Name: sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing
Uploaded: 2019-06-03T13:00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

Forfatterne takker Allison Groseth for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av det tyske føderale departementet for mat og landbruk (BMEL) basert på vedtak av parlamentet i Forbundsrepublikken Tyskland gjennom Federal Office for landbruk og mat (ble).

Prøvene ble samlet inn etter Njala University institusjonelle Review Board (NUIRB) protokoll no. IRB00008861/FWA00018924.
1. RNA-ekstraksjon fra blodprøver
<ol><li>Samle 3 mL hele blod fra arten som skal analyseres til et blodprøvetakingsrør ferdigfylt med 6 mL DNA/RNA stabiliserings reagens (se tabell over materialer) og bland med invertere 5 ganger. Oppbevar Blodprøven i opptil én måned ved 4 ° c.</li>
	<li>Overfør innholdet i blodprøvetakings røret til et 50 mL prøvetakingsrør, tilsett 120 μL av proteinase K, og bland med virvlingen i 5 s. ruge prøven i 30 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Tilsett 9 mL isopropanol til blandingen og Vortex for 5 s.</li>
	<li>Plasser et reservoar på en RNA-rotasjon (se tabell over materialer) og sett forsamlingen på et vakuum manifold (se tabell over materialer). Tilsett prøve blandingen i reservoaret. Påfør et vakuum til all væske har passert gjennom kolonnen.</li>
	<li>Alternativt, hvis ingen vakuum manifold er tilgjengelig, blodet kan sendes gjennom kolonnen i 700 μL porsjoner ved gjentatt sentrifugering for 30 s på 12 000 x g med gjennomstrømning kastes mellom sentrifugering trinn. Imidlertid, denne ville forlange ca 26 sentrifugering skritt.</li>
	<li>Sett inn en verdi for RNA-rensing i et oppsamlings rør og tilsett 400 μL DNA/RNA-buffer (se tabell over materialer). Sentrifuger på 12 000 x g for 30 s og kast gjennomstrømning.</li>
	<li>Tilsett 400 μL av DNA/RNA vaskebuffer (se tabell av materialer) til kolonnen, sentrifuge ved 12 000 x g for 30 s og forkaste gjennomstrømning.</li>
	<li>Bland 5 μL av DNase I (1 U/μL) (se tabell over materialer) med 75 μL av buffer for DNA-fordøyelse (se tabell over materialer) og tilsett blandingen på søylen. Ruge i 15 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Tilsett 400 μL av DNA/RNA prep buffer til søylen og sentrifuger ved 12 000 x g for 30 s. kast flyten gjennom.</li>
	<li>Vask søylen med 700 μL av DNA/RNA vaskebuffer og sentrifuger ved 12 000 x g for 30 s. kast flyten gjennom.</li>
	<li>Gjenta trinn 1,9 med 400 μL DNA/RNA vaskebuffer og sentrifuger ved 12 000 x g i 2 minutter for å fjerne all gjenværende vaskebuffer og tørke kolonnen. Når du fjerner kolonnen fra prøvetakingsrøret, må du sørge for å ikke fukte undersiden av kolonnen med bufferen i prøvetakingsrøret.</li>
	<li>
Plasser kolonnen i et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør og tilsett 70 μL av nuklease vann. Ruge i 1 min ved romtemperatur og sentrifuge i 30 s ved 12 000 x g. Oppbevar RNA at-80 ° c til videre bruk (eller bruk umiddelbart).
	<ol>
<li>
Valgfritt: For å kvantifisere RNA-en, ta en alikvot og Bestem konsentrasjonen ved hjelp av en UV-spektrofotometer (se tabell over materialer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. omvendt transkripsjon av NPC1 mRNA inn cDNA
<ol><li>I et 0,2 mL reaksjons rør, tilsett 8 μL av mal RNA (1 PG til 2,5 μg av RNA) og 1 μL hver av 10x DNase buffer og DNase enzym (se tabell over materialer). Ruge ved 37 ° c i 2 min. Deretter sentrifuger reaksjonen kort og plassere den på isen.</li>
	<li>Tilsett 4 μL av omvendt transkriptase Master mix (se tabell over materialer) og 6 μL av nuklease vann til reaksjonsrøret og bland forsiktig. Ruge reaksjonen i en thermocycler i 10 min ved 25 ° c (for primer annealing), etterfulgt av 10 min ved 50 ° c (for omvendt transkripsjon av RNA). For å deaktivere enzymet, ruge i 5 min ved 85 ° c.</li>
	<li>Overfør cDNA til en ny 1,5 mL mikrosentrifugen tube og oppbevar ved-80 ° c inntil videre bruk (eller bruk umiddelbart).</li>
</ol>3. forsterkning av NPC1 åpen lese ramme
<ol><li>
Innledende forsterknings trinn
	<ol>
<li>Sett opp en touchdown PCR15,16 for å forsterke NPC1 cDNA med primer sett 1 (se tabell 1), ved hjelp av en Varmstart High Fidelity DNA polymerase (se tabell over materialer) med riktig reaksjonsbuffer i en 50 μL reaksjon volum med 1 μL mal. Hvis mulig, sette opp reaksjonen på isen eller i en 4 ° c kjølig blokk.</li>
		<li>Ruge reaksjonen i en thermocycler med et innledende denaturering trinn på 30 s ved 98 ° c, etterfulgt av 10 sykluser med denaturering ved 98 ° c i 10 s, primer annealing i 20 s ved 65 ° c, senke temperaturen med 0,5 ° c per syklus, og forlengelse i 1 min ved 72 ° c. Deretter, Kjør ytterligere 20 sykluser med 10 s ved 98 ° c, 20 s ved 60 ° c, og 1 min ved 72 ° c, etterfulgt av et siste forlengelse trinn på 5 min ved 72 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-rensing ved hjelp av magnetiske perler
	<ol>
<li>Overfør 50 μL av PCR-produkt til et 1,5 mL DNA-lavt bindende reaksjons rør (se tabell over materialer). Resuspend magnetiske perler (se tabell over materialer) grundig ved virvlingen og tilsett 50 μL PERLER til PCR-reaksjonen. Bland godt. Ruge prøven på en roterende mikser (se tabell over materialer) i 5 minutter ved romtemperatur (ved 15 RPM).</li>
		<li>Snurr kort ned prøven og plasser 1,5 mL mikrosentrifugen røret på et magnetisk stativ (se tabell over materialer) for å pellet de magnetiske perlene. Vent til supernatanten har blitt fullstendig avklart før du fortsetter med neste trinn.</li>
		<li>Aspirer supernatanten uten å forstyrre perle pellet og kast.</li>
		<li>Pipetter 200 μL av 70% etanol i reaksjonsrøret og ruge for 30 s. aspirer etanol uten å forstyrre pellet og kast. Gjenta for totalt to vasker. Pass på at ingen etanol er igjen. Det kan være nødvendig å først aspirer med en større pipette (f.eks. 1000 μL), og deretter fjerne eventuelle gjenværende etanol dråper med en mindre pipette (f.eks. 10 μL).</li>
		<li>Luft-tørk pellet i 1 min ved romtemperatur.</li>
		<li>Fjern reaksjonsrøret fra det magnetiske stativet, resuspend pellet i 30 μL av nuklease vann og ruge i 2 min ved romtemperatur.</li>
		<li>Plasser reaksjonsrøret tilbake på magnet stativet og vent til perlene er helt pelleted.</li>
		<li>Fjern supernatanten uten å forstyrre pellet og overføre den til en ny 1,5 mL reaksjons rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tilsetting av strekkode adaptere ved nestede PCR
	<ol>
<li>Sett opp en 50 μL touchdown PCR med Varmstart, High-Fidelity DNA-polymerase med 5x reaksjonsbuffer og primer sett 2 (se tabell 1). Primere i dette settet består av en mål sekvens-spesifikk region for å tillate binding av PCR-produkter generert i trinn 3,2 (innsiden av primer sett 1 sekvenser), samt en adapter sekvens som brukes som mål i den påfølgende barcoding PCR reaksjon (jf pkt. 4). Hvis mulig, sette opp reaksjonen på isen eller i en 4 ° c kjølig blokk. Bruk 1 μL av renset PCR-produkt fremstilt i Seksjon 3,2 som mal.</li>
		<li>Ruge reaksjonsblandingen i en thermocycler ved hjelp av et innledende denaturering trinn på 30 s ved 98 ° c, etterfulgt av 10 sykluser med denaturering ved 98 ° c i 10 s, primer annealing i 20 s ved 65 ° c, senke temperaturen med 0,5 ° c per syklus og forlengelse i 1 min ved 72 ° c. Deretter ruge reaksjonen for ytterligere 30 sykluser for 10 s ved 98 ° c, 20 s ved 71 ° c, og 1 min ved 72 ° c, etterfulgt av et siste forlengelse trinn på 5 min ved 72 ° c.</li>
		<li>Rydd opp i PCR-produktet med magnetiske perler som beskrevet i avsnitt 3,2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. barcoding av NPC1 Amplicons
<ol><li>For hvert PCR-produkt som ble generert i del 3, setter du opp en barcoding PCR-reaksjon i et 0,2 mL reaksjons rør med 50 μL av Taq DNA polymerase 2x Master mix (se tabell over materialer), 2 μL av en av strekkode primere fra et PCR-barcoding sett (se tabell over materialer </ C1 > og tabell 2), og 1 ΜL renset PCR produkt fra trinn 3.3.2 som mal. Tilsett 47 μL av nuklease fritt vann for å oppnå et endelig volum på 100 μL.</li>
	<li>Ruge reaksjonen i en thermocycler ved 95 ° c i 3 min som en innledende denaturering. Deretter kjøres 15 sykluser for 15 s ved 95 ° c, 15 s ved 62 ° c, og 1,5 min ved 65 ° c. Som en siste forlengelse, ruge reaksjonen ved 65 ° c i 5 minutter.</li>
	<li>Rens PCR-produktet som beskrevet under 3,2, men bruk 100 μL av magnetiske perler og eluere i 30 μL av nuklease vann.</li>
	<li>Hvis mulig, kvantifisere prøven ved hjelp av en UV-spektrofotometer.</li>
</ol>5. forberedelse av biblioteket
<ol><li>Kombiner en lik mengde Barcoded DNA fra hver prøve for totalt 1 mikrogram DNA i et volum på 45 μL (om nødvendig, tilsett nuklease-fritt vann) i en 0,2 mL reaksjons slange. Hvis ingen UV-spektrofotometer er tilgjengelig, bruker du like volumer av hvert utvalg. For dA-Tailing, tilsett 7 μL av reaksjonsbuffer for slutt prep (se tabell over materialer), 3 μL av enzym blanding for slutt prep (se tabell over materialer) og 5 μL av nuklease vann. Bland forsiktig ved å sveipe røret.</li>
	<li>Ruge reaksjonen i 5 minutter ved 20 ° c, etterfulgt av 5 min ved 65 ° c i en thermocycler.</li>
	<li>Rens reaksjons produktet som beskrevet i avsnitt 3,2, men bruk 60 μL av magnetiske perler og eluere i 25 μL av nuklease vann.</li>
	<li>
Valgfritt: ta 1 μL for å kvantifisere konsentrasjonen av prøven ved hjelp av en UV-spektrofotometer. Det totale beløpet bør være mer enn 700 ng.</li>
	<li>Kombiner 22,5 μL av renset DNA fra trinn 5,3 med 2,5 μL av 1D2-adapter (se tabell over materialer) og 25 μL av BLUNT/ta ligase Master mix (se tabell over materialer) i en ny 1,5 ml DNA-lav bindings rør, bland forsiktig ved å sveipe og kort spinne Ned. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Rens reaksjons produktet som beskrevet i avsnitt 3,2, men bruk 20 μL av magnetiske perler, Øk inkubasjonstiden for DNA-binding til 10 min, Utfør to vasketrinn med 1 mL etanol hver, og eluere i 46 μL av nuklease vann.</li>
	<li>Kombiner 45 μL av reaksjons produktet fra trinn 5,6 med 5 μL av blanding av strekkode adapter (se tabell over materialer) og 50 μL av BLUNT/ta ligase Master mix i et DNA-lav bindings reaksjons rør. Bland forsiktig ved å sveipe og ruge i 10 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Rens reaksjons produktet som beskrevet i avsnitt 3,2, men bruk 40 μL av magnetiske perler, gjør to vasketrinn med 140 μL av ABB buffer (se tabell over materialer) i stedet for etanol, resuspend perlene ved å sveipe og pellet på en magnetisk rack. Eluere i 15 μL av eluering buffer (se tabell over materialer). Øk inkubasjons tider for den første bindingen av DNA til perlene samt for eluering trinn til 10 min. oppbevar det resulterende produktet på is eller ved 4 ° c til bruk.</li>
</ol>6. kvalitetskontroll av Strømningscelle
<ol><li>Utfør en kvalitetskontroll på strømningscellen før bruk. For dette formål, koble sekvensering enheten til vertsdatamaskinen og åpne programvaren.</li>
	<li>Sett inn en strømningscelle (se tabell over materialer) i sekvensering-enheten, og velg strømningscelle typen fra valg boksen og bekreft ved å klikke på tilgjengelig.</li>
	<li>Klikk Kontroller flytcelle i bunnen av skjermen, og velg riktig flytcelle type.</li>
	<li>Klikk Start test for å starte kvalitetskontrollen. Det kreves minst 800 aktive nanopores for at strømningscellen skal kunne brukes.</li>
</ol>7. lasting av Flow Cell og starte sekvensering Run
<ol><li>Åpne dekselet til priming-porten ved å skyve det i klokkens retning. Sett en P1000 pipette til 200 μL og sett spissen inn i priming porten. Juster pipette til 230 μL mens du holder spissen i priming porten, for å utarbeide 20-30 μL buffer og fjerne eventuelle luftbobler.</li>
	<li>I et nytt 1,5 mL DNA-lav bindings reaksjons rør forbereder du priming Mix ved å kombinere 576 μL av RBF buffer (se tabell over materialer) med 624 μL av nuklease vann.</li>
	<li>Forsiktig pipette 800 μL av forberedt priming mix i priming porten og vent 5 min. Løft prøve portdekselet, og Pipetter en ekstra 200 μL av den tilberedte priming blandingen inn i priming porten.</li>
	<li>Pipetter 35 μL av RBF-buffer til et nytt, rent 1,5 mL DNA lav bindings reaksjons rør. Bland LLB-perler grundig (se tabell over materialer) ved å pipettering og tilsett 25,5 μL av PERLENE i RBF-bufferen. Tilsett 2,5 μL nuklease-fritt vann og 12 μL av DNA-bibliotek fra trinn 5,8 og bland med pipettering.</li>
	<li>Tilsett 75 μL av prøve blandingen på en langsom dråpevis måte til strømningscellen via prøve porten.</li>
	<li>Sett på prøve portdekselet, Lukk priming-porten og Lukk lokket på sekvensering enheten.</li>
	<li>I programvaren bekrefter du at flyt cellen fremdeles er tilgjengelig, åpner et nytt eksperiment og konfigurerer kjøre parametrene ved å velge settet som brukes. Velg Live base-ringer. Start sekvensering kjøres ved å klikke Start eksperiment. Fortsette sekvensering kjøre til tilstrekkelig eksperimentelle data er samlet inn.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Shendure, J., Lieberman Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+scope+of+DNA+sequencing.">The expanding scope of DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+next-generation+sequencing+systems.">Comparison of next-generation sequencing systems.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+Next-Generation+Sequencing.">Advancements in Next-Generation Sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).</li><li>Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxford+Nanopore+MinION+Sequencing+and+Genome+Assembly.">Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).</li><li>Jain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+and+assembly+of+a+human+genome+with+ultra-long+reads.">Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Ebola+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+entry+requires+the+cholesterol+transporter+Niemann-Pick+C1.">Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1.</a> Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).</li><li>Ndungo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Residue+in+Ebola+Virus+Receptor+NPC1+Influences+Cellular+Host+Range+in+Reptiles.">A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+siRNA+screen+identifies+a+druggable+host+pathway+essential+for+the+Ebola+virus+life+cycle.">A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle.</a> Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).</li><li>Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexbar+3.0+-+SIMD+and+multicore+parallelization.">Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization.</a> Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+seeds+tame+genomic+sequence+comparison.">Adaptive seeds tame genomic sequence comparison.</a> Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).</li><li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown'+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification.">Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).</li><li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification.">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).</li><li>Keller, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+Sequencing+of+the+Coding+Complete+Influenza+A+Virus+Genome.">Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomic+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Medicine. 7, 99 (2015).</li><li>Castro-Wallace, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+DNA+Sequencing+and+Genome+Assembly+on+the+International+Space+Station.">Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station.</a> Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).</li><li>Goordial, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Field+Sequencing+and+Life+Detection+in+Remote+(79+degrees+26'N)+Canadian+High+Arctic+Permafrost+Ice+Wedge+Microbial+Communities.">In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).</li><li>Runtuwene, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+of+drug-resistance-associated+genes+in+malaria+parasites,+Plasmodium+falciparum.">Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).</li><li>Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+squiggle+to+basepair:+computational+approaches+for+improving+nanopore+sequencing+read+accuracy.">From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy.</a> Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).</li></ol>

TH deltok i Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION tidlig tilgang program fra 2014 til 2015, og fikk MinION enheter og strømnings celler for en tidligere studie 7 utført av National Institutes of Health, USA, gratis eller til reduserte kostnader . Han ble invitert av ONT å presentere en del av dette arbeidet ved London Calling 2015 møte i London, Storbritannia, og ONT utbetales for transport og overnatting. For arbeidet som presenteres i dette manuskriptet, ble det ikke oppnådd noen fordeler (f.eks. maskinvare eller reagenser til reduserte kostnader, reise refusjoner etc.) fra ONT. AM, KF og RS har ingenting å avsløre.

I løpet av de siste to ti årene har sekvensering av biologiske prøver blitt et stadig viktigere aspekt ved studier i et bredt spekter av fagområder. Utviklingen av andre generasjons sekvensering systemer basert på sekvensering av en tett utvalg av DNA-funksjoner ved hjelp av gjentakende sykluser av enzymatisk manipulasjon og bilde-basert datainnsamling1 har dramatisk økt gjennomstrømning i forhold til tradisjonelle sanger sekvensering teknikk, og tillater analyse av flere prøver samt ulike nukleinsyre yre arter i et gitt utvalg i parallell4. Men for de fleste av de brukte andre generasjons systemer, bare korte leser er produsert, og alle plattformer stole på følsom, klumpete og kostbart utstyr3,4.
I motsetning til andre generasjons sekvensering plattformer, sekvensering enheten som brukes i denne protokollen er basert på nanopore teknologi. Her en enkelt-strandet nukleinsyre syre molekyl passerer gjennom en nanopore, noe som resulterer i modulering av en ioniske strøm som også strømmer gjennom de samme nanopore, og som kan måles og tilbake-oversettes til å antyde sekvensen av nukleinsyre syre molekyl. Denne tredje generasjons sekvensering tilnærming formidler en rekke fordeler fremfor andre tilnærminger. De viktigste fordelene som er direkte relatert til den unike Arbeidsprinsipp av denne teknologien er den ekstremt lange lese lengde produsert (Les lengder opp til 8,8 x 105 nukleotider har blitt rapportert6), evnen til å sekvens ikke bare DNA, men også RNA direkte, som nylig ble demonstrert for en komplett influensa virus Genova17, og evnen til å analysere data i sanntid som de blir generert, som tillater rask metagenomics påvisning av patogener i løpet av minutter18. Ytterligere praktiske fordeler er den ekstremt lille størrelsen på nanopore sekvensering enheten, slik at bruken i alle laboratorium eller på feltet oppdrag til avsidesliggende steder19,20, og den lave prisen i forhold til andre sekvensering Plattformer. Når det gjelder driftskostnader, er det i dag en ny flytcelle som kreves for hver sekvensering kjøre, noe som resulterer i kostnader på ca $1 100 per kjøre for strømningscelle og bibliotek forberedelse reagenser. Disse kostnadene kan reduseres i noen tilfeller ved vasking og gjenbruk av strømningscelle, eller ved barcoding og sekvensering flere prøver i en enkelt kjøre. Også en roman type strømningscelle blir for tiden beta-testet av et lite antall laboratorier, som vil kreve bruk av en strømningscelle adapter (kalt en "flongle"), og bør betydelig redusere strømningscelle pris og dermed kjørekostnader.
Den store brist i nanopore sekvensering fortsatt sin nøyaktighet, med enkelt lese nøyaktigheter i størrelsesområdet 83 til 86% blir rapportert6,21,22, og de fleste av unøyaktigheter blir forårsaket av innsetting/slettinger ( indeler)5,21. Høy lese dybde kan imidlertid kompensere for disse unøyaktigheter, og en nyere studie foreslo basert på teoretiske hensyn som en lese dybde på > 10 kan øke den totale nøyaktigheten til > 99.8%21. Likevel, ytterligere forbedringer i nøyaktighet vil være nødvendig, spesielt hvis analysen skal utføres på et enkelt molekylnivå i stedet for på en konsensus sekvens nivå. Bruken av 1D2 -teknologi som beskrevet i denne protokollen, som er basert på tillegg av 1d2 -og strekkode adaptere (jf. avsnitt 5,5) som resulterer i at begge TRÅDENE i et enkelt DNA-molekyl er sekvensielt med samme nanopore, øker lese- nøyaktigheten siden informasjon fra begge DNA-tråder kan brukes for sekvens bestemmelse. Videre, en løsning strategi som kan gjennomføres for å kombinere fordelene med nanopore sekvensering (spesielt lang lese lengde) med høyere nøyaktighet av andre sekvensering teknologier er å bruke nanopore sekvensering informasjon som et stillas, som er deretter polert ved hjelp av sekvensering data fra andre plattformer6.
Den mest kritiske faktoren for suksessen til protokollen som presenteres her er prøve kvalitet, og spesielt mengden og kvaliteten på den utpakkede RNA. Riktig lagring og rask ekstraksjon av RNA-hjelp for å oppnå en tilstrekkelig RNA-ytelse. Bruk av egnede blodprøvetakingsrør tillater lagring av blodprøver i opptil en måned, men blodpropp kan være et problem, spesielt når prøvene blir lagret ved høye temperaturer, noe som kan være tilfelle underfelt forhold. Det andre kritiske trinnet er forsterkning av mål sekvenser, og spesielt underfelt forhold PCR reaksjoner ofte utføre mindre godt enn under standard laboratorieforhold7. For dette formål er nøye primer design og optimalisering viktig for å oppnå robust forsterkning. I tillegg kan nestede PCR-tilnærminger og touchdown PCR, som brukes i denne protokollen, øke både spesifisitet og følsomhet for målet gen forsterkning4,7. Faktisk, i vår erfaring i Liberia og Guinea med denne teknologien nestede protokollene var nødvendig underfelt forhold med felt prøver selv for primer sett som tillot forsterkning av mål fra laboratorieprøver og under laboratorieforhold med en enkelt runde med PCR (7 og upubliserte resultater).
I motsetning til disse mer kritiske trinnene, bibliotek forberedelse og sekvensering kjøre seg selv er ganske robuste prosedyrer. Men under feltet forhold praktiske spørsmål som tilgjengeligheten av visse deler av utstyret kan være problematisk. For eksempel er en UV-spektrofotometer nødvendig for å bestemme DNA-konsentrasjoner før bibliotek utarbeidelse av Barcoded prøver. Men hvis en slik enhet ikke er tilgjengelig underfelt forhold, kan et likt volum av hvert utvalg ganske enkelt kombineres for å utgjøre 45 μL som kreves for biblioteks forberedelser, med forskjeller i prøve inn data materiale som deretter vanligvis blir dempet av det store antall leser. På samme måte kan behovet for Internett-tilkobling for sekvensering kjøre være et problem, selv om base-ringer ikke lenger må utføres på nettet, men kan gjøres lokalt; Men, denne nødvendigheten kan fjernes under visse omstendigheter av produsenten hvis nødvendig.
Oppsummert gir den presenterte protokollen relativt lave kostnader sekvensering på steder uten tilgang til tradisjonell sekvensering utstyr, inkludert i avsidesliggende steder. Det kan lett tilpasses ethvert mål RNA eller DNA, slik at forskerne å svare på mange biologiske spørsmål.

Sekvensering er et kraftig og viktig verktøy i biologisk og biomedisinsk forskning. Det tillater analyse av genomer, genetiske variasjoner, og RNA uttrykks profiler, og dermed spiller en viktig rolle i etterforskningen av menneske-og dyresykdommer alike1,2. Sanger sekvensering, en av de eldste metodene tilgjengelig for DNA-sekvensering, er fortsatt rutinemessig brukes til denne dag og har vært et hjørne-stein av molekylærbiologi. I løpet av de siste 50 årene har denne teknologien blitt forbedret for å oppnå Read-lengder på mer enn 1 000 NT og en nøyaktighet så høyt som 99,999%1. Sanger sekvensering har imidlertid også begrensninger. Sekvensering et større sett med prøver eller analyse av hele genomer med denne metoden er tidkrevende og kostbart1,3. Andre generasjons (neste generasjon) DNA-sekvensering metoder som 454 pyrosequencing og Illumina teknologi har tillatt oss å redusere kostnadene og arbeidsmengden som kreves for sekvensering i det siste tiåret, og har ført til en enorm økning i mengde biologisk sekvens informasjon tilgjengelig4. Likevel, individuelle sekvensering går ved hjelp av disse andre generasjons teknologier er dyre, og sekvensering under feltet forhold er utfordrende, som nødvendig utstyr er klumpete og skjøre (ligner på sanger sekvensering enheter), og ofte har til kalibreres og betjenes av spesielt opplært personell. Også for mange av andre generasjons teknologier lese-lengder er ganske begrenset, noe som ofte gjør nedstrøms bioinformatikk analyse av disse dataene utfordrende.
Tredje generasjons sekvensering ved hjelp av lommeformat nanopore sekvensering enheter (se tabell over materialer) kan tjene som et alternativ til disse etablerte sekvensering plattformer. I disse enhetene en enkelt-strandet DNA eller RNA molekylet passerer gjennom en nanopore samtidig med en ioniske strøm som deretter måles ved en sensor (figur 1). Som tråden går gjennom nanopore, er modulering av strømmen av nukleotider stede i pore til enhver tid oppdages, og beregningsmessig tilbake-oversettes til nukleotid sekvensen5. På grunn av dette operative prinsippet, nanopore sekvensering tillater både generering av svært lange leser (nær 1 x 106 nukleotider6) og analyse av sekvensering data i sanntid. Barcoding er mulig ved å feste definerte nukleotid sekvenser til nukleinsyre syrer i en prøve, som tillater analyse av flere prøver i en enkelt sekvensering kjøre, og dermed øke prøve gjennomstrømning og senking per prøve kostnader. På grunn av sin høye portabilitet og brukervennlighet, nanopore sekvensering enheter har blitt brukt med hell i feltet under den siste Ebola virussykdom epidemien i Vest-Afrika, fremhever deres egnethet for rask distribusjon i avsidesliggende områder7 , 8i den.
Her beskriver vi en detaljert felt kompatibel protokoll for sekvensering av mRNA-koding for Niemann-Pick C1 (NPC1)-proteinet, som er forplikte inngangs reseptor for filoviruses som ebolaviruses, og har vist å begrense Arts mottakelighet for disse virusene9,10. Protokollen omfatter ekstraksjon av hele RNA fra blodprøver, spesifikk forsterkning av NPC1 mRNA av RT-PCR, barcoding av prøver, biblioteks forberedelser og sekvenser med en nanopore sekvensering enhet. Data analyse kan ikke diskuteres på grunn av plassbegrensninger, selv om noen grunnleggende retninger er gitt i representative resultater; Imidlertid er interesserte leseren henvist til en tidligere publikasjon11 for en mer detaljert beskrivelse av arbeidsflyten vi brukte, samt til publikasjoner av andre12,13,14 for detaljert informasjon om analyseverktøyene som brukes i denne arbeidsflyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK308</td>
			<td>1D&#178; Sequencing Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1150</td>
			<td>DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt/TA ligase master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0367S</td>
			<td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-low binding reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>DNA LoBind Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase buffer and DNase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN105.24</td>
			<td>flow cell R9.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot start high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanopore sequencing device</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>MinION Mk 1B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR barcoding kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-PBC001</td>
			<td>PCR Barcoding Kit I (R9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse transcriptase master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11766050</td>
			<td>SuperScript&#8482; IV VILO&#8482; Master Mix with ezDNase&#8482; Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1151</td>
			<td>Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotating mixer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0287S</td>
			<td>LongAmp Taq 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II End-prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7546S</td>
			<td>NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>-</td>
			<td>NanoPhotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum manifold</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>S7000</td>
			<td>EZ-Vac Vacuum Manifold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing of mrna from whole blood using nanopore sequencing

Sekvensering i avsidesliggende steder og ressurs-fattige innstillinger presenterer unike utfordringer. Nanopore sekvensering kan med hell brukes under slike forhold, og ble deployert til Vest-Afrika i løpet av de siste Ebola virus epidemien, fremhever denne muligheten. I tillegg til praktiske fordeler (lavpris, enkel utstyr transport og bruk), gir denne teknologien også fundamentale fordeler i forhold til andre generasjons sekvensering tilnærminger, spesielt den svært lange lese lengde, evne til direkte sekvens Sann tids tilgjengelighet av data. Rå lese nøyaktigheten er lavere enn med andre sekvensering plattformer, som representerer den viktigste begrensningen av denne teknologien; Dette kan imidlertid delvis reduseres ved høy lese dybde generert. Her presenterer vi en felt kompatibel protokoll for sekvensering av mRNAs-kodingen for Niemann-Pick C1, som er cellulær reseptor for ebolaviruses. Denne protokollen omfatter ekstraksjon av RNA fra dyre blodprøver, etterfulgt av RT-PCR for mål berikelse, barcoding, biblioteks forberedelser og sekvensering-kjøringen, og kan enkelt tilpasses for bruk med andre DNA-eller RNA-mål.

I et representativt eksperiment for å teste den presenterte protokollen, pakket vi ut RNA-en fra 10 forskjellige blodprøver av fem dyrearter (dvs. 2 individer per Art (geit, sau, svin, hund, storfe)) (tabell 3). RNA-ytelse og kvalitet etter ekstraksjon kan variere mye, spesielt på grunn av forskjeller i prøvehåndtering og lagring. I vårt representative eksperiment observerte vi RNA-konsentrasjoner mellom 43 ng og 543 ng per μL (tabell 3). Også, etter forsterkning av RT-PCR, gel analyse av NPC-1 PCR-produkter viste ulike utfall (figur 2), med markert svakere band for prøver BC01 og BC02 (begge geit). Disse forskjellene skyldes sannsynligvis forskjeller i prøvekvaliteten, selv om forskjellene i PCR-effekten på grunn av forskjeller i primer binding til NPC1-genet av ulike arter ikke kan utelukkes. Men disse forskjellene i yield og/eller forsterkning effektivitet ikke markant påvirke den totale sekvensering utfallet. Videre skjedde det et ekstra ikke-spesifikt PCR-produkt i prøve BC10 (storfe). I motsetning til sanger sekvensering, ikke-spesifikke produkter ikke negativt påvirke resultatene av nanopore sekvensering, som disse leser er forkastet under kartlegging av de oppnådde leser til en referanse sekvens som en del av dataanalyse.
Før hver sekvensering kjøres, en kvalitetskontroll av strømningscellen som skal brukes, anbefales sterkt, med et minimumskrav på 800 total porer. I vårt representative eksperiment returnerte denne kvalitets sjekken 1 102 porene tilgjengelig for sekvensering. Siden dataene er gitt i sanntid, og kan analyseres umiddelbart, lengden på en sekvensering kjøre kan justeres for det enkelte programmet (dvs., inntil tilstrekkelig sekvensering data er produsert for den ønskede analysen). I våre eksperimenter, sekvensering kjører vanligvis utføres over natten, og i tilfelle av vår representant eksperimentet vi fikk ca 1 400 000 leser under en slik en 14 h Run.
Avhengig av hvilken type dataanalyse som skal utføres, kan det være tilrådelig å behandle bare et delsett av de oppnådde leser. Når det gjelder vårt representative eksperiment, ble et delsett av 10 000 lest valgt for videre analyse. For dette formål, fastq filer generert under sekvensering kjøre ble videre behandlet i en Ubuntu 18,04 LTS miljø, og demultiplexed bruker flexbar v 3.0.3 med parametere optimalisert for demultiplexing av nanopore sekvensering data (strekkode-tail-lengde 300 , strekkode-Error-rate 0,2, strekkode-gap-straff-1)12. Etter demultiplexing, kan lese kartlegging og konsensus generasjon deretter gjøres ved hjelp av en rekke forskjellige verktøy, men en detaljert drøfting av bioinformatikk aspekt av nanopore sekvensering går utover omfanget av dette manuskriptet. Men i tilfelle av våre representative resultater, lese kartlegging til en referanse sekvens ble utført ved hjelp geneious 10.2.3. Av 10 000 leser analysert, 5 457 viste en lengde mellom 1 750 og 2 000 nukleotider, som matcher de forventede størrelsene for PCR fragmenter forsterket som en del av vår arbeidsflyt (1 769 NT, Figur 3). En ekstra topp i lengden fordelingen av leser ble observert mellom 250 til 500 nukleotider, som kan tilskrives løs PCR produkter. Demultiplexing av leser tillot tildeling av 87,6% av leser til en av de 10 strekkoder/prøver analysert (Figur 4). Andelen demultiplexed leser for hver strekkode varierte fra 3,4% for strekkode 1 til 16,9% for strekkode 10; men på grunn av den samlede stort antall leser dette fortsatt lov meningsfull konsensus ringer med høy lese dybde selv for disse lavere overflod strekkodedata sett. Faktisk kartlegging av sorterte leser til en referanse sekvens av NPC1 resulterte i mellom 31,7% (strekkode 2) og 100% (strekkode 7 og 8) av leser kartlegging til referansen, noe som gir en lese dybde på mer enn 90 leser på enhver posisjon for hver prøve. Dette er da mer enn tilstrekkelig til å tillate trygg konsensus base-ringer med en ubetydelig feil rate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av DNA-sekvenser ved hjelp av nanopore teknologi. En enkelt-strandet DNA molekylet passerer gjennom en nanopore innebygd i en elektrisk motstandsdyktig membran, med en helicase regulere overgangen hastighet. En ioniske strøm går samtidig gjennom pore og måles kontinuerlig. Modulasjoner av strømmen forårsaket av nukleotider til stede i pore oppdages og beregningsmessig tilbake-oversettes til nukleotid sekvensen av DNA strand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig2.jpg"> Figur 2: forsterkning av PCR produkter av Niemann-Pick C1 fra mRNA. mRNA ble isolert fra geit (BC01 og 02), sau (BC03 og 04), svin (BC05 og 06), hund (BC07 og 08), og storfe (BC09 og 10). Nestede PCR produkter ble separert i en 0,8% agarose gel i 1x TAE buffer (fremstilt fra 50x TAE buffer: 242,28 g Tris base, 57,1 mL av isbre eddiksyre, 100 mL av 0,5 M EDTA, dH2O til 1 L, pH justert til 8,0) for 45 min ved 100 V og beiset med Sybr safe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig3.jpg"> Figur 3: lese lengde distribusjon av 10 000 leser fra det representative eksperimentet. Antallet leser som har fått et gitt intervall med lese lengde indikeres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59377/59377fig4.jpg"> Figur 4: fordeling av leser etter demultiplexing. Antall og prosentandel av demultiplexed (grå) og tilordnede lyder (svart) for hver strekkode vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/59377fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: oversikt over primer sett brukt. Initial forsterkning av mål sekvenser ble utført med primer sett 1. Primer sett 2 ble deretter brukt for nestede forsterkning og adapter tillegg. Adaptere er angitt med rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_1.xlsx">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tabell 2: oversikt over strekkode sekvenser. Individuelle strekkoder ble brukt til å identifisere hvert sekvensert utvalg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_2.xlsx">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tabell 3: RNA-konsentrasjoner som oppnås etter ekstraksjon fra blodprøver, i rekkefølge i det representative eksperimentet. RNA-konsentrasjonen av to individer fra hver av de fem artene vises, og proporsjonene til den optiske tettheten ved 260/280 NM og 260/230 NM indikeres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59377/table_3.xlsx">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing at JoVE.com

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sekvensering er en ny teknologi som gjør det mulig kostnadseffektiv sekvensering i avsidesliggende steder og ressurs-fattige innstillinger. Her presenterer vi en protokoll for sekvensering av mRNAs fra hele blod som er kompatibel med slike forhold.

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Tredje generasjon nanopore sekvensering er en kraftig ny sekvensering teknologi som gjør det mulig å svært enkelt få sekvensinformasjon fra et bredt utvalg av prøver. De viktigste fordelene med denne teknikken er portabiliteten til sekvenseringsenheten, den ekstremt lange leselengden og sanntidstilgjengeligheten av data. Nanopore sekvensering er en spesielt nyttig teknologi under sykdomsutbrudd på avsidesliggende steder.Det har med hell blitt brukt i feltlaboratorier under og etter Ebola virusutbrudd i Vest- og Sentral-Afrika. Via nanosporesekvensering og bruk av MinION-enheten for dette formålet er ganske enkelt, må det tas hensyn til under bibliotekforberedelse og under lasting av strømningsceller. For å starte denne prosedyren, sett opp en touchdown PCR for å forsterke cDNA med primer sett en ved hjelp av en varm start high fidelity DNA polymerase med riktig reaksjonsbuffer i en 50 mikroliter reaksjonsvolum med en mikroliter mal.Hvis mulig, sett opp reaksjonen på is eller i en kjølig blokk ved fire grader Celsius. Inkuber reaksjonen i en termocycler som beskrevet i tekstprotokollen. Etter dette overfører du 50 mikroliter av PCR-produktet til et 1,5 milliliter DNA-lavt bindende reaksjonsrør.Resuspend de magnetiske perlene grundig ved å virvle. Tilsett deretter 50 mikroliter perler til PCR-reaksjonen og bland godt. Inkuber prøven på en roterende mikser i fem minutter ved romtemperatur mens den roterer ved 15 o/min.Spinn kort ned prøven og plasser deretter røret på et magnetisk stativ for å pellet de magnetiske perlene. Vent til supernatanten er helt avklart før du fortsetter. Deretter aspirerer du overnatanten uten å forstyrre perlepelleten og kast den.Pipette 200 mikroliter på 70% etanol inn i reaksjonsrøret og inkubere i 30 sekunder ved romtemperatur. Aspirer etanol uten å forstyrre perlepellet og kast den. Gjenta denne vaskeprosessen med etanol igjen for totalt to vasker.Luft tørke pellet i ett minutt ved romtemperatur. Fjern deretter reaksjonsrøret fra magnetstativet. Resuspend pellet i 30 mikroliter kjerner fri vann og inkuber ved romtemperatur i to minutter.Plasser reaksjonsrøret tilbake på magnetstativet og vent til reaksjonsperlene er helt pelleted. Etter dette fjerner du supernatanten uten å forstyrre pelleten og overføre til et nytt 1,5 milliliter reaksjonsrør. Hvis flere prøver skal sekvenseres samtidig, kan strekkoder nå legges til av to ekstra PCR-trinn etterfulgt av DNA-opprydding som tidligere vist.Først kombinerer du like mye strekkodet DNA fra hver prøve for totalt ett mikrogram DNA i et volum på 45 mikroliter i et 0,2 milliliter reaksjonsrør. For dA-Tailing, tilsett syv mikroliter av end prep reaksjon buffer, tre mikroliter av end prep enzyme mix, og fem mikroliter kjerner av kjernefritt vann. Knips forsiktig røret for å blande.I en termocycler inkuber reaksjonen i fem minutter ved 20 grader Celsius etterfulgt av fem minutter ved 65 grader Celsius. Deretter utfører du PCR-rensing av reaksjonsproduktet som beskrevet i tekstprotokollen. Eventuelt ta en mikroliter for å kvantifisere konsentrasjonen av prøven ved hjelp av et UV-spektrofotometer.Kombiner 22,5 mikroliter av det tidligere oppnådde rensede DNA med 2,5 mikroliter 1D2-adapter og 25 mikroliter blunt/TA Ligase Master Mix i et nytt 1,5 milliliter DNA-lavt bindende reaksjonsrør. Knips forsiktig røret for å blande. Spinn kort ned blandingen og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.Utfør deretter PCR-rensing av reaksjonsproduktet som beskrevet i tekstprotokollen. Kombiner 45 mikroliter av reaksjonsproduktet med fem mikroliter strekkodeadapterblanding og 50 mikroliter Blunt/TA Ligase Master Mix i et DNA-lavtbindende reaksjonsrør. Sveip forsiktig for å blande og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur.Rens reaksjonsproduktet som beskrevet i tekstprotokollen og lagre det resulterende produktet på is eller ved fire grader Celsius til det er klart til bruk. For å begynne, utfør en kvalitetskontroll på flytcellen før bruk. For dette formål kobler du sekvenseringsenheten til vertsdatamaskinen og åpner programvaren.Sett inn en strømningscelle i sekvenseringsenheten. Velg deretter flytcelletypen fra valgboksen og klikk tilgjengelig for å bekrefte. Klikk sjekk flytcelle nederst på skjermen, og velg riktig flytcelletype.Klikk starttest for å starte kvalitetskontrollen. Minst 800 aktive nanoporer totalt er nødvendig for at strømningscellen skal kunne brukes. Først åpner du grunningsportdekselet ved å skyve det med urviseren.Sett en P1000 pipette til 200 mikroliter og sett spissen inn i grunningsporten. Juster deretter pipetten til 230 mikroliter samtidig som spissen i grunningsporten skal trekke opp 20 til 30 mikroliter buffer og fjerne eventuelle luftbobler. I et nytt 1,5 milliliter DNA lavbinding reaksjonsrør, forberede grunning blanding ved å kombinere 576 mikroliter av RBF buffer med 624 mikroliter kjerner av kjernefritt vann.Pipette 800 mikroliter forsiktig av den tilberedte grunningsblandingen i grunningsporten og vent i fem minutter. Etter dette løfter du prøveportdekselet og pipetten ytterligere 200 mikroliter av den tilberedte grunningsblandingen inn i grunningsporten. Pipette 35 mikroliter av RBF-bufferen til et nytt rent 1,5 milliliter DNA-lavt bindende reaksjonsrør.Bland LLB-perler grundig ved å pipettere og tilsett 25,5 mikroliter av perlene til RBF-bufferen. Deretter legger du til 2,5 mikroliter kjerner med kjernefritt vann og 12 mikroliter DNA-bibliotek og bland ved pipettering. Tilsett 75 mikroliter av prøveblandingen på en langsom dråpevis måte til strømningscellen via prøveporten.Sett deretter på prøveportdekselet, lukk grunningsporten og lukk lokket på sekvenseringsenheten. I programvaren bekrefter du at flytcellen fortsatt er tilgjengelig. Åpne et nytt eksperiment, og konfigurer kjøreparameterne ved å velge settet som brukes.Velg live basecalling. Start sekvenseringen ved å klikke på Start eksperiment. Fortsett sekvenseringskjøringen til tilstrekkelige eksperimentelle data samles inn.I et representativt eksperiment ekstraheres RNA fra 10 forskjellige blodprøver fra fem dyrearter. RNA-konsentrasjoner observeres mellom 43 nanogram og 543 nanogram per mikroliter. Etter forsterkning av RT-PCR viser gelanalyse av MPC1 PCR-produktene ulike resultater med markert svakere bånd for prøver BC01 og BC02.Disse forskjellene skyldes mest sannsynlig forskjeller i utvalgskvalitet, selv om forskjeller i PCR-effekt på grunn av forskjeller i primerbinding til MCP1-genet av forskjellige arter ikke kan utelukkes. Disse forskjellene i utbytte- og/eller forsterkningseffektivitet påvirker imidlertid ikke det totale sekvenseringsresultatet. En undergruppe på 10 000 oppnådde leser velges og demultiplexed for videre analyse.Av de 10 000 lesene som er analysert, viser 5, 457 en lengde mellom 1, 750 og 2000 nukleotider som samsvarer med de forventede størrelsene for PCR-fragmentene forsterket som en del av arbeidsflyten vår. En ekstra topp i lengdefordelingen av leser observeres mellom 250 og 500 nukleotider som kan tilskrives uspesifike PCR-produkter. Demultiplexing av lesinger tillater tildeling av 87,6% av lesingene til en av de 10 prøvene som er analysert.Selv om denne metoden er ganske pålitelig, under feltforhold, er PCR-forsterkningen det mest problematiske trinnet. Under våre erfaringer var nestede protokoller ofte nødvendige for å forsterke målsekvenser. I tillegg til sekvensering av dyrevertsgener, kan denne metoden også brukes til å sekvensere DNA eller RNA, inkludert virale eller bakterielle patogener.Nanopore sekvensering er derfor nå i økende grad brukt ikke bare under sykdomsutbrudd eller for vitenskapelige studier på avsidesliggende steder, men også i vanlige laboratorier hvor de lange leselengdene åpner opp spennende nye forskningsmuligheter. Selv om ingen av de brukte reagensene er spesielt farlige, bør standard god laboratoriepraksis følges. Åpenbart når sekvensering av sykdomsagenter, må alle nødvendige forholdsregler for håndtering av disse midlene observeres.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensing av High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldugg for Long-Les Sekvense

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Single-Cell RNA sekvensering og analyse av Human bukspyttkjertelen holmer

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

En fullstendig rørledning for isolere og sekvensering MicroRNAs, og analyserer seg benytter åpen kilde verktøy

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...