäcka CsgD regulatoriska mål i salmonella biofilm med kromatin immunoprecipitation och högt dataflöde sekvensering (chip-SEQ)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Högupplöst kartläggning av protein-DNA-interaktioner i musstamcellsbaserade nervceller med chromatinimmunprecipitation-exonukleas (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...