Name: sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing
Uploaded: 2019-06-03T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

ويشكر المؤلفان اليسون غروسيث علي القراءة الناقدة للمخطوطة. وقد حظي هذا العمل بدعم مالي من الوزارة الاتحادية المانيه للاغذيه والزراعة استنادا إلى قرار اتخذه برلمان جمهوريه ألمانيا الاتحادية عن طريق المكتب الاتحادي للزراعة والاغذيه.

<ol>
	<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Shendure, J., Lieberman Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+scope+of+DNA+sequencing.">The expanding scope of DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+next-generation+sequencing+systems.">Comparison of next-generation sequencing systems.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+Next-Generation+Sequencing.">Advancements in Next-Generation Sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).</li><li>Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxford+Nanopore+MinION+Sequencing+and+Genome+Assembly.">Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Ebola+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+entry+requires+the+cholesterol+transporter+Niemann-Pick+C1.">Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1.</a> Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).</li><li>Ndungo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Residue+in+Ebola+Virus+Receptor+NPC1+Influences+Cellular+Host+Range+in+Reptiles.">A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+identifies+a+druggable+host+pathway+essential+for+the+Ebola+virus+life+cycle.">A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle.</a> Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).</li><li>Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexbar+3.0+-+SIMD+and+multicore+parallelization.">Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization.</a> Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+seeds+tame+genomic+sequence+comparison.">Adaptive seeds tame genomic sequence comparison.</a> Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).</li><li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown'+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification.">Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).</li><li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification.">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).</li><li>Keller, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+Sequencing+of+the+Coding+Complete+Influenza+A+Virus+Genome.">Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomic+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Medicine. 7, 99 (2015).</li><li>Castro-Wallace, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+DNA+Sequencing+and+Genome+Assembly+on+the+International+Space+Station.">Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station.</a> Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).</li><li>Goordial, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Field+Sequencing+and+Life+Detection+in+Remote+(79+degrees+26'N)+Canadian+High+Arctic+Permafrost+Ice+Wedge+Microbial+Communities.">In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).</li><li>Runtuwene, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+of+drug-resistance-associated+genes+in+malaria+parasites,+Plasmodium+falciparum.">Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).</li><li>Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+squiggle+to+basepair:+computational+approaches+for+improving+nanopore+sequencing+read+accuracy.">From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy.</a> Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).</li></ol>

TH شارك في برنامج الوصول المبكر نانو تقنيات أكسفورد (ONT) العميل من 2014 إلى 2015 ، وتلقي أجهزه العميل وتدفق الخلايا لدراسة سابقه 7 التي تقوم بها المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات الامريكيه ، مجانا أو بتكاليف مخفضه . وقد دعي من قبل ONT لتقديم جزء من هذا العمل في لندن الدعوة 2015 الاجتماع في لندن, المملكة العربية البريطانية, و ONT سيولي للنقل والاقامه. النسبة للعمل المعروض في هذه المخطوطة ، لم يتم الحصول علي اي فوائد (مثل الاجهزه أو الكواشف بتكلفه مخفضه ، وتكاليف السفر ، وما إلى ذلك) من ONT. AM ، KF و RS ليس لديهم اي شيء للكشف عن.

وعلي مدي العقدين الماضيين ، أصبح تسلسل العينات البيولوجية جانبا متزايد الاهميه من جوانب الدراسات في طائفه واسعه من مجالات المواضيع. وقد زاد تطوير نظم التسلسل من الجيل الثاني علي أساس تسلسل مجموعه كثيفه من ميزات الحمض النووي باستخدام دورات تكراريه من التلاعب الانزيمي والحصول علي البيانات المستندة إلى صوره1 زيادة كبيره في الانتاجيه مقارنه مع تقنيه التسلسل Sanger التقليدية ، ويسمح تحليل عينات متعددة فضلا عن مختلف أنواع الأحماض النووية في عينه معينه في التوازي4. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم أنظمه الجيل الثاني الشائعة الاستخدام ، يتم إنتاج القراءات القصيرة فقط ، وتعتمد كل الانظمه الاساسيه علي المعدات الحساسة والضخمة والمكلفة3،4.
وعلي النقيض من الجيل الثاني من منصات التسلسل ، فان جهاز التسلسل المستخدم في هذا البروتوكول يستند إلى التكنولوجيا النانوه. هنا جزيء الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل يمر من خلال نانو ، مما ادي إلى تشكيل التيار الايونيه التي تتدفق أيضا من خلال نفس النانو ، والتي يمكن قياسها والعودة-ترجمت إلى استنتاج تسلسل جزيء الحمض النووي. ويضفي هذا النهج التسلسلي من الجيل الثالث عددا من المزايا علي النهج الأخرى. المزايا الرئيسية التي ترتبط مباشره بمبدا العمل الفريد لهذه التكنولوجيا هي طول القراءة طويلة جدا المنتجة (قراءه أطوال تصل إلى 8.8 x 105 وقد تم الإبلاغ عن النيوتيودس6) ، والقدرة علي تسلسل ليس فقط الحمض النووي ولكن أيضا [رنا] مباشره, اي كان مؤخرا برهنت ل [إنفلونزا] كامله مورثه17, والقدرة ان يحلل معطيات في [رل-تيم] بما ان هم يكون خلقت, اي يسمح [متاجينميميكس] سريعة اكتشاف الجراثيم ضمن دقائق18. المزايا العملية الاضافيه هي الحجم الصغير للغاية لجهاز التسلسل النانو ، مما يسمح باستخدامه في اي مختبر أو في البعثات الميدانية إلى المواقع النائية19،20، وانخفاض السعر بالمقارنة مع التسلسل الأخرى منصات. من حيث التكاليف الجارية ، مطلوب حاليا خليه تدفق جديده لكل تشغيل التسلسل ، مما يؤدي إلى تكاليف حوالي $1,100 لكل تشغيل للخلية تدفق والمكتبة اعداد الكواشف. ويمكن تخفيض هذه التكاليف في بعض الحالات عن طريق غسل وأعاده استخدام خليه التدفق ، أو عن طريق الترميز والتسلسل عينات متعددة في تشغيل واحد. أيضا ، يتم حاليا اختبار نوع جديد من خليه التدفق بواسطة عدد قليل من المختبرات ، والتي سوف تتطلب استخدام محول خليه تدفق (يسمي "flongle") ، وينبغي ان تقلل بشكل كبير من تدفق الخلية السعر التالي تشغيل التكاليف.
يبقي القصور رئيسيه من نانو تسلسل دقته, مع وحيد يقرا دقه في المدى من 83 إلى 86% يكون يفاد6,21,22, وكثير من الأخطاء يكون سببت بإدماج/حذف ( [ايندولس])5,21. ومع ذلك ، فان عمق القراءة العالية يمكن ان يعوض عن هذه الأخطاء ، واقترحت دراسة حديثه استنادا إلى الاعتبارات النظرية ان عمق القراءة من > 10 قد يزيد من الدقة العامة إلى > 99.8 ٪21. ومع ذلك ، ستكون هناك حاجه إلى مزيد من التحسينات في الدقة ، لا سيما إذا كان من المقرر اجراء التحليل علي مستوي جزيء واحد بدلا من التوصل إلى مستوي تسلسل توافقي. استخدام تكنولوجيا 1D2 كما هو موضح في هذا البروتوكول ، والذي يستند إلى أضافه 1d2 ومحولات الباركود (راجع القسم 5.5) التي تؤدي إلى كل من خيوط جزيء DNA واحد يجري تسلسلها من قبل نفس النانو ، والزيادات قراءه دقه لأنه يمكن استخدام المعلومات من كلا خيوط الحمض النووي لتحديد تسلسل. وعلاوة علي ذلك ، فان استراتيجية الحل البديل التي يمكن متابعتها من أجل الجمع بين مزايا التسلسل النانو (ولا سيما طول القراءة الطويل) مع الدقة العالية لتقنيات التسلسل الأخرى هي استخدام معلومات التسلسل النانو كسقالة ، وهو ثم مصقول باستخدام تسلسل البيانات من منصات أخرى6.
العامل الأكثر اهميه لنجاح البروتوكول المعروض هنا هو نوعيه العينة ، ولا سيما كميه ونوعيه الحمض الريبي المستخرج. التخزين السليم والاستخراج الفوري للمساعدة RNA في تحقيق العائد RNA كافيه. استخدام أنابيب جمع الدم المناسب يسمح لتخزين عينات الدم لمده تصل إلى شهر واحد ، ولكن تخثر الدم يمكن ان يكون مشكله ، وخاصه عندما يتم تخزين عينات في درجات حرارة مرتفعه ، والتي يمكن ان تكون الحالة في ظل ظروف الميدان. والخطوة الحاسمة الثانية هي تضخيم تسلسل الأهداف ، وخاصه في ظل الظروف الميدانية تفاعلات PCR غالبا ما تؤدي اقل بكثير من الظروف المختبرية القياسية7. ولتحقيق هذه الغاية ، فان التصميم التمهيدي الدقيق والتحسين أمر بالغ الاهميه للوصول إلى تضخيم قوي. بالاضافه إلى ذلك ، النهج pcr المتداخلة وهبوط pcr ، كما هو مستخدم في هذا البروتوكول ، يمكن ان تزيد كل من الخصوصية والحساسية لتضخيم الجينات المستهدفة4،7. والواقع ان تجربتنا في ليبريا وغينيا مع هذه التكنولوجيا المتداخلة كانت مطلوبه في الظروف الميدانية بعينات ميدانيه حتى بالنسبة لمجموعات التمهيدي التي سمحت بتضخيم الأهداف من العينات المختبرية وفي ظل الظروف المختبرية مع جولة واحده من PCR (7 والنتائج غير المنشورة).
وعلي النقيض من هذه الخطوات الأكثر اهميه ، فان اعداد المكتبة والتسلسل في حد ذاتهما إجراءات قويه إلى حد ما. غير انه في ظل الظروف الميدانية ، يمكن ان تكون المسائل العملية مثل توافر قطع معينه من المعدات مشكله. فعلي سبيل المثال ، هناك حاجه إلى مقياس طيفي للاشعه فوق البنفسجية لتحديد تركيزات الحمض النووي قبل اعداد المكتبة للعينات المشفرة. ومع ذلك ، إذا كان مثل هذا الجهاز لا تكون متاحه في ظل الظروف الميدانية ، يمكن ببساطه الجمع بين كميه متساوية من كل عينه لتشكل 45 μL المطلوبة لاعداد المكتبة ، مع الاختلافات في عينه مواد الإدخال ثم يجري التخفيف عاده من قبل كبير عدد القراءات. المثل ، فان الحاجة إلى الاتصال بالإنترنت لتشغيل التسلسل يمكن ان تكون مشكله ، علي الرغم من انه لم يعد من الضروري القيام بالاتصال الأساسي علي الإنترنت ولكن يمكن ان يتم ذلك محليا ؛ ومع ذلك ، يمكن أزاله هذه الضرورة تحت ظروف معينه من قبل الشركة المصنعة إذا لزم الأمر.
وباختصار ، يتيح البروتوكول المعروض تسلسلا منخفض التكلفة نسبيا في المواقع التي لا يمكنها الوصول إلى معدات التسلسل التقليدية ، بما في ذلك في المواقع النائية. هو يستطيع بسهوله كنت كيفت إلى اي هدف [رنا] أو [دنا], لذلك يسمح باحثات ان يجيب يتعدد اسئله احيائيه.

التسلسل هو أداه قويه وهامه في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية. هو يسمح تحليل من مورثات, تنوعات وراثيه, و [رنا] تعبير تشكيلات, ولذلك يلعب دور مهمة في التحقيق من انسانيه وامراض حيوانيه علي حد سواء1,2. Sanger التسلسل ، واحده من أقدم الطرق المتاحة للتسلسل الحمض النووي ، لا يزال يستخدم بشكل روتيني إلى هذا اليوم ، وكان حجر زاوية من البيولوجيا الجزيئية. علي مدي السنوات 50 الماضية ، تم تحسين هذه التكنولوجيا لتحقيق أطوال القراءة أكثر من 1,000 nt ودقه عاليه مثل 99.999%1. ومع ذلك ، التسلسل Sanger أيضا قيود. تسلسل مجموعه أكبر من العينات أو تحليل الجينوم كله مع هذا الأسلوب هو مضيعه للوقت ومكلفه1,3. وقد مكنتنا أساليب تسلسل الحمض النووي من الجيل الثاني (الجيل التالي) مثل 454 التسلسل الحراري وتكنولوجيا الومينا من خفض التكلفة وعبء العمل المطلوبين للتسلسل في العقد الماضي بدرجه كبيره ، وأديت إلى زيادة هائله في كميه معلومات التسلسل البيولوجي المتاحة4. ومع ذلك ، فان تشغيل التسلسل الفردي باستخدام هذه التكنولوجيات الجيل الثاني مكلفه ، والتسلسل في ظل الظروف الميدانية أمر صعب ، لان المعدات اللازمة هي ضخمه وهشه (مماثله لأجهزه تسلسل Sanger) ، وغالبا ما يكون يتم معايره وخدمه من قبل الموظفين المدربين خصيصا. أيضا ، بالنسبة للكثير من الجيل الثاني من التكنولوجيات قراءه أطوال محدوده نوعا ما ، والتي غالبا ما يجعل تحليل المعلوماتية الحيوية المصب من هذه البيانات الصعبة.
يمكن ان يكون التسلسل من الجيل الثالث باستخدام أجهزه التسلسل النانو بحجم الجيب (انظر جدول المواد) بديلا عن منصات التسلسل الثابتة هذه. في هذه الاجهزه يمر الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل أو جزيء RNA من خلال نانو في وقت واحد مع التيار الأيوني الذي يقاس بعد ذلك بواسطة جهاز استشعار (الشكل 1). بما ان الحبل يخترق النانو, التشكيل من التيار ب ال [نوكليودس] حاضره في المسام في اي وقت محدده يكون كشفت, و[كمترتريكل] [رد-ترجم] داخل ال [نوكليوتيد] تسلسل5. وبسبب هذا المبدا التشغيلي ، يسمح التسلسل النانو لكل من توليد القراءات الطويلة جدا (بالقرب من 1 × 106 نوكليوديس6) وتحليل بيانات التسلسل في الوقت الحقيقي. ويمكن الكتابة بالشفرة عن طريق ربط متواليات النيوكليوتيد المحددة بالأحماض النووية في عينه ، مما يسمح بتحليل العينات المتعددة في تسلسل واحد ، التالي زيادة إنتاجيه العينات وخفض تكاليف العينة. ونظرا لقابليها العالية للنقل وسهوله استخدامها ، فقد استخدمت أجهزه التسلسل النانو بنجاح في الميدان خلال الوباء الأخير لمرض فيروس الإيبولا في غرب افريقيا ، مما يسلط الضوء علي ملاءمتها للانتشار السريع في المناطق النائية7 , 8-الآن
هنا ، ونحن وصف بروتوكول مفصل المتوافقة مع المجال للتسلسل الترميز mRNA لبروتين نيمان-بيك C1 (NPC1) ، وهو مستقبلات الدخول الملزمة للفيروسات الخيطية مثل الفيروسات الكترونيه ، وقد ثبت للحد من قابليه الأنواع هذه الفيروسات9,10. ويشمل البروتوكول استخراج الحمض الريبي النيبالي كله من عينات الدم ، والتضخيم محدده من NPC1 mRNA بواسطة RT-PCR ، والترميز من العينات ، واعداد المكتبة والتسلسل مع جهاز تسلسل نانو. ولا يمكن مناقشه تحليل البيانات بسبب محدوديه الحيز المكاني ، علي الرغم من ان بعض التوجيهات الاساسيه تقدم في النتائج التمثيلية ؛ ومع ذلك ، يحال القارئ المهتمة إلى المنشور السابق11 للحصول علي وصف أكثر تفصيلا لسير العمل الذي استخدمناه ، وكذلك للمنشورات الأخرى12،13،14 للحصول علي معلومات مفصله فيما يتعلق باداات التحليل المستخدمة في سير العمل هذا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK308</td>
			<td>1D&#178; Sequencing Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1150</td>
			<td>DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt/TA ligase master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0367S</td>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-low binding reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>DNA LoBind Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase buffer and DNase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN105.24</td>
			<td>flow cell R9.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot start high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanopore sequencing device</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>MinION Mk 1B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR barcoding kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-PBC001</td>
			<td>PCR Barcoding Kit I (R9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcriptase master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1151</td>
			<td>Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotating mixer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0287S</td>
			<td>LongAmp Taq 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II End-prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7546S</td>
			<td>NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>-</td>
			<td>NanoPhotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum manifold</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>S7000</td>
			<td>EZ-Vac Vacuum Manifold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing

ويمثل التسلسل في المواقع النائية والأوضاع التي تفتقر إلى الموارد تحديات فريدة. ويمكن استخدام التسلسل النانو بنجاح في ظل هذه الظروف ، وتم نشره في غرب افريقيا خلال الوباء الأخير لفيروس الإيبولا ، مما يسلط الضوء علي هذه الامكانيه. بالاضافه إلى مزاياه العملية (منخفضه التكلفة ، وسهوله نقل المعدات واستخدامها) ، توفر هذه التكنولوجيا أيضا مزايا أساسيه علي الجيل الثاني من نهج التسلسل ، ولا سيما طول القراءة طويل جدا ، والقدرة علي تسلسل مباشره RNA ، وتوافر البيانات في الوقت الحقيقي. دقه قراءه الخام اقل من مع منصات التسلسل الأخرى ، والتي تمثل الحد الرئيسي لهذه التكنولوجيا ؛ ومع ذلك ، يمكن تخفيف هذا جزئيا بواسطة عمق قراءه عاليه التي تم إنشاؤها. هنا ، نقدم بروتوكول متوافق مع المجال لتسلسل ترميز mRNAs ل نيمان-بيك C1 ، والذي هو مستقبلات الخلوية للفيروسات ebolaviruses ويشمل هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي من عينات الدم الحيوانية ، تليها RT-PCR لإثراء الهدف ، والترميز ، واعداد المكتبة ، والتسلسل تشغيل نفسها ، ويمكن تكييفها بسهوله للاستخدام مع غيرها من الأهداف DNA أو RNA.

في تجربه تمثيليه لاختبار البروتوكول المعروض قمنا باستخراج الحمض الريبي النيبالي من 10 عينات دم مختلفه من خمسه أنواع الحيوانية (اي, 2 الافراد لكل نوع (الماعز, خروف, الخنازير, الكلبة, الماشية)) (الجدول 3). يمكن ان تختلف غله الحمض الريبي النيبالي والجودة التالية الاستخراج علي نطاق واسع ، وخاصه بسبب الاختلافات في معالجه العينات والتخزين. في تجربتنا التمثيلية ، لاحظنا تركيزات RNA بين 43 نانوغرام و 543 نانوغرام لكل μL (الجدول 3). أيضا, بعد التضخيم من قبل RT-PCR, تحليل هلام من PCR-1 وأظهرت المنتجات النتائج المختلفة (الشكل 2), مع عصابات أضعف بصوره ملحوظة لعينات BC01 و BC02 (كل من الماعز). وكانت هذه الاختلافات علي الأرجح بسبب الاختلافات في نوعيه العينة ، علي الرغم من ان الاختلافات في فعاليه PCR بسبب الاختلافات في الربط التمهيدي لجين NPC1 من الأنواع المختلفة لا يمكن استبعادها. غير ان هذه الاختلافات في كفاءه الغلة و/أو التضخيم لم تؤثر تاثيرا ملحوظا علي نتائج التسلسل العام. وعلاوة علي ذلك ، حدث منتج إضافي غير محدد من طراز PCR في عينه BC10 (الماشية). وخلافا للتسلسل Sanger ، فان هذه المنتجات غير المحددة لا تؤثر سلبا علي نتائج التسلسل النانو ، حيث يتم تجاهل هذه القراءات اثناء تعيين القراءات التي تم الحصول عليها إلى تسلسل مرجعي كجزء من تحليل البيانات.
قبل كل تشغيل التسلسل ، ينصح بشده فحص جوده الخلية تدفق لاستخدامها ، مع متطلبات الحد الأدنى من 800 المسام الاجماليه. في تجربتنا التمثيلية ، عاد هذا الاختيار الجودة 1,102 المسام المتاحة للتسلسل. وبما ان البيانات تقدم في الوقت الحقيقي ويمكن تحليلها علي الفور ، يمكن تعديل طول التسلسل الزمني للتطبيق الفردي (اي حتى يتم إنتاج بيانات تسلسل كافيه للتحليل المطلوب). في تجاربنا ، يتم تنفيذ تسلسل تشغيل عاده بين عشيه وضحيها ، وفي حاله تجربتنا التمثيلية حصلنا علي ما يقرب من 1,400,000 يقرا خلال هذا الشوط 14 ح.
اعتمادا علي نوع تحليل البيانات الذي سيتم تنفيذه ، يمكن ان يكون من المستحسن معالجه مجموعه فرعيه فقط من القراءات التي تم الحصول عليها. وفي حاله تجربتنا التمثيلية ، اختيرت مجموعه فرعيه من 10,000 قراءه لمزيد من التحليل. ولهذه الغاية ، تمت معالجه الملفات fastq التي تم إنشاؤها اثناء تشغيل التسلسل في بيئة اوبونتو 18.04 لتر ، و فكك باستخدام عصب v 3.0.3 مع المعلمات الأمثل لأزاله الترسبات من نانو تسلسل البيانات (الباركود-الذيل-طول 300 ، الباركود-خطا معدل 0.2 ، الباركود-الفجوة-عقوبة-1)12. بعد أزاله الترسبات ، يمكن القيام بقراءه الخرائط وإنشاء توافق الآراء باستخدام عدد من الاداات المختلفة ، ولكن مناقشه مفصله للجانب المعلوماتي الحيوي للتسلسل نانو يتجاوز نطاق هذه المخطوطة. ومع ذلك ، في حاله النتائج التمثيلية لدينا ، قراءه التعيين إلى تسلسل مرجعي تم تنفيذها باستخدام Geneious 10.2.3. من 10,000 يقرا تحليلها ، 5,457 أظهرت طولا بين 1,750 و 2,000 النيوبوتيديس ، الذي يطابق الاحجام المتوقعة لشظايا PCR تضخيمها كجزء من سير العمل لدينا (1,769 nt ، الشكل 3). لوحظت ذروه اضافيه في توزيع الطول من القراءات بين 250 إلى 500 النيوبوتيدس ، والتي يمكن ان تعزي إلى منتجات PCR غير محدده. سمح [ديدولتيبليكينغ] من يقرا التعيين من 87.6% من اليقرا إلى واحده من ال 10 الباركود/عينات يحلل (شكل 4). وتراوحت نسبه القراءات بالنسبة لكل الباركود من 3.4 ٪ للباركود 1 إلى 16.9 ٪ للباركود 10 ؛ ومع ذلك ، نظرا للعدد الكبير الإجمالي من يقرا هذا لا يزال يسمح توافق الآراء ذات مغزى يدعو مع عمق قراءه عاليه حتى بالنسبة لهذه مجموعات البيانات الباركود اقل وفره. وفي الواقع ، ادي تعيين القراءات المفروزة إلى تسلسل مرجعي من NPC1 إلى ما بين 31.7% (الباركود 2) و 100% (الباركود 7 و 8) من قراءه الخرائط إلى المرجع ، مما يعطي عمق قراءه أكثر من 90 يقرا في اي موضع لكل عينه. ثم يكون هذا أكثر من كافيه للسماح ثقة بتوافق الآراء قاعده الاتصال مع معدل خطا لا يستهان بها.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig1.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتسلسل الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا نانو. جزيء الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل يمر عبر نانو جزءا لا يتجزا من غشاء مقاوم للكهرباء ، مع الحلزونية التي تنظم سرعه الانتقال. يمر التيار الأيوني في نفس الوقت عبر المسام ويقاس باستمرار. يتم الكشف عن التحويرات الحالية الناجمة عن النوكليودات الموجودة في المسام والعودة الحسابية مترجمه إلى تسلسل النوكليوتيد من حبلا الحمض النووي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig2.jpg"> الشكل 2: تضخيم منتجات PCR من نيمان-بيك C1 من mRNA. تم عزل mRNA من الماعز (BC01 و 02) ، والأغنام (BC03 و 04) ، والخنازير (BC05 و 06) ، والكلبة (BC07 و 08) ، والماشية (BC09 و 10). تم فصل المنتجات PCR المتداخلة في هلام 0.8 ٪ الاغاروز في المخزن المؤقت تاي 1x (أعدت من 50x تاي العازلة: 242.28 غرام من قاعده تريس ، 57.1 ml من حمض الخليك الجليدية ، 100 مل من 0.5 م أدتا ، dH2O إلى 1 لتر ، وتعديل درجه الحموضة إلى 8.0) ل 45 دقيقه في 100 V وملطخه سايبر الأمن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig3.jpg"> الشكل 3: التوزيع المقروء ل10,000 يقرا من التجربة التمثيلية. يتم الاشاره إلى عدد القراءات التي تم الحصول عليها والتي لها فتره طول معينه للقراءة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig4.jpg"> الشكل 4: توزيع القراءة بعد أزاله الترسبات. يتم عرض العدد والنسبة المئوية للقراءة (الرمادي) والقراءات المعينة (الأسود) لكل رمز شريطي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: نظره عامه علي مجموعات التمهيدي المستخدمة. تم اجراء التضخيم الاولي للتسلسل المستهدف مع مجموعه التمهيدي 1. ثم تم استخدام مجموعه التمهيدي 2 لتضخيم المتداخلة وأضافه محول. يتم الاشاره إلى المحولات باللون الأحمر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_1.xlsx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول 2: نظره عامه علي تسلسل الباركود. واستخدمت الباركود الفردية لتحديد كل عينه متسلسلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_2.xlsx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول 3: التركيزات التي تم الحصول عليها بعد استخراج عينات من الدم متسلسلة في التجربة التمثيلية. وتظهر تركيزات الحمض الريبي النيبالي لفردين من كل من الأنواع الخمسة ، ويشار إلى نسب الكثافة البصرية عند 260/280 نانومتر و 260/230 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_3.xlsx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

نانو التسلسل هو تقنيه جديده تسمح بالتسلسل الفعال من حيث التكلفة في المواقع النائية والبيئات التي تفتقر إلى الموارد. هنا ، نقدم بروتوكولا لتسلسل mRNAs من الدم الكامل الذي يتوافق مع مثل هذه الظروف.

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

الجيل الثالث نانوبور التسلسل هو تكنولوجيا تسلسل رواية قوية التي تسمح بسهولة جدا الحصول على معلومات التسلسل من مجموعة واسعة من العينات. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي قابلية جهاز التسلسل وطول القراءة الطويل للغاية وتوافر البيانات في الوقت الفعلي. تسلسل النانوبور هو تكنولوجيا مفيدة بشكل خاص خلال تفشي الأمراض في المناطق النائية.وقد تم استخدامه بنجاح في المختبرات الميدانية أثناء وبعد فاشيات فيروس الإيبولا في غرب ووسط أفريقيا. عبر تسلسل نانوسبور واستخدام جهاز MinION لهذا الغرض هو سهل نوعا ما، يجب توخي الحذر أثناء إعداد المكتبة وأثناء تحميل الخلايا تدفق. لبدء هذا الإجراء، إعداد هبوط PCR لتضخيم cDNA مع التمهيدي تعيين واحد باستخدام بداية ساخنة عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات مع العازلة التفاعل المناسبة في حجم رد فعل ميكرولتر 50 مع قالب ميكرولتر واحد.إذا كان ذلك ممكنا، إعداد رد فعل على الجليد أو في كتلة باردة في أربع درجات مئوية. احتضان رد الفعل في ثيرموسكلتر كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل 50 ميكرولترات من المنتج PCR إلى 1.5 ملليلتر الحمض النووي أنبوب رد فعل ملزمة منخفضة.resuspend الخرز المغناطيسي بدقة عن طريق دوامة. ثم إضافة 50 ميكروليتر من الخرز إلى تفاعل PCR ومزيج جيد. احتضان العينة على خلاط دوار لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران عند 15 دورة في الدقيقة.تدور لفترة وجيزة أسفل العينة ومن ثم وضع الأنبوب على رف مغناطيسي لبيديه الخرز المغناطيسي. انتظر حتى تم توضيح المابير تماما قبل المتابعة. المقبل، الطامح الماكر دون إزعاج بيليه حبة والتخلص منه.Pipette 200 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول في أنبوب رد الفعل واحتضان لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. استلهم الإيثانول دون إزعاج حبيبة الخرز والتخلص منه. كرر عملية الغسيل هذه مع الإيثانول مرة أخرى لمجموع اثنين من الغسالات.الهواء يجف بيليه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة أنبوب التفاعل من رف المغناطيسي. Resuspend بيليه في 30 ميكرولترات من المياه الحرة النوى واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.وضع أنبوب رد الفعل مرة أخرى على رف المغناطيسي والانتظار حتى يتم بيليه تماما حبات رد الفعل. بعد هذا، إزالة ناظر دون إزعاج بيليه ونقلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 ملليلتر جديدة. إذا كان من المقرر أن تُتسلسل عدة عينات في نفس الوقت، يمكن الآن إضافة الباركود بواسطة خطوتين إضافيتين من PCR متبوعتين بتنظيف الحمض النووي كما هو مبين سابقاً.أولاً، الجمع بين كمية مساوية من الحمض النووي المكرق من كل عينة لما مجموعه ميكروغرام واحد من الحمض النووي في حجم 45 ميكرولتر في أنبوب تفاعل 0.2 ملليلتر. لdA-الذيل، إضافة سبعة ميكرولترات من نهاية العازلة رد فعل الإعدادية، وثلاثة microliters من مزيج إنزيم الإعدادية نهاية، وخمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوكلاز. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط.في دراجة الحرارة، احتضان رد الفعل لمدة خمس دقائق في 20 درجة مئوية تليها خمس دقائق في 65 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإجراء تنقية PCR لمنتج التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص. اختياريا، تأخذ ميكرولتر واحد لتحديد تركيز العينة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.الجمع بين 22.5 ميكرولترات من الحمض النووي المنقى التي تم الحصول عليها سابقا مع 2.5 ميكرولترات من محول 1D2 و 25 ميكرولترات من بلانت / تا Ligase ماجستير ميكس في جديد 1.5 ملليلتر الحمض النووي انخفاض تفاعل أنبوب. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط. تدور لفترة وجيزة أسفل الخليط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.ثم قم بإجراء تنقية PCR لمنتج التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص. الجمع بين 45 ميكرولتررس من المنتج رد فعل مع خمسة ميكرولترات من مزيج محول الباركود و 50 ميكرولترات من بلانت / تا Ligase ماجستير ميكس في أنبوب رد فعل منخفض الحمض النووي ملزمة. نفض الغبار بلطف لخلط واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تنقية المنتج رد فعل كما هو موضح في بروتوكول النص وتخزين الناتج المنتج على الجليد أو في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. للبدء، قم بإجراء فحص جودة على خلية التدفق قبل الاستخدام. وتحقيقا لهذه الغاية، قم بتوصيل جهاز التسلسل بالكمبيوتر المضيف وفتح البرنامج.أدخل خلية تدفق في جهاز التسلسل. ثم اختر نوع خلية التدفق من مربع المحدد وانقر فوق المتوفر للتأكيد. في الجزء السفلي من الشاشة، انقر فوق التحقق من خلية تدفق واختيار نوع خلية التدفق الصحيح.انقر فوق اختبار البدء لبدء فحص الجودة. ويلزم وجود ما لا يقل عن 800 من الجراثيم النانوية النشطة في المجموع لكي تكون خلية التدفق قابلة للاستخدام. أولاً، افتح غطاء المنفذ الأولي عن طريق تحريكه في اتجاه عقارب الساعة.تعيين ماصة P1000 إلى 200 ميكروليترس وأدخل تلميح في ميناء فتيلة. ثم ضبط ماصة إلى 230 ميكروليترس مع الحفاظ على طرف في ميناء فتيلة لرسم ما يصل 20 إلى 30 ميكرولترات من العازلة وإزالة أي فقاعات الهواء. في جديد 1.5 ملليلتر الحمض النووي انخفاض تفاعل أنبوب ملزمة، وإعداد مزيج فتيلة من خلال الجمع بين 576 ميكرولترات من العازلة RBF مع 624 ميكرولترات من المياه الحرة النوى.دقيق ماص 800 ميكرولترات من مزيج فتيلة أعدت في ميناء فتيلة والانتظار خمس دقائق. بعد هذا، رفع غطاء ميناء العينة والماصات إضافية 200 ميكرولترات من مزيج فتيلة أعدت في ميناء فتيلة. Pipette 35 ميكرولترات من المخزن المؤقت RBF في جديد نظيفة 1.5 ملليلتر الحمض النووي منخفضة ربط أنبوب التفاعل.مزيج دقيق الخرز LLB عن طريق pipetting وإضافة 25.5 ميكرولترات من الخرز إلى المخزن المؤقت RBF. المقبل، إضافة 2.5 ميكرولترات من المياه الحرة النوى و 12 ميكرولترات من مكتبة الحمض النووي ومزيج عن طريق الأنابيب. إضافة 75 ميكرولترات من خليط عينة بطريقة بطيئة انخفاض الحكمة إلى خلية تدفق عبر منفذ العينة.ثم استبدال غطاء منفذ العينة، إغلاق منفذ فتيلة وإغلاق غطاء جهاز التسلسل. ضمن البرنامج، تأكد من أن خلية التدفق لا تزال متاحة. افتح تجربة جديدة ثم قم بإعداد معلمات التشغيل عن طريق تحديد المجموعة المستخدمة.حدد livecalling. ابدأ تشغيل التسلسل بالنقر فوق تجربة البدء. متابعة تشغيل التسلسل حتى يتم تجميع بيانات تجريبية كافية.في تجربة تمثيلية، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من 10 عينات دم مختلفة من خمسة أنواع حيوانية. ويلاحظ تركيزات الحمض النووي الريبي بين 43 نانوغرام و543 نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد التضخيم بواسطة RT-PCR، تحليل هلام من المنتجات PCR MPC1 يظهر نتائج مختلفة مع عصابات أضعف بشكل ملحوظ للعينات BC01 و BC02.وهذه الاختلافات هي على الأرجح بسبب الاختلافات في نوعية العينة على الرغم من أن الاختلافات في فعالية PCR بسبب الاختلافات في التمهيدي ملزمة للجين MCP1 من الأنواع المختلفة لا يمكن استبعادها. غير أن هذه الاختلافات في كفاءة الغلة و/أو التضخيم لا تؤثر بشكل ملحوظ على نتائج التسلسل الإجمالية. مجموعة فرعية من 10,000 يتم الحصول على القراءة ثم يتم تحديد و demultiplexed لمزيد من التحليل.من 10،000 يقرأ تحليلها، 5، 457 تظهر طول بين 1، 750 و 2، 000 النيوكليوتيدات التي تطابق الأحجام المتوقعة لشظايا PCR تضخيم كجزء من سير العمل لدينا. ويلاحظ ارتفاع إضافي في توزيع طول القراءات بين 250 و500 نوكليوتيدات يمكن أن تعزى إلى منتجات PCR غير محددة. يسمح ديمولتيبليكسينج من يقرأ التعيين من 87.6٪ من القراءة إلى واحدة من العينات 10 تحليلها.في حين أن هذه الطريقة موثوق بها تماما، في ظل الظروف الميدانية، والتضخيم PCR هو الخطوة الأكثر إشكالية. خلال تجاربنا، كانت البروتوكولات المتداخلة ضرورية في كثير من الأحيان لتضخيم التسلسلات المستهدفة. إلى جانب تسلسل الجينات المضيف الحيوانية، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتسلسل أي الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بما في ذلك مسببات الأمراض الفيروسية أو البكتيرية.ولذلك فإن تسلسل النانوبور يستخدم الآن بشكل متزايد ليس فقط خلال تفشي الأمراض أو للدراسات العلمية في الأماكن النائية ولكن أيضا في المختبرات العادية حيث تفتح أطوال القراءة الطويلة إمكانيات بحث جديدة مثيرة. وفي حين أن أياً من الكواشف المستخدمة لا يتسم بالخطورة على نحو خاص، فإنه ينبغي اتباع الممارسات المختبرية الجيدة القياسية. من الواضح عند تسلسل عوامل المرض ، يجب مراعاة جميع الاحتياطات اللازمة للتعامل مع هذه العوامل.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...